米春娟

基于質(zhì)譜與生物信息學(xué)的運(yùn)動心臟蛋白質(zhì)組學(xué)研究

米春娟1，2

運(yùn)動訓(xùn)練對心血管疾病的預(yù)防和治療作用眾所周知。已有大量研究揭示了運(yùn)動心臟相關(guān)的蛋白表征，但運(yùn)動誘導(dǎo)的心臟重塑的分子機(jī)制至今還不清楚。從以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究入手，分析了不同類型運(yùn)動對心臟蛋白質(zhì)組的影響，同時用生物信息學(xué)方法分析來自于不同運(yùn)動類型與動物模型間的數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，運(yùn)動通過上調(diào)脂質(zhì)和器官代謝過程，促進(jìn)血管生成以及組織再生對機(jī)體產(chǎn)生獨(dú)有的蛋白質(zhì)組重塑影響，同時也揭示心臟線粒體蛋白質(zhì)組在應(yīng)對運(yùn)動訓(xùn)練時具有高度動態(tài)性。從運(yùn)動類型來說，跑臺比游泳對心臟蛋白質(zhì)組的調(diào)整更為有效。這些數(shù)據(jù)為運(yùn)動心臟的蛋白質(zhì)組學(xué)研究打開了新的視野，有望為心臟對運(yùn)動適應(yīng)及不適應(yīng)重塑的機(jī)制研究提供有效幫助。

心臟重塑；運(yùn)動訓(xùn)練；線粒體蛋白質(zhì)組；質(zhì)譜；生物信息學(xué)

運(yùn)動訓(xùn)練可以誘導(dǎo)心臟重塑，從而有效保護(hù)心臟，預(yù)防和治療心血管疾病。運(yùn)動誘導(dǎo)的心臟重塑主要以心肌肥大為主，伴隨著血管新生、膠原蛋白含量增加和心臟泵血功能的提高［3，31］。但是，運(yùn)動訓(xùn)練對心肌收縮蛋白以及鈣調(diào)控的分子信號影響機(jī)制尚不清楚。因此，通過更先進(jìn)的方法進(jìn)一步研究運(yùn)動心臟重塑的分子機(jī)制以更好地 區(qū)分適應(yīng)與非適應(yīng)性心臟重塑，對慢性心臟疾病的治療將起到推動作用?；诘鞍踪|(zhì)組學(xué)的 質(zhì)譜（Mass Spectrometry，MS）技術(shù)的應(yīng)用以及生物信息學(xué)的發(fā)展使研究運(yùn)動心臟蛋白質(zhì)組重塑的分子機(jī)制成為可能。盡管在臨床上已有大量心血管疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，但少有實(shí)驗(yàn)用質(zhì)譜的方法來評價運(yùn)動訓(xùn)練對心臟蛋白質(zhì)組學(xué)的影響。本文通過分析生物信息學(xué)數(shù)據(jù)，概述了心臟蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，突出了方法學(xué)在研究運(yùn)動訓(xùn)練對心臟蛋白質(zhì)組的生物和功能影響時的重要性。

1 用于分析心臟中不同蛋白差異的蛋白質(zhì)組學(xué)策略

研究心肌的蛋白質(zhì)組學(xué)，尤其是區(qū)分提取的心肌細(xì)胞或心肌組織中的個體蛋白與其他混合物時，需要高分辨率技術(shù)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個最重要目的是對整個組織或細(xì)胞器的蛋白質(zhì)補(bǔ)充組件進(jìn)行定性和定量。為了避免心肌組織樣本的復(fù)雜性，亞細(xì)胞分離被用于隨后的研究中，這些方法包括差速離心術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、基于免疫的細(xì)胞分離術(shù)以及分離細(xì)胞核和線粒體時用到的密度梯度離心術(shù)。對于心臟這樣高度活躍的組織，線粒體無疑是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要靶細(xì)胞器［14］。這些細(xì)胞器是能量代謝的重要提供者，它們的功能損傷也是諸如心衰這樣的病理狀態(tài)的基礎(chǔ)［1，18，23，28］。

