常 潔 夏中元 羅興均

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，湖北 武漢 430200)

丹皮酚對心肌缺血再灌注損傷大鼠模型腫瘤壞死因子-α和Toll樣受體4表達(dá)的影響

常 潔 夏中元 羅興均1

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，湖北 武漢 430200)

目的探討丹皮酚對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)中腫瘤壞死因子(TNF)-α及Toll樣受體(TLR)4 表達(dá)的影響。方法清潔級(jí)成年雄性SD大鼠36只隨機(jī)分為假手術(shù)組、 缺血再灌注組、 丹皮酚低劑量組和丹皮酚高劑量組每組9只；通過結(jié)扎左冠脈前降支30 min 再灌注2 h建立大鼠心肌缺血再灌注模型。通過TTC 染色法檢測大鼠梗死心肌體積；ELISA法檢測血液中TNF-α的含量；通過免疫組化法檢測缺血壞死心肌組織 TLR4 的表達(dá)。結(jié)果與缺血再灌注組相比，丹皮酚低劑量組和丹皮酚高劑量組心肌梗死體積減小，TNF-α表達(dá)減少;心肌組織 TLR4 水平明顯降低; 其中丹皮酚高劑量組更明顯。結(jié)論丹皮酚能夠明顯降低大鼠心肌缺血再灌注損傷，這種作用可能與減輕缺血再灌注中大鼠心肌TNF-α及TLR4表達(dá)有關(guān)。

丹皮酚；心肌缺血再灌注損傷；Toll樣受體4；腫瘤壞死因子-α

心肌缺血再灌注損傷(MI/RI)可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡、梗死范圍擴(kuò)大加重，甚至出現(xiàn)不可逆的損傷，進(jìn)一步造成心功能的損害并影響AMI患者的預(yù)后〔1〕。MI/RI的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前公認(rèn)的機(jī)制有氧自由基、鈣超載、炎癥介質(zhì)等〔2〕。Toll樣受體(TLR)4是一種天然免疫受體，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中尤為重要。丹皮酚是中藥牡丹皮和徐長卿或全草的主要活性成分〔3〕。PA味苦、辛，呈白色針狀結(jié)晶，微溶于水，因此可以能隨水蒸氣揮發(fā)，可溶于乙醚、丙酮、乙醇、苯、氯仿、和二硫化碳〔4〕。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚作為一個(gè)多靶點(diǎn)藥物，其藥效溫和持久、具有半衰期短、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，有鎮(zhèn)靜催眠、解熱、抗炎、抗過敏、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用，因此應(yīng)用前景廣泛。新近研究證實(shí)丹皮酚還具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡及心血管系統(tǒng)保護(hù)作用，尤其在心血管方面的藥理作用越來越受到重視，有抗動(dòng)脈粥樣硬化〔5，6〕、抗心肌缺血〔7～9〕、降血脂〔10〕、抗心律失?！?1，12〕、抗高血壓〔13〕等作用。楊正生等〔14〕通過研究證實(shí)PA通過拮抗鈣心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載、延遲后去極、降低自由基活性等途徑發(fā)揮抗心律失常作用。張衛(wèi)國等〔7〕證實(shí)丹皮酚能在心肌缺血再灌注損傷中減少心肌細(xì)胞游離脂肪酸含量，降低線粒體膜的膽固醇/磷脂，改善Ca2+-ATP酶活性并且增強(qiáng)線粒體膜脂的流動(dòng)性；Nizamutdinova等〔8〕證實(shí)丹皮酚能在心肌缺血再灌注損傷中減輕梗死心肌面積并降低心肌凋亡而發(fā)揮改善MI/RI的作用；在心肌凋亡方面，丹皮酚可通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)及下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，干預(yù)并減少心肌細(xì)胞凋亡〔15〕。翟昌林等〔16〕觀察到丹皮酚能夠明顯降低心肌缺血組織高遷移率族蛋白(HMG)B1的表達(dá)，表明PA對MI/RI的保護(hù)作用及減少其梗死面積是通過降低缺血梗死心肌組織中HMGB1的表達(dá)、抑制炎癥因子路徑實(shí)現(xiàn)的。本研究通過觀察不同劑量丹皮酚對MI/RI中大鼠TLR4及TNF-α表達(dá)的影響，為臨床防治MI/RI提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對象及分組 清潔級(jí)SD雄性大鼠36只，4～6月齡，體重220～280 g，武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組9只：①假手術(shù)組：模型建立時(shí)只穿線不結(jié)扎；②缺血再灌注組：造模成功后120 min立即處死大鼠，采血以及收集心臟標(biāo)本并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。③丹皮酚低劑量組：術(shù)前給予丹皮酚腹腔注射，劑量為15 mg·kg-1·d-1，造模成功后將小鼠處死，采血以及收集心臟標(biāo)本，對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析和檢測；④丹皮酚高劑量組：術(shù)前給予小鼠丹皮酚注射，劑量為15 mg·kg-1·d-1，構(gòu)建了心肌缺血再灌注損傷模型后進(jìn)行采學(xué)并且收集樣本。

