陳嵐蘭 莊其宏 盧 芳 羅 文

(廈門大學附屬第一醫(yī)院呼吸內科，福建 廈門 361003)

5-氟尿嘧啶與阿司匹林聯(lián)合用藥對肺癌細胞H1299增殖和凋亡的影響及作用機制

陳嵐蘭 莊其宏 盧 芳 羅 文

(廈門大學附屬第一醫(yī)院呼吸內科，福建 廈門 361003)

目的體外研究5-氟尿嘧啶(5-FU)與阿司匹林聯(lián)合用藥對肺癌細胞H1299增殖和凋亡的影響及作用機制。方法用四甲基唑藍比色法(MTT)檢測5-FU(終濃度5、10、20、40、80 μmol/L)、阿司匹林(終濃度125、250、500、1 000、2 000 μmol/L)單用或兩藥按1∶1比例聯(lián)用對H1299細胞增殖的抑制作用；根據中效方程式計算單獨或聯(lián)用時5-FU和阿司匹林的中效濃度(IC50)同時計算聯(lián)合指數(CI)。按照5-FU(26.1 μmol/L)和阿司匹林(948.7 μmol/L)的IC50分別單用或聯(lián)用處理H1299細胞，用流式細胞術檢測對細胞凋亡的影響，Western印跡檢測凋亡相關的Bcl-2、Cox-2、Bax蛋白表達變化。結果5-FU、阿司匹林單獨或聯(lián)合用藥都能夠抑制細胞的增殖，細胞增殖抑制率隨著用藥濃度的提高而升高，具有劑量-效應關系；按照5-FU、阿司匹林的IC50分別單用或聯(lián)用處理H1299細胞，與對照組相比，處理組H1299細胞凋亡率顯著升高Bcl-2和Cox-2表達顯著下調，Bax表達顯著上調(均Plt;0.01)；5-FU和阿司匹林聯(lián)合用藥時效果更為顯著。應用中效原理計算發(fā)現(xiàn)，當用較小濃度聯(lián)用抑制效應lt;0.6時，CIlt;1，兩藥呈協(xié)同作用，當用較大濃度聯(lián)用時呈拮抗作用。結論5-FU與阿司匹林聯(lián)合用藥能夠抑制肺癌細胞H1299的增殖，并促進細胞的凋亡的發(fā)生，在較低濃度聯(lián)用時兩藥呈協(xié)同作用，其作用機制可能與下調細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Cox-2表達，同時上調Bax的表達相關。

5-氟尿嘧啶；阿司匹林；肺癌細胞；細胞增殖；細胞凋亡

約85%的肺癌為非小細胞肺癌，惡性程度高且轉移快〔1〕。多數患者發(fā)現(xiàn)時已處于肺癌中晚期，臨床多采用維持化療〔2〕和分子靶向治療的方法〔3〕。5-氟尿嘧啶(5-FU)是臨床上常用的抗代謝類腫瘤化療藥物〔4〕，其發(fā)揮抗腫瘤作用主要是通過干擾DNA和RNA的合成臨床上多采用5-FU與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥的方式〔5〕。阿司匹林是目前廣泛應用的消炎藥具有解熱鎮(zhèn)痛的作用。研究表明，阿司匹林還具有抗腫瘤的作用，能抑制癌細胞的增殖〔6，7〕。目前國內關于5-FU聯(lián)合阿司匹林對肺癌細胞影響的研究不多，本試驗以體外培養(yǎng)的肺癌細胞H1299為研究對象，探討5-FU聯(lián)合阿司匹林用藥對肺癌細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1試驗材料 人肺癌細胞H1299購自中國科學院細胞庫，5-FU和阿司匹林購自Sigma，RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco，胎牛血清、青鏈霉素、胰蛋白酶購自杭州四季青生物有限公司，噻唑藍(MTT)試劑盒購自Promega公司，100 μg/ml碘化丙啶(PI)和Annexin-V-FITC購自 Sigma 公司，Bcl-2、Cox-2、Bax單克隆抗體和辣根過氧化物標記的二抗購自美國 Abcam公司，BCA蛋白提取試劑盒購自碧云天生物科技有限公司，ECL顯色液購自Pierce公司，流式細胞儀購自 Becton-Dickinson 公司，倒置熒光顯微鏡購自Olympus公司，實時熒光定量PCR儀(Roche公司)、全自動酶標儀購自Thermo Labsystems公司，電泳、電轉儀購自北京六一儀器廠，凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-RAD科技有限公司。