1.1 凝膠技術(shù)對心肌蛋白質(zhì)組研究的影響

一旦獲得心肌細(xì)胞和心肌組織，大面積的蛋白質(zhì)組學(xué)研究就可以用凝膠或者無凝膠結(jié)合無熒光標(biāo)記或者熒光標(biāo)記定量的方法展開。心肌蛋白分離通常采用雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）分離法，這一方法自1975年發(fā)明以來經(jīng)過多次改良，發(fā)展成為蛋白分離的主要方法，它在蛋白變性的情況下可用等電點(diǎn)聚焦及聚丙烯酰氨凝膠電泳（polyacrylamide gel electro-phoresis，SDS-PAGE）結(jié)合的方法在離散的蛋白質(zhì)之中得到復(fù)雜的蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜。盡管2-DE技術(shù)解決了分離同工型蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)翻譯后修飾的問題，但是存在分離低豐度表達(dá)蛋白、高酸性/堿性蛋白、極疏水性蛋白方面的不足，以及凝膠技術(shù)的難于自動化和再現(xiàn)性限制。隨著差異凝膠電泳技術(shù)的發(fā)展，上述問題也得到了有效改善。差異凝膠電泳技術(shù)是利用靛藍(lán)染料標(biāo)記不同的蛋白樣品，然后在2-DE下實(shí)現(xiàn)與蛋白質(zhì)的共分離。一旦同樣的蛋白出現(xiàn)在用不同染料標(biāo)記的樣品中時，用2-DE可以將其在不損失蛋白豐度的情況下從原始樣品中完整的分離［9，10，29，37］。

1.2 質(zhì)譜技術(shù)在分離心肌蛋白中的作用

在過去的10年中，伴隨著無凝膠技術(shù)的發(fā)展，全新質(zhì)譜技術(shù)的使用進(jìn)一步推動了深入研究蛋白樣品特性的發(fā)展［9，24，34，41］。無凝膠技術(shù)首先是將蛋白通過胰蛋白酶消化，多維液相色譜法可解決每個生物樣品的高度動態(tài)化問題，以此降低生物樣品的復(fù)雜性并增加蛋白質(zhì)組的覆蓋率。典型的例子就是用二維液相色譜結(jié)合反向強(qiáng)陽離子交換術(shù)可很好地分離肽混合物。此外，還有其他液相色譜分析法結(jié)合諸如離子交換色譜法、游離膠分離電泳、疏水交互作用來深一步研究蛋白質(zhì)組［2］。這些方法能在單次實(shí)驗(yàn)中提高鑒別多種蛋白質(zhì)的效率，并降低蛋白樣本的使用量。將高效液相色譜柱嵌于串聯(lián)質(zhì)譜儀當(dāng)中，可以將樣品損耗降到最低，并且能成功分析含量較低的蛋白［11，19，41，44］。要有效分離心臟當(dāng)中的蛋白，也可選用凝膠結(jié)合液相色譜的方法，這一方法被稱為凝膠液相色譜-質(zhì)譜法（GeLC–MS/ MS）。通過SDS-PAGE將樣品蛋白預(yù)處理，胰蛋白酶消化，隨后用液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行分析。這一方法可完整保存蛋白的原有分子量。正是利用它對蛋白分解和聚合的敏感性這一特性，通過將凝膠條帶蛋白分子量與給定提取的蛋白理論分子量進(jìn)行比對，就能有效鑒別蛋白。