1.2主要試劑和儀器 武漢博士德生物有限公司生產(chǎn)的ELISA檢測盒，浙江大學(xué)動(dòng)物儀器廠生產(chǎn)的動(dòng)物呼吸機(jī)，英國Abcam公司的TLR4兔多克隆抗體，山東魯南制藥廠的水合氯醛，浙江省華東醫(yī)藥股份公司的TTC試劑，MET-TLER公司的千分之一天平，日本Hitachi CF-5型低溫高速離心機(jī)以及OLYMPUS顯微鏡。

1.3大鼠缺血再灌注模型的制備 按參考文獻(xiàn)〔17〕的方法改進(jìn)，采用冠脈結(jié)扎法建立MI/RI模型。取SD大鼠，術(shù)前12 h禁食不禁水，腹腔內(nèi)注射濃度為10%的水合氯醛，將大鼠仰位固定，四肢連接十二導(dǎo)聯(lián)心電圖機(jī)，將頸部分離氣管后插入氣管插管，并且使用呼吸機(jī)保持小動(dòng)物的呼吸順暢(呼吸頻率60次/min，潮氣量2 ml/100 g)；在胸骨左側(cè)第三肋間隙進(jìn)行分離，分別在第3、4肋上環(huán)繞1根1號(hào)手術(shù)線，此時(shí)牽拉手術(shù)線讓肋骨得以撐開，沿著縱膈的方向?qū)⑿陌ぜ糸_，隨后將心臟暴露，沿左心耳下緣2～3 mm處用4-0帶線縫合針穿過，進(jìn)針深度約0.1 cm，將一段直徑1.5 mm的乳膠管放置于結(jié)扎線下，此時(shí)收緊結(jié)扎線造成心肌缺血阻斷冠狀動(dòng)脈的血流，隨后半個(gè)小時(shí)之后松開結(jié)扎線進(jìn)行2 h的血液灌注形成缺血再灌注損傷模型，使用心電圖來分析模型構(gòu)建的成功性，心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高或QRS波增高、增寬；松開后心臟ST段抬高超過1/2且出現(xiàn)了明顯波動(dòng)異常的R波伴隨心律失常和病理性的Q波變化，即缺血再灌注損傷。

1.4梗死心肌TTC染色 于心肌缺血再灌注120 min后立即結(jié)扎冠脈，在頸動(dòng)脈注射1%伊文思藍(lán)1 ml。待大鼠鞏膜藍(lán)染后迅速取下心臟，用PBS緩沖液沖洗干凈，剔除右心室、心房心肌組織，保留左心室，濾紙吸干，在-20℃的冰箱中冷存20 min。將心臟沿著心尖部分切片，將藍(lán)染部分和未藍(lán)染部分分別稱為危險(xiǎn)區(qū)和梗死區(qū)，染色后梗死區(qū)域呈現(xiàn)為灰白色，計(jì)算梗死面積的范圍(IS/AAR%)以梗死心肌占缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌重量的百分比表示。