1.2細胞培養(yǎng) 取凍存H1299細胞置于37℃恒溫水浴鍋中快速解凍，在無菌超凈臺內將細胞轉移到5 ml滅菌的EP管中，加磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗、離心2次，除去凍存液中的DMSO和死細胞。用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞，接種到培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換一次培養(yǎng)液，待細胞長滿培養(yǎng)皿底后按照1∶3進行傳代。

1.3MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期的肺癌細胞H1299用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，將細胞濃度調整為1×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。5-FU組和阿司匹林組在96孔培養(yǎng)皿中分別加入不同濃度的5-FU(終濃度5、10、20、40、80 μmol/L)和阿司匹林(終濃度125、250、500、1 000、2 000 μmol/L)；5-FU+阿司匹林聯(lián)合用藥組中2種藥物按照1∶1的比例加入；以正常培養(yǎng)的細胞作為對照組，每組設6個復孔。待用藥處理48 h后，每孔加入0.5% MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入DMSO 150 μl，置于搖床低速震蕩10 min充分溶解結晶，用酶標儀在490 nm波長處測定每孔OD值，分析各組細胞增殖情況。細胞增殖抑制率(%)=(1-試驗組細胞OD值/對照組細胞OD值)×100%。

1.45-FU和阿司匹林的聯(lián)合效應 兩種藥物的聯(lián)合作用效果根據中效原理并采用Chou-Talalay指數法進行評定。按照中效程式計算出兩種藥物單獨及聯(lián)合作用時的中效濃度(IC50)值：fa/fu=(D/Dm)m，取對數lg(fa/fu)=mlgDm，其fa代表藥物作用效應，fu=1-fa，Dm代表0.5效應時藥物的濃度，即IC50,m為斜率，按照公式D=Dm〔fa/fu〕1/m，計算達到不同抑制率時兩種藥物單獨及聯(lián)合應用所需的濃度，然后計算聯(lián)合指數CI=D1/Dx1+D2/Dx2+αD1D2/Dx1Dx2，D1、D2為兩種藥物聯(lián)合作用產生X效應時各自所需濃度，Dx1、Dx2為兩種藥物分別單獨作用產生X效應時各自所需濃度。兩種藥物聯(lián)用作用機制相同時α=1，不同時α=0；α=1時，CIlt;1則表示兩種藥物具有協(xié)同作用，CI=1則表示兩種藥物具有相加作用，CIgt;1則表示兩種藥物具有拮抗作用。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期的肺癌細胞H1299并將細胞濃度調整為1×105/ml，接種于24孔培養(yǎng)板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。按照細胞增殖試驗結果中5-FU、阿司匹林的IC50分別單用或聯(lián)用處理H1299細胞。48 h后用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化、收集細胞，加入500 μl結合緩沖液重懸細胞，分別加入10 μl PI和10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育20～30 min，用流式細胞儀檢測肺癌細胞H1299的凋亡情況。

1.6Western印跡檢測 細胞內凋亡相關蛋白Bcl-2、Cox-2和Bax的表達變化。用5-FU、阿司匹林處理H1299細胞48 h后用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，PBS洗滌細胞3次，離心收集細胞；依次加入300 μl裂解液和3 μl蛋白酶抑制劑，超聲波細胞粉碎儀勻漿，冰上裂解30 min，4℃、1 200 r/min離心20 min，去除上清。按照BCA蛋白提取試劑盒操作說明書提取細胞蛋白和測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合，100℃水浴變性5 min，用SDS-PAGE電泳分離后取出蛋白凝膠，將濾紙、凝膠、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、濾紙依次夾好，4℃轉膜過夜。取出PVDF膜用5% BSA封閉后PBST洗滌3次，依次與一抗、二抗孵育，ECL顯色。