質(zhì)譜技術(shù)最重要的進(jìn)展在于能在不同生物狀態(tài)下將蛋白通過化學(xué)同位素標(biāo)記或者光譜計(jì)數(shù)進(jìn)行定量。在用液相色譜-質(zhì)譜法分析多重樣本（4～8個樣本）時，可用同位素標(biāo)記來對蛋白進(jìn)行相對或絕對定量。在培養(yǎng)的細(xì)胞中可用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸對不同表達(dá)水平的蛋白進(jìn)行定量，這種標(biāo)記可以得到氨基酸片段合成、蛋白合成以及反轉(zhuǎn)方面的信息。而等壓標(biāo)記對蛋白進(jìn)行相對或者絕對定量可用在肽水平的量化，同位素標(biāo)記的氨基酸可以量化不同表達(dá)水平的蛋白［40，44］。隨著混合質(zhì)譜以及高分辨率質(zhì)量分析儀的市場普及化，同時鑒于無標(biāo)記相對定量法易于操作、可再生、成本效益低、可重復(fù)率高等優(yōu)點(diǎn)，它已被選為蛋白定量的主要方法。在質(zhì)譜分析后，通常是基于離子強(qiáng)度，如肽在色譜峰面積/峰高或光譜計(jì)算后再進(jìn)行蛋白質(zhì)定量［25，26］。然而，復(fù)雜的蛋白質(zhì)組在被蛋白酶消化后形成的多肽光譜是半隨機(jī)方式獲取的，還存在一定的限制，即高豐度表達(dá)的一些多肽被反復(fù)取樣并隨之獲取其更詳盡的信息，而低豐度表達(dá)的多肽信息則少有機(jī)會被獲取。面對目前技術(shù)的局限性，蛋白定量的最終目標(biāo)要得以實(shí)現(xiàn)還得依靠桿質(zhì)譜和四極離子誘捕質(zhì)譜對特定多肽的針對性分析。盡管這些多肽片段高度動態(tài)、高度敏感，又具有較低的測量差異，但利用桿質(zhì)譜技術(shù)可有效將獨(dú)一無二于目標(biāo)蛋白的有序列多肽挑選出來作為母蛋白的替代品［4，20］。

質(zhì)譜的應(yīng)用也為心臟蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了平臺。蛋白鑒定以及多肽定量是建立心臟蛋白質(zhì)組全面數(shù)據(jù)庫所必不可少的。差異表達(dá)蛋白的鑒定僅是心臟蛋白質(zhì)組學(xué)分析的一小部分，通過其可以鑒定在既定條件下蛋白調(diào)控的分子通路。而生物信息學(xué)工具，如BINGO、ClueGO和STRING等實(shí)現(xiàn)了被鑒定蛋白在生物過程中與其潛在生物功能相關(guān)性的整合［38］。研究者正在嘗試建立與心臟損傷相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)圖譜，以便于幫助人們理解諸如在心臟缺血后損傷的特異性分子之間的交互作用［27］等問題。迄今為止，僅有為數(shù)不多的一些實(shí)驗(yàn)研究了運(yùn)動訓(xùn)練對心臟蛋白質(zhì)組的影響。實(shí)驗(yàn)動物的品系、年齡、性別以及它們對實(shí)驗(yàn)程序的熟悉度，運(yùn)動方案以及對運(yùn)動效果評價方法的差異，都會導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果之間存在差異性。

大部分對心臟組織的分析采用二維質(zhì)譜技術(shù)，而液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在分析心臟線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)中更為有利。盡管線粒體蛋白在心臟蛋白質(zhì)組學(xué)研究中占有極高比重，但目前為止，在線粒體中用二維質(zhì)譜和液相色譜技術(shù)僅發(fā)現(xiàn)兩種蛋白參與了運(yùn)動誘導(dǎo)的心臟重塑：線粒體蛋白Acyl-CoA脫氫酶家族成員9（Acyl-CoAdehydrogenase family member 9， AcadI）和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶2（Aspartate aminotransferase 2，Got2）。有趣的是，其他線粒體蛋白如VDAC1、Aco2、MnSOD，都是在研究運(yùn)動對整個心臟組織或左心室影響時被發(fā)現(xiàn)的，而不是在獨(dú)立的線粒體中發(fā)現(xiàn)它們參與了運(yùn)動誘導(dǎo)的心臟重塑的調(diào)節(jié)，這樣的差異可能是源于樣品制備的技術(shù)問題。

