劉尚杰，鄭 洲，陸國(guó)永，喬 杰，章躍陵

（汕頭大學(xué)理學(xué)院生物學(xué)系，廣東省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515063）

人血紅蛋白凝集活性的研究

劉尚杰，鄭 洲，陸國(guó)永，喬 杰，章躍陵

（汕頭大學(xué)理學(xué)院生物學(xué)系，廣東省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515063）

目前研究證實(shí)，人血紅蛋白不僅具有輸氧功能，而且具有酚氧化酶活性、抑菌活性等非特異性免疫學(xué)活性.本課題運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)人血紅蛋白與凝集素進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示人血紅蛋白α、β亞基與人、牛、大鼠、家鼠、非洲爪蟾、斑馬魚凝集素均存在同源區(qū)域，同源性大小為20%～46.7%.進(jìn)而采用玻片凝集法與糖抑制實(shí)驗(yàn)探索人血紅蛋白的凝集活性，結(jié)果表明人血紅蛋白對(duì)副溶血弧菌等6種細(xì)菌均存在明顯的凝集活性，其凝集比活為3.9～15.6 mg/L，且α-D-葡萄糖、麥芽糖、α-D-乳糖、D-半乳糖、D-山梨糖、D-木糖和N-乙酰神經(jīng)氨酸可以部分或全部抑制人血紅蛋白的細(xì)菌凝集活性.由此說明，人血紅蛋白確實(shí)具有凝集活性，所獲研究結(jié)果為進(jìn)一步探索人血紅蛋白的免疫學(xué)活性及其作用機(jī)理奠定了良好的基礎(chǔ).

血紅蛋白；凝集素；凝集活性；糖抑制

0 引言

血紅蛋白（hemoglobin，Hb）是脊椎動(dòng)物和部分無脊椎動(dòng)物中的一種含鐵呼吸蛋白[1-4]，其由血紅素（heme）與珠蛋白（globin）結(jié)合而成，其中血紅素分子是一個(gè)具有卟啉結(jié)構(gòu)的小分子，珠蛋白由二條α鏈（141個(gè)氨基酸）和二條β肽鏈（146個(gè)氨基酸）組成，分子量為68 000 Da，呈四面體、緊密的球狀結(jié)構(gòu).目前研究發(fā)現(xiàn)，其除具有運(yùn)輸氧氣的功能外，還具有穩(wěn)定血壓、運(yùn)輸硫化物、調(diào)節(jié)酸堿平衡等多種生物學(xué)功能[5-8].有趣的是，最近人們證實(shí)血紅蛋白還具有酚氧化酶活性、抑菌活性等多種免疫學(xué)活性[4，6-8].尤其值得一提的是，本課題組最近研究發(fā)現(xiàn)存在于甲殼動(dòng)物中的呼吸蛋白——血藍(lán)蛋白具有凝集活性[9].由此提示，人紅細(xì)胞可能同樣具有凝集活性.為此，積極探索人血紅蛋白的細(xì)菌凝集活性，對(duì)豐富人血紅蛋白非特異性免疫學(xué)活性及其作用機(jī)制具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康人血由志愿者提供；副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶藻酸弧菌（Vibrio alginolyticus）、河弧菌（Vibrio fluvialis）、金黃色葡萄球菌（Stphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli K12）、乙型鏈球菌（beta streptococcus）為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種.

葡聚糖凝膠Sephadex G-100為Pharmacia公司產(chǎn)品，β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）、丙烯酰胺（Acrylamide）、雙丙烯酰胺（Bis-acrylamide）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、考馬斯亮藍(lán)G-250（Coomassie brilliant blue G-250）、氯化鈣（CaCl2）、α-D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-山梨糖、蔗糖、麥芽糖、α-D-乳糖、甘露醇和N-乙酰神經(jīng)氨酸等試劑購(gòu)于上海Sangon生物工程有限公司，無水乙醇、甲醇、冰乙酸、濃硫酸等試劑購(gòu)于汕頭西隴化工有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人血紅蛋白與凝集素的同源性分析

人血紅蛋白與凝集素蛋白質(zhì)序列搜索依據(jù)NCBI服務(wù)器Search the conserved domain database（rpsblast）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi），選擇protein blast中的blastp（protein-protein BLAST）（http//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）服務(wù)器進(jìn)行.

