陳嵐蘭 莊其宏 盧 芳 羅 文

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，福建 廈門 361003)

5-氟尿嘧啶與阿司匹林聯(lián)合用藥對肺癌細(xì)胞H1299增殖和凋亡的影響及作用機(jī)制

陳嵐蘭 莊其宏 盧 芳 羅 文

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，福建 廈門 361003)

目的體外研究5-氟尿嘧啶(5-FU)與阿司匹林聯(lián)合用藥對肺癌細(xì)胞H1299增殖和凋亡的影響及作用機(jī)制。方法用四甲基唑藍(lán)比色法(MTT)檢測5-FU(終濃度5、10、20、40、80 μmol/L)、阿司匹林(終濃度125、250、500、1 000、2 000 μmol/L)單用或兩藥按1∶1比例聯(lián)用對H1299細(xì)胞增殖的抑制作用；根據(jù)中效方程式計(jì)算單獨(dú)或聯(lián)用時(shí)5-FU和阿司匹林的中效濃度(IC50)同時(shí)計(jì)算聯(lián)合指數(shù)(CI)。按照5-FU(26.1 μmol/L)和阿司匹林(948.7 μmol/L)的IC50分別單用或聯(lián)用處理H1299細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測對細(xì)胞凋亡的影響，Western印跡檢測凋亡相關(guān)的Bcl-2、Cox-2、Bax蛋白表達(dá)變化。結(jié)果5-FU、阿司匹林單獨(dú)或聯(lián)合用藥都能夠抑制細(xì)胞的增殖，細(xì)胞增殖抑制率隨著用藥濃度的提高而升高，具有劑量-效應(yīng)關(guān)系；按照5-FU、阿司匹林的IC50分別單用或聯(lián)用處理H1299細(xì)胞，與對照組相比，處理組H1299細(xì)胞凋亡率顯著升高Bcl-2和Cox-2表達(dá)顯著下調(diào)，Bax表達(dá)顯著上調(diào)(均Plt;0.01)；5-FU和阿司匹林聯(lián)合用藥時(shí)效果更為顯著。應(yīng)用中效原理計(jì)算發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用較小濃度聯(lián)用抑制效應(yīng)lt;0.6時(shí)，CIlt;1，兩藥呈協(xié)同作用，當(dāng)用較大濃度聯(lián)用時(shí)呈拮抗作用。結(jié)論5-FU與阿司匹林聯(lián)合用藥能夠抑制肺癌細(xì)胞H1299的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡的發(fā)生，在較低濃度聯(lián)用時(shí)兩藥呈協(xié)同作用，其作用機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Cox-2表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bax的表達(dá)相關(guān)。

5-氟尿嘧啶；阿司匹林；肺癌細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

約85%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌，惡性程度高且轉(zhuǎn)移快〔1〕。多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于肺癌中晚期，臨床多采用維持化療〔2〕和分子靶向治療的方法〔3〕。5-氟尿嘧啶(5-FU)是臨床上常用的抗代謝類腫瘤化療藥物〔4〕，其發(fā)揮抗腫瘤作用主要是通過干擾DNA和RNA的合成臨床上多采用5-FU與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥的方式〔5〕。阿司匹林是目前廣泛應(yīng)用的消炎藥具有解熱鎮(zhèn)痛的作用。研究表明，阿司匹林還具有抗腫瘤的作用，能抑制癌細(xì)胞的增殖〔6，7〕。目前國內(nèi)關(guān)于5-FU聯(lián)合阿司匹林對肺癌細(xì)胞影響的研究不多，本試驗(yàn)以體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞H1299為研究對象，探討5-FU聯(lián)合阿司匹林用藥對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 人肺癌細(xì)胞H1299購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，5-FU和阿司匹林購自Sigma，RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco，胎牛血清、青鏈霉素、胰蛋白酶購自杭州四季青生物有限公司，噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購自Promega公司，100 μg/ml碘化丙啶(PI)和Annexin-V-FITC購自 Sigma 公司，Bcl-2、Cox-2、Bax單克隆抗體和辣根過氧化物標(biāo)記的二抗購自美國 Abcam公司，BCA蛋白提取試劑盒購自碧云天生物科技有限公司，ECL顯色液購自Pierce公司，流式細(xì)胞儀購自 Becton-Dickinson 公司，倒置熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche公司)、全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自Thermo Labsystems公司，電泳、電轉(zhuǎn)儀購自北京六一儀器廠，凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-RAD科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 取凍存H1299細(xì)胞置于37℃恒溫水浴鍋中快速解凍，在無菌超凈臺(tái)內(nèi)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到5 ml滅菌的EP管中，加磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗、離心2次，除去凍存液中的DMSO和死細(xì)胞。用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底后按照1∶3進(jìn)行傳代。