2 運(yùn)動訓(xùn)練對心臟蛋白質(zhì)組分子網(wǎng)絡(luò)的影響

為了評價不同運(yùn)動模式對心臟適應(yīng)的影響，本文整合了使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究的8個實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)［3，5-7，14，21，31，32］。其中有一項(xiàng)研究對比了高強(qiáng)度和中等強(qiáng)度游泳運(yùn)動對ob/ob鼠和ob/OB非肥胖鼠的影響［32］。這些實(shí)驗(yàn)采用了不同的研究方法評價運(yùn)動訓(xùn)練對心臟的生理影響，因此比較起來困難重重。Rocha等［32］和Sun等［35］研究了8周游泳運(yùn)動對心臟蛋白質(zhì)組的影響，Boluyt等［6］和Burniston等［7］研究了6周跑臺運(yùn)動對心臟蛋白質(zhì)組的影響，Kavazis等［21］研究了1周適應(yīng)性訓(xùn)練后，大鼠進(jìn)行1周跑臺運(yùn)動對其心臟蛋白質(zhì)組的影響。近來，Petriz等［12］研究了54周跑臺運(yùn)動對健康大鼠心臟蛋白質(zhì)組的影響。超聲心動圖及血液動力學(xué)分析證實(shí)了運(yùn)動對心臟功能的有益效果，在適應(yīng)性訓(xùn)練1周之后，進(jìn)行5天跑臺運(yùn)動足以產(chǎn)生心臟保護(hù)效應(yīng)以使其免受缺血再灌注損傷［21］。不同的運(yùn)動模式均會引起心臟肥大，并伴隨著左室壁厚度的增加、心肌纖維的加長以及對Ca2+調(diào)控的改善［42］。

為了進(jìn)一步研究運(yùn)動訓(xùn)練對心臟蛋白質(zhì)組調(diào)控的影響，可以在系統(tǒng)生物學(xué)背景下將蛋白信息可視化的綜合工具Cytoscape用于分析［22］。分析顯示，跑臺比游泳對心臟蛋白質(zhì)組的調(diào)控有更大影響。無論哪種運(yùn)動形式都促進(jìn)了代謝酶蘋果脫氫酸酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶以及短鏈acylCoA脫氫酶表達(dá)的增加。已發(fā)現(xiàn)有94種線粒體蛋白參與了運(yùn)動對心臟重塑的調(diào)控，其中76種提取于單個線粒體的蛋白被用于做進(jìn)一步研究。當(dāng)大鼠完成54周跑臺運(yùn)動后，研究者發(fā)現(xiàn)了更多的線粒體蛋白表達(dá)差異。來自于整個心臟和單個心肌線粒體的蛋白質(zhì)組學(xué)比較發(fā)現(xiàn)，僅AcadI和Got2這兩種蛋白質(zhì)參與了運(yùn)動訓(xùn)練對心臟影響的調(diào)控。