1.2.2 人血紅蛋白的純化

按臧家濤、周勃等[10-11]報(bào)道的方法進(jìn)行，簡(jiǎn)要流程如下：取新鮮血液，2 000 r/min離心10 min，去上清，紅細(xì)胞用預(yù)冷生理鹽水洗滌3遍，除去血漿、白細(xì)胞和血小板.將洗滌后紅細(xì)胞加2倍體積純水，置4℃冰箱過夜，使其自然溶脹破碎.將低滲溶脹破碎的紅細(xì)胞溶液于4℃，12 000 r/min離心30 min，取上清.繼而取上清2 mL，加入Sephadex G-100分子篩層析柱，20 mmol/L pH 7.5磷酸鹽緩沖液洗脫，流速2.4 mL/min，用自動(dòng)部分收集器按每管1.5 mL收集，Bradford法測(cè)定蛋白濃度，-20℃保存?zhèn)溆?

1.2.3 SDS-PAGE電泳

取適量純化人血紅蛋白與2×SDS凝膠加樣緩沖液等體積混合，采用5%濃縮膠、15%分離膠按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳、固定、染色與拍照.

1.2.4 細(xì)菌懸液的制備

按章躍陵等報(bào)道的方法進(jìn)行[9]，分別用肉湯培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基培養(yǎng)副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、河弧菌、乙型鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌K12，取其培養(yǎng)物室溫12 000 r/min離心1 min，生理鹽水洗滌3次，用TBS-Ca2+（50 mmol/L Tris.HCl，0.75% NaCl，50 mmol/L CaCl2，pH 7.2）制備細(xì)菌懸液（1×108CFU/mL）.

1.2.5 凝集實(shí)驗(yàn)

按章躍陵等所報(bào)道的玻片凝集法進(jìn)行[9]，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組2組，其中，對(duì)照組以TBS-Ca2+代替人血紅蛋白，實(shí)驗(yàn)組用TBS-Ca2+將血紅蛋白進(jìn)行2倍梯度稀釋.各取10 μL滴加在潔凈的載玻片上，并分別在其上滴加等量待測(cè)細(xì)菌懸液，輕輕搖動(dòng)1 min，置37℃30 min，顯微鏡觀察細(xì)菌凝集狀態(tài)并拍照.以各樣品發(fā)生凝集反應(yīng)的最高稀釋度為凝集效價(jià)，樣品蛋白含量與凝集效價(jià)的比值為凝集比活（mg/L）.

1.2.6 糖抑制實(shí)驗(yàn)

按章躍陵等報(bào)道的方法進(jìn)行[9]，分別選取9種糖（α-D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-山梨糖、蔗糖、麥芽糖、α-D-乳糖、甘露醇和N-乙酰神經(jīng)氨酸）依次配成4種濃度梯度的溶液（25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L）.取人血紅蛋白和糖溶液各10 μL于載玻片上輕輕震蕩混勻1 min，加入待測(cè)細(xì)菌懸液并混勻，置37℃30 min，顯微鏡下觀察結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 人血紅蛋白與凝集素同源性分析

為了探索人血紅蛋白是否具有凝集活性，采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST軟件Standard protein-protein Blast和DNAstar軟件，對(duì)人血紅蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的比對(duì)和同源性分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人血紅蛋白α、β亞基分別與人、牛、大鼠、家鼠、非洲爪蟾和斑馬魚等6種凝集素存在保守同源區(qū)域，同源性大小為20%～46.7%（圖1）.由此提示，人血紅蛋白可能同樣具有凝集活性.

2.2 人血紅蛋白的純化與鑒定

由圖2可知，Sephadex G-100純化人血紅蛋白，SDS-PAGE表現(xiàn)為分子質(zhì)量約為14.4 kDa的2條帶，與既往報(bào)道人血紅蛋白β、α亞基分子量大小相符.推測(cè)該兩條帶應(yīng)為人血紅蛋白的β、α亞基，說明所純化蛋白確實(shí)為人血紅蛋白.