1.3MTT法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞H1299用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。5-FU組和阿司匹林組在96孔培養(yǎng)皿中分別加入不同濃度的5-FU(終濃度5、10、20、40、80 μmol/L)和阿司匹林(終濃度125、250、500、1 000、2 000 μmol/L)；5-FU+阿司匹林聯(lián)合用藥組中2種藥物按照1∶1的比例加入；以正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。待用藥處理48 h后，每孔加入0.5% MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入DMSO 150 μl，置于搖床低速震蕩10 min充分溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定每孔OD值，分析各組細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-試驗(yàn)組細(xì)胞OD值/對照組細(xì)胞OD值)×100%。

1.45-FU和阿司匹林的聯(lián)合效應(yīng) 兩種藥物的聯(lián)合作用效果根據(jù)中效原理并采用Chou-Talalay指數(shù)法進(jìn)行評定。按照中效程式計(jì)算出兩種藥物單獨(dú)及聯(lián)合作用時(shí)的中效濃度(IC50)值：fa/fu=(D/Dm)m，取對數(shù)lg(fa/fu)=mlgDm，其fa代表藥物作用效應(yīng)，fu=1-fa，Dm代表0.5效應(yīng)時(shí)藥物的濃度，即IC50,m為斜率，按照公式D=Dm〔fa/fu〕1/m，計(jì)算達(dá)到不同抑制率時(shí)兩種藥物單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用所需的濃度，然后計(jì)算聯(lián)合指數(shù)CI=D1/Dx1+D2/Dx2+αD1D2/Dx1Dx2，D1、D2為兩種藥物聯(lián)合作用產(chǎn)生X效應(yīng)時(shí)各自所需濃度，Dx1、Dx2為兩種藥物分別單獨(dú)作用產(chǎn)生X效應(yīng)時(shí)各自所需濃度。兩種藥物聯(lián)用作用機(jī)制相同時(shí)α=1，不同時(shí)α=0；α=1時(shí)，CIlt;1則表示兩種藥物具有協(xié)同作用，CI=1則表示兩種藥物具有相加作用，CIgt;1則表示兩種藥物具有拮抗作用。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞H1299并將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/ml，接種于24孔培養(yǎng)板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。按照細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果中5-FU、阿司匹林的IC50分別單用或聯(lián)用處理H1299細(xì)胞。48 h后用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入10 μl PI和10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育20～30 min，用流式細(xì)胞儀檢測肺癌細(xì)胞H1299的凋亡情況。

