蘇 健 徐 冰 王 婧 劉學政

(錦州醫(yī)科大學人體解剖學教研室，遼寧 錦州 121001)

·基礎(chǔ)研究·

血紅素氧合酶-1對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用

蘇 健 徐 冰1王 婧1劉學政

(錦州醫(yī)科大學人體解剖學教研室，遼寧 錦州 121001)

目的探討血紅素氧合酶(HO)-1對糖尿病(DM)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)保護作用及其機制。方法清潔級雄性SD大鼠24只中8只為對照組，余16只腹腔注射鏈脲佐菌素制作DM大鼠模型，將血糖濃度大于16.7 mmol/L的大鼠定為DM模型，隨機分為DM組8只，另外8只腹腔注射HO-1特異性誘導劑正鐵血紅素為實驗組，對照組及DM組腹腔注射等劑量生理鹽水。12 w后，HE染色觀察RGC密度，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛(MDA)含量，氮藍四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，免疫組化染色和Western印跡法檢測視網(wǎng)膜HO-1、Caspase-3表達情況。結(jié)果與對照組相比，DM組RGC密度顯著降低(Plt;0.01)，而實驗組無明顯變化(Pgt;0.05)。與對照組相比，DM組MDA含量明顯升高、SOD活性明顯降低(Plt;0.01)，而實驗組無明顯變化(Pgt;0.05)。HO-1在對照組僅微量表達于內(nèi)核層，DM組陽性表達在節(jié)細胞層及內(nèi)核層有所增加，而實驗組陽性染色顯著增加，特別是節(jié)細胞層。Caspase-3在對照組視網(wǎng)膜幾乎無表達，而DM組陽性表達顯著增多，主要分布于節(jié)細胞層及內(nèi)核層，實驗組與DM組相比陽性表達有所減弱。與對照組相比，HO-1在DM組及實驗組蛋白表達量均增加(Plt;0.01)，且實驗組增加更明顯(Plt;0.05)；與對照組相比，Caspase-3在DM組蛋白表達顯著增加(Plt;0.01)，而實驗組無明顯變化。結(jié)論通過正鐵血紅素誘導HO-1在視網(wǎng)膜的高表達，下調(diào)了DM大鼠視網(wǎng)膜Caspase-3的表達，抑制了氧化應激，恢復了視網(wǎng)膜RGC密度；提示HO-1可能對DM大鼠RGC具有保護作用。

糖尿病視網(wǎng)膜病變；血紅素氧合酶-1；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞；Caspase-3

糖尿病(DM)視網(wǎng)膜病變(DR)發(fā)病率逐年升高，研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡和功能障礙是視力降低的重要因素〔1〕。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)軸突是構(gòu)成視神經(jīng)的主體，RGC受損甚至凋亡是DR的重要機制之一〔2〕。血紅素氧合酶(HO)-1是一種抗氧化酶，可以通過將血紅素分解為膽綠素、一氧化碳(CO)等代謝產(chǎn)物發(fā)揮強大的抗氧化、抗凋亡等作用被廣泛應用于眼科疾病的研究〔3〕。利用鈷原卟啉(CoPP，一種強有力的HO-1誘導劑)處理視神經(jīng)受壓的小鼠，可以使因軸突損傷導致的RGC密度增加〔4〕。在鏈脲佐菌素(STZ)誘導的DM大鼠中，HO-1能夠減緩RGC的進一步損害，但具體機制不清〔5〕。本研究擬探討HO-1對DM大鼠RGC的保護作用及其機制。

1 資料與方法

1.1實驗動物和主要試劑、儀器 24只清潔級雄性SD大鼠購自錦州醫(yī)科大學實驗動物中心，體質(zhì)量200～240 g。STZ及正鐵血紅素購自美國Sigma公司；HO-1、Caspase-3抗體購自Abcam公司；Western印跡二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。免疫組織化學試劑盒、HE染色試劑盒、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒均購自中國武漢博士德生物工程有限公司。主要儀器為美國強生公司血糖儀，日本Olympus公司熒光倒置顯微鏡，德國SLEE公司冰凍切片機，美國Azure凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂垂直電泳儀，中國賽默飛酶標儀。