ClueGO分析顯示，跑臺運(yùn)動能正向調(diào)節(jié)心臟脂質(zhì)和有機(jī)代謝、血管再生、肌肉生成和組織再生過程，負(fù)向調(diào)控參與氨基酸生 物合成過程中的76種酶。對心臟來說，長期游泳運(yùn)動促進(jìn)了7種代謝和抗氧化蛋白的上調(diào)以及醛還原酶、輔酶A脫氫酶、應(yīng)激70蛋白、激酶蛋白多肽及蛋白激酶A錨定蛋白3的下調(diào)。無論跑臺還是游泳運(yùn)動，其對心臟代謝及抗氧化的影響都被公認(rèn)為是運(yùn)動訓(xùn)練保護(hù)心臟的主要方面。然而，分析從整個運(yùn)動心臟分離出來的單個線粒體卻發(fā)現(xiàn)碳水氧化代謝得以增加［14］。這些表面看起來矛盾的數(shù)據(jù)暗示細(xì)胞分離的過程最小化了參與運(yùn)動誘導(dǎo)的心臟重塑的脂肪酸代謝中高豐度表達(dá)蛋白的貢獻(xiàn)。盡管在一些文獻(xiàn)中對運(yùn)動訓(xùn)練對心肌抗氧化能力影響的描述不一致，但運(yùn)動訓(xùn)練促進(jìn)心肌線粒體MnSOD表達(dá)的增加已得到公認(rèn)。同時也發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動訓(xùn)練導(dǎo)致心肌中過氧化物氧化還原酶3和6的表達(dá)上調(diào)。研究者分析運(yùn)動后的單個心肌線粒體時發(fā)現(xiàn)，心肌內(nèi)膜下線粒體中過氧化物氧化還原酶3有更高的表達(dá)量［21］。據(jù)報道，心肌內(nèi)膜下線粒體比心肌纖維間線粒體更易于產(chǎn)生ROS，但過量ROS的破壞作用被抗氧化系統(tǒng)水平的增加所中和［15，30］。運(yùn)動訓(xùn)練同時調(diào)控了心肌熱應(yīng)激蛋白( Heat shock proteins，Hsps）的表達(dá)，增加Hspβ6和Hsp20表達(dá)，同時下調(diào)Hsp90和應(yīng)激70蛋白水平的表達(dá)。Hsp20在心臟橫紋肌高表達(dá)，調(diào)節(jié)心肌收縮，在長期訓(xùn)練的大鼠心臟中，Hsp20的過表達(dá)受到運(yùn)動誘導(dǎo)的β腎上腺素的調(diào)控［6］。跑臺運(yùn)動能誘導(dǎo)Hsp20在絲氨酸16的磷酸化，而這種運(yùn)動對Hsp20的一過性效應(yīng)出現(xiàn)在運(yùn)動后4 h，且24 h后消失［6，7］。而磷酸化Hsp20也被建議作為心臟疾病的治療靶點(diǎn)［16］。目前認(rèn)為，cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶PKA和PKG最有可能參與調(diào)節(jié)Hsp20絲氨酸16的磷酸化。Hsp20蛋白中PKA/PKG依賴的磷酸化也與心衰和動脈粥樣硬化有關(guān)，然而，通過這一靶點(diǎn)的針對性治療改善心臟疾病的研究還未見報道［17］。運(yùn)動誘導(dǎo)的PKA的激活是通過交感神經(jīng)系統(tǒng)對β腎上腺素受體的激活而介導(dǎo)的。PKA的一個靶點(diǎn)是心肌ryanodine受體和RyR2，這一靶點(diǎn)在絲氨酸2808位點(diǎn)的磷酸化與肌漿網(wǎng)Ca2+傳導(dǎo)有關(guān)［39］。當(dāng)PKG正向調(diào)節(jié)蛋白酶體活性和蛋白酶體介導(dǎo)的錯誤折疊蛋白的降解時，它的激活對治療心臟疾病就是有利的。基于心肌線粒體磷酸化蛋白質(zhì)組的生物信息學(xué)分析表明，PKG可被長期運(yùn)動正向調(diào)控［14］。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的數(shù)據(jù)也揭示了長期運(yùn)動對心肌重塑的積極影響。人們已經(jīng)認(rèn)識到成年人心肌細(xì)胞的再生能力，運(yùn)動訓(xùn)練通過對組織特異性心肌干/祖細(xì)胞的激活促進(jìn)了心臟生長［8，13，14］。動物經(jīng)過4周跑臺運(yùn)動會生成約7%的新生心肌細(xì)胞，這些新生的心肌細(xì)胞是既有血管和心肌干/祖細(xì)胞的新生分化細(xì)胞的組合［43］。然而，運(yùn)動誘導(dǎo)的血管新生和心肌新生的心臟保護(hù)效應(yīng)卻鮮為人知，運(yùn)動誘導(dǎo)的心臟蛋白質(zhì)組重塑的網(wǎng)絡(luò)分析凸顯了其中幾種蛋白，如β-烯丙醇、纖維蛋白原α-鏈、縫隙連接蛋白α-1，在心肌重生中的作用。在這些蛋白中，纖維蛋白原是重要的血液組成成分，它對心臟組織工程的修復(fù)作用已得到普遍認(rèn)可［33］。縫隙連接蛋白-43是出現(xiàn)在心臟縫隙連接中最重要的一種蛋白，在心肌收縮時發(fā)揮重要作用。運(yùn)動訓(xùn)練可以使2型糖尿病患者左心室縫隙連接蛋白-43的蛋白表達(dá)水平正?；?6］。這種蛋白的上調(diào)與運(yùn)動促進(jìn)的心臟血管再生也有關(guān)。