圖1 人血紅蛋白與凝集素的氨基酸序列保守區(qū)域比較和同源性分析

圖2 Sephadex G-100純化的人血紅蛋白SDS-PAGE分析

2.3 人血紅蛋白細(xì)菌凝集活性分析

選取副溶血弧菌等6種細(xì)菌探索人血紅蛋白的細(xì)菌凝集活性，結(jié)果如表1和圖3、4所示，人血紅蛋白與6種細(xì)菌均能發(fā)生凝集反應(yīng)，其凝集比活為3.9～15.6 mg·L-1，其中對(duì)大腸桿菌K12和金黃色葡萄球菌的凝集活性最強(qiáng)，對(duì)河弧菌和溶藻酸弧菌的凝集活性最弱，前者是后者的4倍.

表1 人血紅蛋白凝集活性分析（37℃）

圖3 人血紅蛋白（0.5 mg/mL）對(duì)金黃色葡萄球菌凝集反應(yīng)圖（400×）

圖4 1:64人血紅蛋白（0.5 mg/mL）對(duì)不同細(xì)菌凝集反應(yīng)圖（400×）

2.4 人血紅蛋白凝集活性糖抑制分析

選取9種糖考察人血紅蛋白細(xì)菌凝集活性的影響因素，結(jié)果如表2和圖5所示，α-D-葡萄糖、麥芽糖、α-D-乳糖、D-半乳糖、D-山梨糖、D-木糖和N-乙酰神經(jīng)氨酸可以部分或全部抑制人血紅蛋白的細(xì)菌凝集活性，而其它糖對(duì)人血紅蛋白細(xì)菌凝集活性無明顯影響.其中，200 mmol·L-1α-D-葡萄糖可部分抑制人血紅蛋白對(duì)溶藻酸弧菌和金黃色葡萄球菌的凝集反應(yīng)，200 mmol·L-1麥芽糖和α-D-乳糖可部分抑制人血紅蛋白對(duì)溶藻酸弧菌、大腸桿菌K12和金黃色葡萄球菌的凝集反應(yīng)，200 mmol·L-1D-木糖可部分抑制人血紅蛋白對(duì)溶藻酸弧菌的凝集反應(yīng)，D-半乳糖和D-山梨糖可部分抑制人血紅蛋白對(duì)大腸桿菌的凝集反應(yīng)，而200 mmol·L-1N-乙酰神經(jīng)氨酸可以全部抑制人血紅蛋白對(duì)6種細(xì)菌的凝集反應(yīng)，其中對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌K12的抑制作用最強(qiáng)，其最低抑制濃度低至50 mmol·L-1.

表2 糖對(duì)人血紅蛋白的細(xì)菌凝集活性抑制分析

3 討論

近年來國(guó)內(nèi)外研究表明，血紅蛋白及其降解片段在免疫反應(yīng)中具有多種免疫學(xué)活性[12-13].新加坡學(xué)者Jiang等[2]研究發(fā)現(xiàn)，人血紅蛋白在病原體蛋白酶刺激下可通過釋放出活性氧而殺滅微生物，提示血紅蛋白具有抑菌活性.德國(guó)學(xué)者Liepke等[6]證實(shí)，人血紅蛋白水解片段同樣具有抑菌活性，其不僅能有效抑制革蘭氏陰、陽(yáng)性菌及酵母的生長(zhǎng)，而且還可以降低內(nèi)毒素活性.中國(guó)學(xué)者Hu等[4]報(bào)道，牛血紅蛋白降解肽段，對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌也具有抑菌活性.但血紅蛋白是否還具有其它免疫學(xué)活性如凝集活性等國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道，故積極對(duì)其進(jìn)行研究具有重要意義.

凝集素是一類能選擇性識(shí)別糖并與之非共價(jià)可逆結(jié)合的多功能免疫分子，具有識(shí)別大多數(shù)細(xì)菌、真菌和病毒的功能，在天然免疫中發(fā)揮重要作用[14-16].本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)人血紅蛋白與人、牛、大鼠、家鼠、非洲爪蟾和斑馬魚等6種凝集素存在同源區(qū)域，提示人血紅蛋白可能同樣具有凝集活性.在此基礎(chǔ)之上，本研究進(jìn)一步運(yùn)用玻片凝集法分別探索人血紅蛋白對(duì)溶藻酸弧菌等6種細(xì)菌的凝集活性.發(fā)現(xiàn)人血紅蛋白對(duì)6種菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的凝集活性、且其凝集活性可被N-乙酰神經(jīng)氨酸等糖所抑制.由此說明，人血紅蛋白確實(shí)具有凝集活性.不過，與一般凝集素相比，其凝集活性大概低2～3個(gè)數(shù)量級(jí)[17-18]，其在人血清中含量上的豐富（110-160 mg·L-）1也許可以彌補(bǔ)其凝集活性上的不足，這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探索血紅蛋白的抗菌機(jī)理奠定了重要基礎(chǔ).