1.2實驗動物分組及模型的制備 大鼠隨機分成對照組、DM組、實驗組各8只。DM組及實驗組禁食水12 h后，按55 mg/kg腹腔一次性注射1.5%STZ(0.1 mol/L、pH4.5的檸檬酸緩沖液配制)，72 h后采尾靜脈血測血糖，血糖濃度gt;16.7 mmol/L的大鼠定為DM模型。對照組給予等劑量檸檬酸緩沖液。DM模型制備完成后，實驗組給予HO-1特異性誘導劑正鐵血紅素，腹腔注射劑量為20 mg/kg，1次/d，對照組、DM組給予等劑量生理鹽水，連續(xù)注射12 w。

1.3樣本制備 12 w后，每組取4只，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)將大鼠麻醉。打開大鼠胸腔，先用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)將血液沖洗干凈，再用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌流固定。固定后用眼科剪取出眼球(1只用于HE染色，1只用于免疫組化)于多聚甲醛固定液中，4℃保存?zhèn)溆谩Ａ砣?只水合氯醛深度麻醉，取雙側(cè)眼球，解剖顯微鏡下分離視網(wǎng)膜(冰上操作)置于1.5 ml離心管中，稱重后加入中效蛋白裂解液，冰上剪碎，4℃離心機30 min后取上清，-20℃保存?zhèn)溆?，用于Western印跡及MDA含量及SOD活性檢測。

1.4RGC密度檢測 視網(wǎng)膜HE染色，將固定于多聚甲醛中眼球取出后放入20%蔗糖溶液4℃過夜脫水至眼球沉底。冰凍切片機沿冠狀面切片，厚度為12 μm。切片以 PBS 漂洗3 min×3 次，蘇木素染色4 min，自來水沖洗2 min×3次，PBS 洗3 min×3次，1%鹽酸乙醇浸泡2 s，自來水沖洗2 min×3次，伊紅浸染切片2 min，以 PBS 洗3 min×3次。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，倒置顯微鏡觀察，每張切片取3個視野。

1.5免疫組織化學檢測大鼠視網(wǎng)膜HO-1、Caspase-3表達 冰凍切片置于PBS中洗5 min×3 次，30%H2O2室溫30 min，蒸餾水洗5 min×2次，10%山羊血清室溫20 min，甩去多余液體，不洗，切片滴加一抗(HO-1，1∶400；Caspase-3，1∶500)，4℃濕盒過夜。PBS洗10 min×3次，滴加生物素標記的二抗，室溫2 h。PBS洗10 min×3次，加親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)室溫30 min，PBS洗10 min×4次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，鏡下控制反應時間，蘇木素輕度復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，倒置顯微鏡觀察。

1.6Western印跡檢測大鼠視網(wǎng)膜HO-1、Caspase-3表達 二辛可酸(BCA)法測蛋白濃度并制樣。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)入聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(兔抗大鼠HO-1、 Caspase-3，均為1∶10 000 和兔抗大鼠β-actin，1∶2 500)，在4℃冰箱震蕩過夜，Tween-20 Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗10 min×3次，加入二抗(用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，1∶5 000)室溫震蕩2 h。TBST洗10 min×3次。Western印跡試劑盒顯色，以β-actin為內(nèi)對照，檢測HO-1、Caspase-3蛋白相對表達量。