1.7統(tǒng)計學分析 應用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.15-FU和阿司匹林單用、聯(lián)用對肺癌細胞H1299增殖的影響 單獨或聯(lián)合使用5-FU、阿司匹林對H1299 細胞的增殖都具有抑制作用，細胞增殖抑制率隨著用藥濃度的提高而升高，具有劑量-效應關系；5-FU和阿司匹林按1∶1比例聯(lián)合用藥時對細胞的抑制率高于單獨使用用藥時。見表1。

表1 5-FU和阿司匹林單用及聯(lián)用對肺癌H1299細胞增殖的抑制率

2.25-FU和阿司匹林單用、聯(lián)用的Dm 5-FU、阿司匹林單用的Dm分別為(26.1±1.8)μmol/L和(948.7±11.6)μmol/L，m分別為0.83±0.2和0.94±0.15，r分別為0.993±0.09和0.996±0.21。聯(lián)合用藥的Dm為(386.6±5.5)μmol/L，m為0.80±0.23，r為0.912±0.16。其中5-FU為14.9 μmol/L，與單用時相比降低了42.9%；阿司匹林為371.7 μmol/L，與單用時降低了60.9%。

2.35-FU和阿司匹林聯(lián)用的效應-指數曲線 當fa≈0.6時，CI≈1，即5-FU和阿司匹林聯(lián)用對H1299細胞的增殖抑制效應在0.6時，呈相加作用；當用較小濃度聯(lián)用falt;0.6時，呈協(xié)同作用(CIlt;1)(fa=0.1,CI=0.776;fa=0.2,CI=0.838;fa=0.3,CI=0.883,fa=0.4,CI=0.923;fa=0.5,CI=0.962)；當用較大濃度聯(lián)用fagt;0.6時，呈拮抗作用(CIgt;1)(fa=0.7,CI=1.05;fa=0.8,CI=1.11;fa=0.9,CI=1.2)。見圖1。

2.45-FU和阿司匹林聯(lián)用對肺癌細胞H1299凋亡的影響 與對照組(1.35%±0.15%)相比，5-FU(15.67%±0.51%)、阿司匹林單用(13.95%±1.81%)、聯(lián)用(29.36%±1.80%)都能使H1299細胞的凋亡率顯著升高(Plt;0.01)，另外5-FU與阿司匹林聯(lián)合用藥對H1299細胞的抑制作用要明顯高于單獨用藥時(Plt;0.05)。

2.55-FU和阿司匹林聯(lián)用對凋亡相關蛋白表達的影響 與對照組相比5-FU、阿司匹林單用及聯(lián)用處理H1299細胞都會誘導Bcl-2和Cox-2蛋白表達顯著下調，Bax蛋白表達顯著上調(Plt;0.05)，且5-FU與阿司匹林聯(lián)合用藥對Bcl-2、Cox-2和Bax蛋白表達的影響更為顯著(Plt;0.01)。見表2，圖2。

圖1 5-FU聯(lián)合阿司匹林聯(lián)作用于H1299細胞的效應-聯(lián)合指數曲線

組別Bcl-2Cox-2Bax對照組1.00±0.011.19±0.030.59±0.015-FU組0.68±0.111)0.64±0.161)1.12±0.061)阿司匹林組0.73±0.051)0.52±0.091)1.53±0.121)5-FU+阿司匹林組0.41±0.132)0.33±0.092)2.19±0.082)

與對照組比較：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01

1～4：對照組、5-FU組、阿司匹林組、5-FU+阿司匹林組圖2 5-FU與阿司匹林單用、聯(lián)用對H1299細胞Bcl-2、Cox-2、Bax蛋白表達的影響