1.6Western印跡檢測 細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Cox-2和Bax的表達(dá)變化。用5-FU、阿司匹林處理H1299細(xì)胞48 h后用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，離心收集細(xì)胞；依次加入300 μl裂解液和3 μl蛋白酶抑制劑，超聲波細(xì)胞粉碎儀勻漿，冰上裂解30 min，4℃、1 200 r/min離心20 min，去除上清。按照BCA蛋白提取試劑盒操作說明書提取細(xì)胞蛋白和測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合，100℃水浴變性5 min，用SDS-PAGE電泳分離后取出蛋白凝膠，將濾紙、凝膠、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、濾紙依次夾好，4℃轉(zhuǎn)膜過夜。取出PVDF膜用5% BSA封閉后PBST洗滌3次，依次與一抗、二抗孵育，ECL顯色。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.15-FU和阿司匹林單用、聯(lián)用對肺癌細(xì)胞H1299增殖的影響 單獨(dú)或聯(lián)合使用5-FU、阿司匹林對H1299 細(xì)胞的增殖都具有抑制作用，細(xì)胞增殖抑制率隨著用藥濃度的提高而升高，具有劑量-效應(yīng)關(guān)系；5-FU和阿司匹林按1∶1比例聯(lián)合用藥時(shí)對細(xì)胞的抑制率高于單獨(dú)使用用藥時(shí)。見表1。

表1 5-FU和阿司匹林單用及聯(lián)用對肺癌H1299細(xì)胞增殖的抑制率

2.25-FU和阿司匹林單用、聯(lián)用的Dm 5-FU、阿司匹林單用的Dm分別為(26.1±1.8)μmol/L和(948.7±11.6)μmol/L，m分別為0.83±0.2和0.94±0.15，r分別為0.993±0.09和0.996±0.21。聯(lián)合用藥的Dm為(386.6±5.5)μmol/L，m為0.80±0.23，r為0.912±0.16。其中5-FU為14.9 μmol/L，與單用時(shí)相比降低了42.9%；阿司匹林為371.7 μmol/L，與單用時(shí)降低了60.9%。

2.35-FU和阿司匹林聯(lián)用的效應(yīng)-指數(shù)曲線 當(dāng)fa≈0.6時(shí)，CI≈1，即5-FU和阿司匹林聯(lián)用對H1299細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)在0.6時(shí)，呈相加作用；當(dāng)用較小濃度聯(lián)用falt;0.6時(shí)，呈協(xié)同作用(CIlt;1)(fa=0.1,CI=0.776;fa=0.2,CI=0.838;fa=0.3,CI=0.883,fa=0.4,CI=0.923;fa=0.5,CI=0.962)；當(dāng)用較大濃度聯(lián)用fagt;0.6時(shí)，呈拮抗作用(CIgt;1)(fa=0.7,CI=1.05;fa=0.8,CI=1.11;fa=0.9,CI=1.2)。見圖1。

2.45-FU和阿司匹林聯(lián)用對肺癌細(xì)胞H1299凋亡的影響 與對照組(1.35%±0.15%)相比，5-FU(15.67%±0.51%)、阿司匹林單用(13.95%±1.81%)、聯(lián)用(29.36%±1.80%)都能使H1299細(xì)胞的凋亡率顯著升高(Plt;0.01)，另外5-FU與阿司匹林聯(lián)合用藥對H1299細(xì)胞的抑制作用要明顯高于單獨(dú)用藥時(shí)(Plt;0.05)。

2.55-FU和阿司匹林聯(lián)用對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比5-FU、阿司匹林單用及聯(lián)用處理H1299細(xì)胞都會(huì)誘導(dǎo)Bcl-2和Cox-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(Plt;0.05)，且5-FU與阿司匹林聯(lián)合用藥對Bcl-2、Cox-2和Bax蛋白表達(dá)的影響更為顯著(Plt;0.01)。見表2，圖2。

圖1 5-FU聯(lián)合阿司匹林聯(lián)作用于H1299細(xì)胞的效應(yīng)-聯(lián)合指數(shù)曲線

組別Bcl-2Cox-2Bax對照組1.00±0.011.19±0.030.59±0.015-FU組0.68±0.111)0.64±0.161)1.12±0.061)阿司匹林組0.73±0.051)0.52±0.091)1.53±0.121)5-FU+阿司匹林組0.41±0.132)0.33±0.092)2.19±0.082)

與對照組比較：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01

1～4：對照組、5-FU組、阿司匹林組、5-FU+阿司匹林組圖2 5-FU與阿司匹林單用、聯(lián)用對H1299細(xì)胞Bcl-2、Cox-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