3 結(jié)語與展望

不論運(yùn)動模式、強(qiáng)度及持續(xù)時間如何，在用方法學(xué)來研究心臟蛋白質(zhì)組學(xué)時發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動訓(xùn)練對心臟蛋白質(zhì)組學(xué)有特別的影響。運(yùn)動訓(xùn)練相關(guān)的心臟蛋白質(zhì)組學(xué)信號是以代謝反轉(zhuǎn)、抗氧化系統(tǒng)上調(diào)、組織重構(gòu)以及特異性激酶的激活為特點(diǎn)的。然而，盡管質(zhì)譜法已得到技術(shù)改善，目前極少有研究來評價運(yùn)動與疾病的蛋白質(zhì)組學(xué)之間的交聯(lián)對話。實(shí)際上，大部分心臟蛋白質(zhì)組學(xué)的研究還是依靠生物熒光分析，這使研究運(yùn)動與疾病的心臟蛋白質(zhì)組調(diào)節(jié)中的生物進(jìn)程變得困難重重。用質(zhì)譜法結(jié)合生物信息學(xué)分析做進(jìn)一步研究對更好地揭示不同運(yùn)動模式和疾病之間的心臟蛋白質(zhì)組信號以及其他因素，如年齡和種族，對心臟重塑的影響的分子機(jī)制顯得尤為重要。

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Research on Exercise-related Cardiac Proteome Based on Mass Spectrometry and Bioinformatics

MI Chun-juan1，2

Exercise training is well known for the prevention and treatment of cardiovascular disease (CVD). Although there are a lot of research reveals the cardiac phenotypic characterization，the molecular mechanism of exercise-induced cardiac remodeling is still not clear. This paper analyzes the inf l uence of different types of exercise for the heart proteome，begin with the basis of mass spectrum of proteomics research，at the same time using bioinformatics methods to analyze data from different motion type and animal models. The results show that exercise have particular effect on heart proteome remodeling by the up-regulation of lipid and organ metabolism，vasculogenesis and tissue regeneration，and reveals t hat the heart mitochondrial proteome is highly dynamic in response to exercise training. Regarding to the type of exercise，the treadmill training is more effective than swimming to heart proteomic adjustment. Data from the present paper will certainly open new perspectives on cardiac proteomics and will help to envisage future studies targeting the identif i cation of the regulatory mechanisms underlying cardiac adaptive and maladaptive remodeling.

cardiac remodeling；exercise training；mitochondrial proteome；mass spectrum；bioinformatics

G804.5

A

1002-9826（2017）03-0032-05

10. 16470/j. csst. 201703005

2016-01-22；

2016-12-22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81270301）；陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2012JM4027）。

米春娟，女，副教授，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動與心血管保護(hù)，E-mail：14351284@qq.com。

1.陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062；2.西安科技大學(xué) 體育部，陜西 西安710048

1. Shaanxi Normal University，xi’an 710062，China；

2. Xi’an University of Science and Technology，Xi’an 710048，China.