3 討 論

目前肺癌發(fā)病率及致死率位居癌癥之首〔8〕。肺癌的最佳治療方式是手術切除，但多數患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，失去了手術切除治療的機會，因此維持化療和分子靶向治療已成為腫瘤臨床治療中最主要的方式〔9，10〕。5-FU目前仍是治療肝癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的常用化療藥物，但是單獨使用會產生較強的毒副作用〔11〕，在殺死癌細胞的同時也會對正常細胞造成損害，主要是損害胃腸道和抑制骨髓造血，對心血管系統(tǒng)中樞神經系統(tǒng)等也會造成損害。阿司匹林是臨床上常用于解熱、鎮(zhèn)痛的消炎藥物，臨床研究發(fā)現(xiàn)其還具有抗腫瘤作用，如在肺癌〔12〕宮頸癌〔13〕、結腸癌〔14〕等多種人類腫瘤的研究中，均發(fā)現(xiàn)阿司匹林可通過抑制癌細胞增殖同時誘導癌細胞的凋亡的方式預防腫瘤的發(fā)生，但是長期服用阿司匹林也會引起較強的副作用，如胃腸道出血或潰瘍、過敏反應、中毒等。目前臨床上多采用聯(lián)合用藥的方式治療腫瘤，在降低藥物毒副作用的同時還可提高療效，降低癌細胞的耐藥性。已有關于5-FU與阿司匹林聯(lián)合用藥處理肝癌〔15〕和結腸癌細胞〔16〕的文獻報道，通過抑制癌細胞增殖取得了較好的抗腫瘤效果。另外也有許多關于5-FU或阿司匹林聯(lián)合其他抗腫瘤藥物治療腫瘤的研究，結果都取得了較好的效果，如臨床上5-FU與奧沙利鉑、葉酸鈣聯(lián)合用于胃癌晚期化療，可降低患者化療藥物不良反應的發(fā)生〔17〕；5-FU與吉非替尼聯(lián)用可協(xié)同促進肺癌細胞的凋亡〔18〕；在結腸癌治療的研究中發(fā)現(xiàn)5-FU與蒽貝素聯(lián)用具有協(xié)同作用〔19〕。本研究結果說明5-FU與阿司匹林聯(lián)用時，兩藥均采用較低濃度就能夠協(xié)同作用達到單藥高濃度時的抑制效果，這與兩藥聯(lián)用在抑制其他癌細胞增殖中的結果一致。

細胞凋亡的發(fā)生是由一系列基因調控的細胞主動死亡過程〔20，21〕，細胞增殖與凋亡的動態(tài)平衡是生物體生長發(fā)育、結構穩(wěn)定、內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持的重要保證。Bcl-2基因家族參與調節(jié)細胞凋亡，其可在線粒體途徑誘導的細胞凋亡中具有重要的作用。根據Bcl-2家族成員對細胞凋亡的作用不同可分為兩類，其中Bax、Bak、Bcl-xs、Bad屬于促細胞凋亡基因，Bcl-2、Bcl-xL、Bag-1、ccd-9等屬于抑制細胞凋亡的基因〔22，23〕。目前研究表明，Cox-2在多種腫瘤組織中表達顯著高于臨近組織，Cox-2過表達會抑制腫瘤細胞凋亡〔24〕。阿司匹林可通過Cox途徑誘導細胞凋亡，主要通過下調Cox-2的表達來實現(xiàn)〔25〕。本研究結果提示，5-FU與阿司匹林聯(lián)合用藥能夠顯著抑制肺癌細胞H1299的增殖并促進細胞的凋亡的發(fā)生，在較低濃度時兩藥呈協(xié)同效應，其作用機制可能與下調細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Cox-2表達，同時上調Bax的表達相關。

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〔2016-09-20修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

R734.2

A

1005-9202(2017)21-5225-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.004

福建省自然科學基金面上項目(No.2013J01326)

陳嵐蘭(1973-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事呼吸內科疾病研究。