目前肺癌發(fā)病率及致死率位居癌癥之首〔8〕。肺癌的最佳治療方式是手術(shù)切除，但多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)切除治療的機(jī)會(huì)，因此維持化療和分子靶向治療已成為腫瘤臨床治療中最主要的方式〔9，10〕。5-FU目前仍是治療肝癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的常用化療藥物，但是單獨(dú)使用會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的毒副作用〔11〕，在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)對正常細(xì)胞造成損害，主要是損害胃腸道和抑制骨髓造血，對心血管系統(tǒng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等也會(huì)造成損害。阿司匹林是臨床上常用于解熱、鎮(zhèn)痛的消炎藥物，臨床研究發(fā)現(xiàn)其還具有抗腫瘤作用，如在肺癌〔12〕宮頸癌〔13〕、結(jié)腸癌〔14〕等多種人類腫瘤的研究中，均發(fā)現(xiàn)阿司匹林可通過抑制癌細(xì)胞增殖同時(shí)誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡的方式預(yù)防腫瘤的發(fā)生，但是長期服用阿司匹林也會(huì)引起較強(qiáng)的副作用，如胃腸道出血或潰瘍、過敏反應(yīng)、中毒等。目前臨床上多采用聯(lián)合用藥的方式治療腫瘤，在降低藥物毒副作用的同時(shí)還可提高療效，降低癌細(xì)胞的耐藥性。已有關(guān)于5-FU與阿司匹林聯(lián)合用藥處理肝癌〔15〕和結(jié)腸癌細(xì)胞〔16〕的文獻(xiàn)報(bào)道，通過抑制癌細(xì)胞增殖取得了較好的抗腫瘤效果。另外也有許多關(guān)于5-FU或阿司匹林聯(lián)合其他抗腫瘤藥物治療腫瘤的研究，結(jié)果都取得了較好的效果，如臨床上5-FU與奧沙利鉑、葉酸鈣聯(lián)合用于胃癌晚期化療，可降低患者化療藥物不良反應(yīng)的發(fā)生〔17〕；5-FU與吉非替尼聯(lián)用可協(xié)同促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡〔18〕；在結(jié)腸癌治療的研究中發(fā)現(xiàn)5-FU與蒽貝素聯(lián)用具有協(xié)同作用〔19〕。本研究結(jié)果說明5-FU與阿司匹林聯(lián)用時(shí)，兩藥均采用較低濃度就能夠協(xié)同作用達(dá)到單藥高濃度時(shí)的抑制效果，這與兩藥聯(lián)用在抑制其他癌細(xì)胞增殖中的結(jié)果一致。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生是由一系列基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程〔20，21〕，細(xì)胞增殖與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡是生物體生長發(fā)育、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持的重要保證。Bcl-2基因家族參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，其可在線粒體途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中具有重要的作用。根據(jù)Bcl-2家族成員對細(xì)胞凋亡的作用不同可分為兩類，其中Bax、Bak、Bcl-xs、Bad屬于促細(xì)胞凋亡基因，Bcl-2、Bcl-xL、Bag-1、ccd-9等屬于抑制細(xì)胞凋亡的基因〔22，23〕。目前研究表明，Cox-2在多種腫瘤組織中表達(dá)顯著高于臨近組織，Cox-2過表達(dá)會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡〔24〕。阿司匹林可通過Cox途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，主要通過下調(diào)Cox-2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)〔25〕。本研究結(jié)果提示，5-FU與阿司匹林聯(lián)合用藥能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞H1299的增殖并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡的發(fā)生，在較低濃度時(shí)兩藥呈協(xié)同效應(yīng)，其作用機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Cox-2表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bax的表達(dá)相關(guān)。

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〔2016-09-20修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

R734.2

A

1005-9202(2017)21-5225-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.004

福建省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.2013J01326)

陳嵐蘭(1973-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事呼吸內(nèi)科疾病研究。