1.7MDA含量及SOD活性檢測 用4℃生理鹽水制備5%的視網(wǎng)膜勻漿，5 000 r/min離心 15 min，取上清，MDA的檢測采用硫代巴比妥酸法；SOD活性檢測應用氮藍四唑光化還原法。按試劑盒的步驟進行，根據(jù)公式分別計算視網(wǎng)膜組織上清的MDA含量及SOD活性。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，組間比較采用SNK檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組MDA含量及SOD活結(jié)果 對照組、DM組及實驗組MDA含量分別為(3.65± 0.49)、(7.50± 0.39)、(4.66±0.08)nmol/mg，3組有統(tǒng)計學差異(F=89.21，Plt;0.01)。與對照組相比，DM組MDA含量明顯升高(Plt;0.01)，而實驗組無明顯變化(Pgt;0.05)。對照組、DM組及實驗組SOD活性分別為(85.31± 0.29)、(45.69± 0.60)、(84.88± 0.05)U/mg。3組有統(tǒng)計學差異(F=10 572.91，Plt;0.01)。與對照組相比，DM組SOD活性明顯降低(Plt;0.01)，而實驗組無明顯變化(Pgt;0.05)。

2.2各組RGC密度比較 對照組、DM組及實驗組RGC密度分別為(462.67±23.63)、(350.00±19.31)、(465.33±23.67)mm-2，3組有統(tǒng)計學差異(F=26.15，Plt;0.01)。與對照組相比，DM組RGC密度明顯降低(Plt;0.01)，而實驗組無明顯變化(Pgt;0.05)。見圖1。

圖1 3組視網(wǎng)膜RGC密度HE染色(箭頭示RGC，×400)

2.3各組HO-1、Caspase-3在視網(wǎng)膜的表達 HO-1在對照組僅微量表達于內(nèi)核層(INL)，DM組陽性表達在神經(jīng)節(jié)細胞層(GCL)及INL有所增加，而實驗組陽性染色顯著增加，特別是GCL。Caspase-3在對照組視網(wǎng)膜幾乎無表達，而DM組陽性表達顯著增多，主要分布于GCL及INL，實驗組與DM組相比陽性表達有所減弱。見圖2。

2.4各組HO-1、Caspase-3蛋白表達 對照組、DM組、實驗組HO-1蛋白相對表達量分別為(4.58±0.02)%、(8.32±0.13)%、(15.45±0.32)%，3組有統(tǒng)計學差異(F=2 277.78,Plt;0.01)。與對照組相比，DM組及實驗組蛋白表達量均顯著增加(Plt;0.01)，且實驗組增加更顯著(Plt;0.05)。對照組、DM組、實驗組Caspase-3蛋白的相對表達量分別為(1.60±0.32)%、(7.19± 0.05)%、(1.88±0.22)%，3組有統(tǒng)計學差異(F=589.52,Plt;0.01)；與對照組相比，DM組蛋白表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.01)，而實驗組無明顯變化(Pgt;0.05)。見圖3。

圖2 免疫組織化學檢測HO-1及Caspase-3在各組視網(wǎng)膜的表達(箭頭示陽性表達，×400)

圖3 Western印跡檢測3組HO-1、Caspase-3蛋白相對表達量

3 討 論

DR全球患病率不斷攀升，成為世界上成年人失明的主要原因〔6〕。RGC軸突構(gòu)成視神經(jīng)，為視覺傳導通路的樞紐〔7〕。研究表明，RGC在DR早期凋亡增加，其數(shù)量的變化對DR的發(fā)生發(fā)展具有重要影響〔8〕。

HO作為血紅素分解的限速酶，共有3種亞型，HO-1、 HO-2 和 HO-3。目前研究最多的是HO-1，其在眼的視網(wǎng)膜、晶狀體廣泛分布，可被自身反應底物hemin所誘導，與細胞抗氧化應激損傷關(guān)系密切〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)，正鐵血紅素誘導DM視網(wǎng)膜高表達HO-1可以通過抗炎、抗凋亡和抗增殖作用從而保護RGC〔10〕。國內(nèi)文獻也證實，HO-1因其具有抗氧化、抗凋亡作用而對DM大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細胞具有保護作用〔11〕。但對RGC的保護作用及其機制尚不完全清楚。本研究提示DR時高血糖可能誘發(fā)DM大鼠視網(wǎng)膜氧化應激損傷，從而導致抗氧化蛋白HO-1的增加；HO-1表達的上調(diào)可能對RGC起到了一定的保護作用。