1.5ELISA法檢測血液中TNF-α的表達(dá) 再灌注120 min后采血，之后在離心機(jī)上以2 000 r/min離心20 min后，取其上清液于EP管-20℃保存以備檢測。針對小鼠實(shí)施雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，嚴(yán)格按照大鼠TNF-α ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.6免疫組化檢測TLR4蛋白表達(dá) 每組隨機(jī)選取5只大鼠，采用免疫組化SABC法，DAB棕黃色反應(yīng)呈色。在光學(xué)顯微鏡下觀察，心肌細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色均質(zhì)顆粒為陽性。采用顯微圖像采集系統(tǒng)對免疫組化進(jìn)行切片處理，并且放置在5個(gè)高倍顯微鏡下進(jìn)行觀察，分析陽性細(xì)胞染色的平均積分光密度值，將TLR4值的蛋白含量和光密度值進(jìn)行比對，蛋白含量越高，平均積分光密度的含量越高。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件組間比較行單因素分析，兩組間進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠心肌梗死體積比較 丹皮酚低劑量組和丹皮酚高劑量組心肌梗死體積較缺血再灌注組明顯降低(Plt;0.01)。其中，丹皮酚低劑量組和丹皮酚高劑量組之間亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)。見表1。

2.2各組大鼠血液中TNF-α表達(dá) 與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組中TNF-α的表達(dá)明顯增強(qiáng)，丹皮酚低劑量組和丹皮酚高劑量組明顯低于缺血再灌注組，丹皮酚高劑量組TLR4表達(dá)低于丹皮酚低劑量組(均Plt;0.05)。見表1。

2.3各組大鼠心肌壞死區(qū)組織TLR4表達(dá) 與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組中TLR4的表達(dá)明顯增強(qiáng)，丹皮酚低劑量組和丹皮酚高劑量組明顯低于缺血再灌注組(Plt;0.05)，且丹皮酚高劑量組TLR4表達(dá)低于丹皮酚低劑量組(均Plt;0.05)。見表1。

表1 各組心肌梗死體積、血液TNF-α水平及心肌壞死區(qū)組織TLR4表達(dá)比較

與缺血再灌注組比較：1)Plt;0.01，2)Plt;0.05

3 討 論

心血管疾病，尤其急性心肌梗死是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，血運(yùn)重建對于挽救患者的壞死心肌和生命有重要意義；但再灌注自身能夠引起多項(xiàng)心肌變化，會(huì)對最終的治療結(jié)果產(chǎn)生影響，導(dǎo)致缺血性心肌損害的出現(xiàn)，從而導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞死亡，從而誘發(fā)進(jìn)一步的損傷，對患者的預(yù)后產(chǎn)生一定的損害效果。缺血性再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎性反應(yīng)、鈣超載、氧自由基等都在發(fā)病環(huán)節(jié)起到了一定的作用，也是當(dāng)前公認(rèn)的病發(fā)機(jī)制，尤其是炎癥反應(yīng)更是MI/RI的重要誘發(fā)病因之一。隨著炎癥性反應(yīng)的出現(xiàn)，大量的氧自由基和細(xì)胞因子出現(xiàn)，導(dǎo)致了血管通透性增加和水腫。近些年來，學(xué)者們在對果蠅進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)了TLR家族，這是一種細(xì)胞跨膜受體，作為一類重要的蛋白質(zhì)分子參與了非特異性免疫，為特異性免疫與非特異性免疫間的橋梁，目前，在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)11個(gè)TIRs家族成員，而人的TLRs家族基因定位分別是定(TLR1，2，3，6，10)4號(hào)染色體，9號(hào)染色體(TLR4)，1號(hào)染色體(TLR5)，3號(hào)染色體(TLR9)，x號(hào)染色體(TLR7，8)。其家族中尤其是TLR4是動(dòng)物界中率先被發(fā)現(xiàn)的TLRs，TLRs在獲得性免疫中的具有識(shí)別作用。在免疫應(yīng)答和信號(hào)轉(zhuǎn)移等過程中都發(fā)揮出了重要的作用。大量的研究結(jié)果也證實(shí)了在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展和疾病轉(zhuǎn)歸過程中TLR4發(fā)揮出了重要的作用，是誘發(fā)缺血性再灌注損傷的重要因素之一〔18～20〕。在疾病的發(fā)展過程中，TLRs活化了IRAK-1和MyD88等途徑，從而導(dǎo)致了NF-κB活化，導(dǎo)致了一系列的炎性反應(yīng)和核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，最終出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)〔21～23〕。在心肌缺血再灌注損傷中，前期研究結(jié)果證實(shí)TLR4在MI/RI中作為主要炎性介質(zhì)發(fā)揮重要作用并可通過藥物干預(yù)降低TLR4釋放來減輕心肌缺血再灌注損傷帶來的心肌損害的〔24，25〕。本研究結(jié)果顯示丹皮酚在缺血性再灌注損傷過程中具備保護(hù)性的作用，這也符合Nizamutdinova等〔8〕的研究結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，丹皮酚對于降低MI/RI過程中的TLR4表達(dá)有一定的作用，高劑量組的效果更加明顯。由此可見，可以使用丹皮酚實(shí)現(xiàn)降低心肌細(xì)胞梗死的目的，從而降低TNF-α的表達(dá)并保護(hù)缺血性心臟組織。由此可見，丹皮酚對于降低心臟組織中的TLR4及TNF-α表達(dá)有重要意義，可以明顯改善心肌缺血性再灌注損傷的狀況，改善心肌功能。