一般認(rèn)為，動(dòng)物呼吸蛋白可分為3大類：血紅蛋白（hemoglobin）、血藍(lán)蛋白（hemocyanin）和蚯蚓血紅蛋白（hemerythreins）[1].近年來研究證實(shí)，呼吸蛋白除參與呼吸作用外，還具有穩(wěn)壓、抗菌等多種生物學(xué)功能[2，19]，引起學(xué)者們的高度關(guān)注.有意思的是，包括本實(shí)室在內(nèi)的前期研究發(fā)現(xiàn)血藍(lán)蛋白還具有凝集[9，20]、溶血[21]、抗腫瘤[22-23]和抗病毒[24]等多種免疫學(xué)活性.而本研究在此研究基礎(chǔ)之上，發(fā)現(xiàn)血紅蛋白同樣具有凝集活性.由此提示，血紅蛋白有可能與血藍(lán)蛋白相似同樣具備其它免疫學(xué)活性，3種呼吸蛋白也有可能由同一起源蛋白進(jìn)化而來.至于其確實(shí)情況，還有待于進(jìn)一步研究和探索.相信隨著對(duì)3種呼吸蛋白免疫學(xué)功能及其分子基礎(chǔ)研究的深入，其確實(shí)情況必將徹底闡明.

圖5 100 mmol·L-1N-乙酰神經(jīng)氨酸抑制人血紅蛋白（1:16）對(duì)大腸桿菌和溶藻酸弧菌凝集反應(yīng)（400×）

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Investigation of Agglutinative Activity of Human Hemoglobin

LIUShangjie，ZHENGZhou，LUOGuoyong，QIAO Jie,ZHANG Yueling
（Department of Biology,College of Science,Shantou University,Shantou 515063,Guangdong,China）

Hemoglobin is an important oxygen carrier in erythrocytes.However,recent reports have demonstrated that human hemoglobin has some nonspecific immunological functions including phenoloxidase and antimicrobial activity.In the present study,the homology between human hemoglobin and agglutinin was analyzed by bioinformatics.The results showed that the α and β chains of human hemoglobin possessed 20%～46.7%homology with lectin fromHomo sapiens,Bos taurus,Rattus norvegicus,Mus musculus,Xenopus（Silurana）tropicalisandDanio rerio.When sixbacteria includingVibrio parahaemolyticus,Vibrio alginolyticus,Vibrio fluvialis,Stphylococcus aureus,Escherichia coli K12andbeta streptococcuswere reacted with human hemoglobin,the results showed that human hemoglobin could aggregate with all these bacteria,with agglutinative activities in the range 3.9～15.6 mg/L.Moreover,saccharide effect on human hemoglobin was further analyzed using nine saccharides including α-D-glucofuranose, Maltose,α-D-lactose,D-galactose,D-sorbin,D-xylose and N-acetylneuraminic acid.The results indicated that the agglutinative activity of human hemoglobin could be partly or completely inhibited by these monosaccharides or oligosaccharides.Taken together,these results suggested that human hemoglobin could also act as an agglutinin in nonspecific immune response,hence, these results will lay the foundation to further explore the immunological functions of human hemoglobin and its mechanism.

hemoglobin;agglutinin;agglutinative activity;saccharide inhibition

1001-4217（2017）04-0003-07

Q71

A

2017-10-29

劉尚杰（1984—），男，博士生，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究.E-mail：15sjliu1@stu.edu.cn

章躍陵（1971—），男，教授，博士生導(dǎo)師.E-mail：zhangyl@stu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31672689），廣東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2017A030311032），廣東省高等學(xué)校重大科研項(xiàng)目培育計(jì)劃類項(xiàng)目（2014GKXM043）