段建利， 楊志剛

(武漢大學(xué) 藥學(xué)院， 湖北 武漢 430071)

辣椒素酯合成實(shí)驗(yàn)

段建利， 楊志剛

(武漢大學(xué) 藥學(xué)院， 湖北 武漢 430071)

以6-溴己酸為起始原料，利用Wittig反應(yīng)，制備以Z-8-甲基- 6-壬烯酸為主的產(chǎn)物，然后在NaNO2—HNO3的作用下，轉(zhuǎn)化為以E-8-甲基- 6-壬烯酸為主的產(chǎn)物，經(jīng)后處理得到E-8-甲基-6-壬烯酸。在酶催化作用下，E-8-甲基-6-壬烯酸選擇性地與香草醛的醇羥基反應(yīng)，得到辣椒素酯。實(shí)驗(yàn)過(guò)程讓學(xué)生靈活應(yīng)用知識(shí)、科學(xué)組合，更加貼近真實(shí)的藥物研發(fā)過(guò)程，提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。

辣椒素酯； Wittig反應(yīng)；酶催化

1 辣椒素酯

辣椒素酯類(lèi)化合物是來(lái)源于辣椒屬植物的一類(lèi)化合物，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是不飽和脂肪酸通過(guò)酯鍵與香草醇的醇羥基連接。1989年，Yazawa等人發(fā)現(xiàn)，一種名為CH-19 Sweet的無(wú)辣味的辣椒品種中，僅含有少量的辣椒素類(lèi)化合物，但含有大量的辣椒素類(lèi)似物(capsaicinoid-like substances, CLS)，根據(jù)Rf值的差異，將TLC上2個(gè)主要的斑點(diǎn)暫時(shí)命名為CLS-A和CLS-B。Yazawa等人猜測(cè)辣椒素類(lèi)似物可能是辣椒素類(lèi)化合物生物合成過(guò)程中的前體化合物[1]。1998年，Kobata等人從CLS-A中分離得到香草醇，從CLS-B中分離得到2個(gè)化合物，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，將這2個(gè)化合物命名為辣椒素酯(capsiate)和二氫辣椒素酯(dihydrocapsiate)，并且用化學(xué)方法合成二氫辣椒素酯[2]。1999年，Kobata等人從CH-19 Sweet中分離得到另一種辣椒素酯類(lèi)化合物，命名為降二氫辣椒素酯(nordihydrocapsiate)[3]。自然界中天然存在的辣椒素酯類(lèi)化合物主要是辣椒素酯，雖然辣椒素酯來(lái)源于辣椒屬植物，但并沒(méi)有辛辣味，所以其藥理活性受到廣泛關(guān)注。圖1為辣椒素酯類(lèi)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，圖中1、2、3為編號(hào)。

圖1 辣椒素酯類(lèi)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

已有文獻(xiàn)報(bào)道，辣椒素酯類(lèi)化合物具有抗氧化作用[4]、TRPV1 受體激活作用[5]、葡萄糖代謝增強(qiáng)作用[6]、抗腫瘤作用[7]、抗炎作用[8]、黏膜保護(hù)作用[9]、減肥作用[10-12]等藥理活性。辣椒素酯的藥理研究主要集中在減肥作用。因?yàn)樾乱淮鷾p肥藥的辣椒堿在臨床研究階段呈現(xiàn)顯著的劑量依賴(lài)關(guān)系，并因其自身辛辣味的制約，使人無(wú)法接受而遭到失敗。因此，與辣椒堿具有相同藥理用但不具有辛辣味的辣椒素酯在減肥中的應(yīng)用受到研究人員的關(guān)注。

文獻(xiàn)報(bào)道的辣椒素酯的合成方法主要有以下幾種：(1)利用wittig反應(yīng)制備順式不飽和脂肪酸，然后進(jìn)行烯烴的順?lè)崔D(zhuǎn)化，得到反式不飽和脂肪酸，再進(jìn)一步與香草醇反應(yīng)，得到辣椒素酯[13-14]；(2)辣椒堿在酸性條件下發(fā)生醇解，得到不飽和脂肪酸甲酯，然后在脂肪酶的催化作用下，與香草醇反應(yīng)制備辣椒素酯[15-16]；(3)以香草醛為起始原料，經(jīng)酚羥基保護(hù)和還原后得到酚羥基帶有保護(hù)基的香草醇，進(jìn)一步與反式不飽和脂肪酸反應(yīng)，再脫保護(hù)，得到辣椒素酯[17]。

Wittig反應(yīng)(見(jiàn)圖2)是合成化學(xué)中非常有價(jià)值的一種合成方法，常用于從醛、酮直接合成烯烴。非穩(wěn)定型的磷葉立德是一種強(qiáng)親核試劑，能在溫和條件下迅速與醛、酮反應(yīng)，產(chǎn)物一般以順式烯烴為主，并含有少量反式烯烴。圖2中4—10為編號(hào)。