1楊靖冬，崔 偉，高冠群，等.有關(guān)缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展〔J〕.大眾科技，2013；15(5)：139-42.

2Maczewki M，Beresewicz A，Schwartz M，etal.The role of endothelin，protein kinase C and radicals in the mechanism of the postischemic endothelial dysfunction in guinea pig hearts〔J〕.Mol Cardiol，2000；32(2)：297-310.

3段曉穎，高衛(wèi)芳，周淑娟，等.牡丹皮中丹皮酚的提取工藝研究〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009；7(2)：41-2.

4張榮發(fā).丹皮酚的研究進(jìn)展〔J〕.中國醫(yī)藥指南，2008；6(18)：110-1.

5Li YJ，Bao JX，Xu JW，etal.Vascular dilation by paeonol-a mechanism study〔J〕.Vasc Pharmacol，2010；53(34)：169-76.

6孫慧萍，曹軍平，徐 麗，等.丹皮酚對動(dòng)脈粥樣硬化大鼠CRP的影響〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2014；12(8)：991-2.

7張衛(wèi)國，張志善.丹皮酚對大鼠心肌缺血再灌注損傷的線粒體膜脂的保護(hù)作用〔J〕.中草藥，1994；25(4)：193-4.

8Nizamutdinova IT，Jin YC，Kim JS，etal.Paeonol and paeoniflorin，the main active principles of Paeonia albiflora，protect the heart from myocardial ischemia reperfusion injury in rats〔J〕.Planta Med，2008；74(1)：14-8.

9李 潔，王林洪，田 華，等.丹皮酚對缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究進(jìn)展〔J〕.河北聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2014；3(16)：178-9.

10董玉紅，張淑芹，董世超，等.丹皮酚對高脂血癥大鼠降血脂及血管保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014；7 (13)：1132-4.

11Ma YL，Bates S，Gurney AM.The effects of paeonol on the electrophysiological properties of cardiac ventricular myocytes〔J〕.Eur J Pharmacol，2006；545(23)：87-92.

12張金花，熊永愛.丹皮酚對大鼠缺血性心律失常及其心肌細(xì)胞 miRNA-1 表達(dá)的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015；21(5)：129-32.

13張金艷，趙 樂，李貽奎，等.丹皮酚對自發(fā)性高血壓大鼠動(dòng)脈血壓和血流量的影響及其與血管舒縮相關(guān)的作用機(jī)制〔J〕.中國中藥雜志，2015；12(40)：4903-7.

14楊正生，彭振輝，姚青海，等.丹皮酚的藥理作用研究進(jìn)展〔J〕.中國藥物與臨床，2011；5(12)：545-7.