近年來，氧化應激損傷在RGC凋亡中的作用越來越受到關(guān)注〔12,13〕。氧化應激是指體內(nèi)自由基生成過多，氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，從而導致組織細胞損傷。MDA 是自由基脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物，SOD是自由基清除劑。MDA含量升高，SOD活性降低，可間接反映組織細胞氧化應激程度〔14〕。Caspase-3是細胞凋亡的主要執(zhí)行者，是細胞凋亡的一個特異性標志物，在RGC凋亡時表達上調(diào)〔15〕。本文結(jié)果提示DM時視網(wǎng)膜處于氧化應激狀態(tài)，Caspase-3參與了視網(wǎng)膜細胞凋亡過程。HO-1可能通過降低視網(wǎng)膜氧化應激水平，抑制了RGC凋亡，從而使受損凋亡的RGC恢復。

綜上，通過正鐵血紅素誘導HO-1在視網(wǎng)膜高表達，下調(diào)了DM大鼠視網(wǎng)膜Caspase-3的表達，抑制了氧化應激，恢復了RGC密度，提示HO-1可能對DM大鼠RGC具有保護作用。但因DR發(fā)病機制復雜，HO-1對DR的影響還有待探討。

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〔2016-03-19修回〕

(編輯 苑云杰)

Protectiveeffectofhemeoxygenase-1onretinalganglioncellsindiabeticrats

SUJian,XUBing,WANGJing,etal.

AnatomyTeachingandResearchSection,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121001,Liaoning,China

ObjectiveTo investigate the protective effect and its mechanism of heme oxygenase(HO)-1 on retinal ganglion cells (RGC) in diabetic rats.Methods24 clean grade male SD rats, including 8 rats served as control group, the other 16 rats were given intraperitoneal injection of streptozotocin to establish diabetic rats model. The rats with blood glucose concentrationgt;16.7 mmol/L as diabetic models were randomly divided into 2 groups: 8 ones as diabetic group, another 8 intraperitoneal injection of HO-1 specific inducer of panhematin (hemin) as experimental group, control group and diabetes group were given intraperitoneal injection of saline. After 12 weeks, the RGC density was observed by HE staining. MDA content was detected by thiobarbituric acid. SOD activity was detected by Photoreduction of nitrogen blue four triazole. The expressions of retinal HO-1 and Caspase-3 were detected by immunohistochemical staining and Western blot.ResultsCompared with the control group, the RGC density in diabetic group was significantly decreased (Plt;0.01), but there was no significant change in experimental group (Pgt;0.05). Compared with control group, content of MDA increased and activity of SOD decreased significantly in diabetic group (allPlt;0.01), but there was no obvious change in experimental group (allPgt;0.05). The trace HO-1 expressed in the kernel layer in control group, positive HO-1 expression increased in ganglion cell layer and kernel layer in diabetes group, while the experimental group positive staining increased significantly, especially in ganglion cell layer. The expression of Caspase-3 in control group was almost saw, but the positive expression of Caspase-3 increased significantly in diabetes group, mainly distributed in ganglion cell layer and inner nuclear layer, and the positive expression of Caspase-3 in experimental group was weakened compared with that of diabetic group. Compared with control group, the expression of HO-1 protein in diabetic group and experimental group were obviously increased (Plt;0.01), especially experimental group. Compared to control group, the expression of Caspase-3 protein was significantly increased in diabetic group (Plt;0.01), while the experimental group had no obvious change.ConclusionsThe high expression of HO-1 in the retina induced by hemin could down regulate the expression of Caspase-3 in the retina of diabetic rats, inhibit oxidative stress and restore the retinal RGC density. HO-1 may protect RGC of diabetic rats.

Diabetic retinopathy; Heme oxygenase-1; Retinal ganglion cells; Caspase-3

R587.1

A

1005-9202(2017)21-5217-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.001

國家自然科學基金資助項目(No.81571383)

1 錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院檢驗科

劉學政(1962-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事糖尿病視網(wǎng)膜病變研究。

蘇 健(1970-)，男，碩士在讀，主治醫(yī)師，主要從事糖尿病視網(wǎng)膜病變研究。