圖2 Wittig反應(yīng)機(jī)理

酶催化與化學(xué)催化相比，具有高效性、專(zhuān)一性、溫和性等特點(diǎn)，而且反應(yīng)過(guò)程中使用的溶劑量較少，酶可以回收使用，在工業(yè)中應(yīng)用非常廣泛。

因此，本實(shí)驗(yàn)利用Wittig反應(yīng)制備辣椒素酯的不飽和脂肪酸部分，然后利用脂肪酶催化香草醇和不飽和脂肪酸的反應(yīng)得到辣椒素酯。

2 實(shí)驗(yàn)原理

辣椒素酯的合成路線見(jiàn)圖3(圖中11—14和1為編號(hào))。

圖3 辣椒素酯合成路線

本實(shí)驗(yàn)以6-溴己酸為起始原料，與三苯基膦反應(yīng)，制得Wittig反應(yīng)所需的磷葉立得；然后在叔丁醇鉀的作用下與異丁醛反應(yīng)，形成以Z-8 -甲基-6-壬烯酸為主的產(chǎn)物，再經(jīng)過(guò)烯烴的順?lè)崔D(zhuǎn)化，得到E-8-甲基-6-壬烯酸；最后在酶的催化作用下，E-8-甲基-6-壬烯酸選擇性地與香草醇的醇羥基反應(yīng)，得到辣椒素酯。

3 儀器和試劑

儀器：電磁加熱攪拌器(C-MAG HS 7，IKA?)，液相色譜HPLC儀(LC-20AD，日本島津)，AV400(Bruker公司)核磁共振儀。

試劑：6-溴己酸，三苯基膦，乙腈，乙酸乙酯，石油醚，無(wú)水硫酸鎂，N,N-二甲基甲酰胺，叔丁醇鉀，異丁醛，鹽酸，氯化鈉，亞硝酸鈉，硝酸，環(huán)己胺，氯仿，香草醇，Novozym435，均為分析純。色譜級(jí)乙腈和三氟乙酸。

4 液相色譜儀檢測(cè)條件

液相色譜儀：島津SPD-20AD，色譜柱：月旭Polar-RP極性色譜柱(4.6×250 mm 2 μm)，流動(dòng)相：乙腈：0.1%三氟乙酸水溶液(體積比為60∶40)，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，樣品運(yùn)行時(shí)間為30 min。定量方法：面積歸一化法。

5 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

5.1 5-羧基戊基-三苯基溴化磷(圖3中12)的合成

25 mL反應(yīng)瓶中依次加入6-溴己酸(5.00 g，25.6 mmol)，三苯基膦(6.71 g，25.6 mmol)，乙腈(12 mL)，加熱至回流，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后停止反應(yīng)；反應(yīng)液冷卻至室溫，過(guò)濾，干燥，得到產(chǎn)物9.78 g，收率83.6%。產(chǎn)物不經(jīng)處理，直接用于下步反應(yīng)。

5.2 Z-8-甲基-6-壬烯酸(圖3中13)的合成

100 mL反應(yīng)瓶中依次加入5-羧基戊基-三苯基溴化磷(9.00 g，19.7 mmol)，N,N-二甲基甲酰胺(30 mL)，降溫至-20 ℃；將叔丁醇鉀(4.42 g，39.5 mmol)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(30 mL)中，滴加至上述反應(yīng)液中，滴畢后保溫反應(yīng)1 h，再升至室溫反應(yīng)2 h，反應(yīng)體系再次降溫至-20 ℃，滴加異丁醛(2.13 g，29.6 mmol)，滴畢后升至室溫反應(yīng)；反應(yīng)完畢后，稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3，乙酸乙酯(30 mL×2)萃取，合并有機(jī)相；有機(jī)相水洗，干燥，濃縮，得到粗品11.2 g；粗品用石油醚洗滌，過(guò)濾。所得濾液經(jīng)快速過(guò)柱純化，得到產(chǎn)物1.70 g，收率50.9%。

核磁共振氫譜1H-NMR(CDCl3)，化學(xué)位移δ：0.92(s，3H，CH3)，0.94(s，3H，CH3)，1.39(m，2H，CH2)，1.64(m，2H，CH2)，2.04(m，2H，CH2)，2.35(m，2H，CH2)，2.58(m，1H，CH)，5.20(m，2H，CHCH)。

5.3 E-8-甲基-6-壬烯酸(圖3中14)的合成

5 mL反應(yīng)瓶中加入Z- 8 -甲基- 6-壬烯酸(1.30 g，7.6 mmol)，降溫至0 ℃；向上述反應(yīng)瓶中依次加入2 mol/L亞硝酸鈉溶液(0.8 mL)、6 mol/L硝酸溶液(0.5 mL)，滴畢后升至70 ℃，保溫反應(yīng)4 h;然后降至室溫，加水稀釋?zhuān)燃淄檩腿?次，合并有機(jī)相；有機(jī)相水洗，干燥，過(guò)濾，濾液旋干后經(jīng)快速柱層析純化，得到E-8-甲基-6-壬烯酸粗品1.00 g，收率76.9%。