15陸建洪，翟昌林，陳 捷.丹皮酚對大鼠缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡及其 Bcl-2 和 Bax 表達(dá)的影響〔J〕.中國中醫(yī)藥科技，2013；19(2)：151-2.

16翟昌林，黎 莉，張 運(yùn).丹皮酚對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)中 HMGB1 表達(dá)的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012；30(10)：2284-5.

17Ahmed LA，Salem HA，Attia AS，etal.Pharmacological preconditioning with nicorandil and pioglitazone attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury in rats〔J〕.Eur J Pharmacol，2011；663(1-3)：51-8.

18Shimamoto A，Chong AJ，Yada M，etal.Inhibition of toll-like receptor 4 with eritoran attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury〔J〕.Circulation，2006;114：1270-4.

19Zeuke S，Ulmer AJ，Kusumoto S，etal.TLR4-mediated inammatory activation of human coronary artery endothelial cells by LPS〔J〕.Cardiovasc Res,2002;56(1)：126-34.

20Nemoto S，Vallejo JG，Knuefermann P，etal.Escherichia coli LPS-induced LV dysfunction：role of toll-like receptor-4 in the adult heart〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002;282：H2316-23.

21Brown M，McGuinness M，Wright T，etal.Cardiac-specific blockade of NF-kappaB in cardiac pathophysiology：differences between acute and chronic stimuli in vivo〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005;289：H466-76.

22廖新學(xué)，李 欣，馬中富，等.核轉(zhuǎn)錄因子-κB在急性心肌梗死血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用〔J〕.中華危重急救醫(yī)學(xué)，2008;20(3)：413-5.

23Moss NC，Tang RH，Willis M，etal.Inhibitory kappa B kinase-beta is a target for specific nuclear factor kappa B-mediated delayed cardioprotec-tion〔J〕.J Thorac Cardiovasc Surg，2008;136：1274-9.

24Yang J，Yang J，Ding JW，etal.Sequential expression of TLR4 and its effects on the myocardium of rats with myocardial ischemia-reperfusion injury〔J〕.Inflammation，2008;31(2)：304-12.

25Yang J，Zhang XD，Yang J，etal. The cardioprotective effect of fuvastatin on ischemic injury via down-regulation of toll-like receptor 4〔J〕.Mol Biol Rep，2000；32(2)：297-310.

〔2017-01-30修回〕

(編輯 徐 杰)

EffectofpaeonolonexpressionofTNF-αandTLR4inmyocardiumischemia-reperfusioninjuryinrats

CHANGJie,XIAZhong-Yuan,LUOXing-Jun.

DepartmentofAesthesiology,WuhanUniversityPeople′sHospital,Wuhan430060,Hubei,China

ObjectiveTo investigate the effect of paeonol (PA)on the expression of TNF-α and TLR4 in myocardium ischemia(MI)-reperfusion injury (RI) in rats.MethodsA total of 36 male SD rats were randomly divided into sham, ischemia reperfusion (IR), low-dose PA and high-dose PA groups, 9 rats in each group. And the rat MI/RI model was established by coronary artery ligation for 30 min followed by 120 min reperfusion. The myocardium infarction was measured by TTC staining. Blood TNF-α was detected by ELISA. The expression of TLR4 in ischemic myocardium was detected via immuno-histochemistry.ResultsCompared with IR group, myocardial infarction and the expression of TNF-α and TLR4 were reduced in low- and high-dose PA groups, the effects of high-dose PA were more obvious.ConclusionsPA could significantly reduce myocardial ischemia-reperfusion injury in rats, which may be related to reduce the expression of TNF-α and the expression of TLR4 in myocardium of ischemia-reperfusion rats.

Paeonol; Myocardial ischemia-reperfusion injury; Toll-like receptor 4; Tumor necrosis factor-α

R54

A

1005-9202(2017)21-5222-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.003

國家自然科學(xué)基金(81201460)

1 十堰市人民醫(yī)院麻醉科

夏中元(1966-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事圍術(shù)期臟器保護(hù)研究。

常 潔(1985-)，女，碩士在讀，主治醫(yī)師，主要從事圍術(shù)期心肌保護(hù)研究。