將E-8-甲基-6-壬烯酸粗品(0.80 g，4.7 mmol)溶于二氯甲烷中，滴加乙二胺-二氯甲烷溶液，濃縮，稀鹽酸酸化，得到E-8-甲基-6-壬烯酸0.30 g，收率37.5%。

HPLC純度98%。1H-NMR(CDCl3)，δ：0.94(s，3H，CH3)，0.95(s，3H，CH3)，1.39(m，2H，CH2)，1.62(m，2H，CH2)，1.98(m，2H，CH2)，2.21(m，1H，CH)，2.34(m，2H，CH2)，5.34(m，2H，CHCH)。

5.4 辣椒素酯(圖1中的1)的合成

5 mL反應(yīng)瓶中依次加入香草醇(0.17 g，1.1 mmol)，E-8-甲基- 6-壬烯酸(0.20 g，1.2 mmol)，Novozym435(0.02 g)，加熱至50 ℃反應(yīng)2 h;降至室溫，加入石油醚，過(guò)濾，濾液經(jīng)快速柱層析純化，得到產(chǎn)物0.18 g，收率53.5%。

HPLC純度93%。1H-NMR(CDCl3)，δ：0.93(s，3H，CH3)，0.95(s，3H，CH3)，1.37(m，2H，CH2)，1.62(m，2H，CH2)，1.95(m，2H，CH2)，2.19(m，1H，CH)，2.32(m，2H，CH2),3.89 (s，3H，OCH3)，5.02(s，2H，ArCH2)，5.33(m，2H，CHCH),6.86(s，1H，ArH)，6.88(s，2H，ArH)。

6 教學(xué)要求

(1) 預(yù)習(xí)要求：查閱參考文獻(xiàn)，了解辣椒素酯的藥理作用及其化學(xué)合成方法，了解Wittig反應(yīng)過(guò)程中的注意事項(xiàng)，了解酶催化在藥物合成中的應(yīng)用，熟悉液相色譜儀的原理和操作方法。

(2) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果要求：利用Wittig反應(yīng)獲取Z- 8 -甲基- 6-壬烯酸，并順利完成烯烴的順?lè)崔D(zhuǎn)化，得到E- 8 -甲基- 6-壬烯酸，最終完成辣椒素酯的化學(xué)合成；根據(jù)液相色譜儀檢測(cè)結(jié)果，用面積歸一化法給出相關(guān)產(chǎn)物的液相檢測(cè)結(jié)果；根據(jù)核磁結(jié)果，正確解析核磁譜圖。

7 結(jié)語(yǔ)

如何將課堂上學(xué)到的知識(shí)靈活運(yùn)用、科學(xué)組合，提高合成效率，優(yōu)化合成路線，是藥學(xué)專(zhuān)業(yè)學(xué)生所必須面對(duì)的一個(gè)實(shí)際問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)將藥物合成中經(jīng)典的Wittig反應(yīng)和酶催化相結(jié)合，完成辣椒素酯的化學(xué)合成。同時(shí)，通過(guò)液相色譜儀對(duì)中間體和辣椒素酯進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到控制產(chǎn)品質(zhì)量的目標(biāo)。此外，利用核磁譜圖對(duì)中間體和辣椒素酯進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和分析。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程更加貼近真實(shí)的藥物研發(fā)過(guò)程，提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，讓學(xué)生對(duì)藥物的研發(fā)過(guò)程有了一個(gè)初步的認(rèn)識(shí)和了解。

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Experiment of synthesis of capsiate

Duan Jianli, Yang Zhigang

(School of Pharmacy, Wuhan University, Wuhan 430071, China)

By taking the 6-bromo acid as the starting material and by using the Wittig reaction, the product with the Z-8-methyl-6-azelaic acid as the main content is prepared. Then, under the action of NaNO2—HNO3, it is transformed into the product with E-8-methyl-6-azelaic acid as its main content, and after the treatment, the E-8-methyl-6-azelaic acid is obtained. Under the action of enzyme catalysis, the capsiate is obtained by the alcohol hydroxyl reaction of the E-8-methyl-6-azelaic acid and the vanillin. The experimental process allows the students to flexibly apply the knowledge, and make the scientific combination, which is closer to the real drug Ramp;D process, and improves the students’ interest in learning.

capsiate； Wittig reaction; enzyme catalysis

10.16791/j.cnki.sjg.2017.11.016

O6-33；TQ464.4

A

1002-4956(2017)11-0058-03

2017-05-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21402144)；武漢大學(xué)教學(xué)研究項(xiàng)目(2017JG056)

段建利(1979—)，男，湖北隨州，博士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事有機(jī)化學(xué)和藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué).