石 磊（齊齊哈爾市環(huán)境監(jiān)測中心站 黑龍江 齊齊哈爾 161005）

菌株H8絮凝劑的分離與提純

石 磊（齊齊哈爾市環(huán)境監(jiān)測中心站 黑龍江 齊齊哈爾 161005）

通過絮凝分布實驗，確定了絮凝物的有效分布，主要分布在發(fā)酵液的上清和沉淀中，采用超聲波法對沉淀進行破碎提取絮凝劑，并獲得其最佳條件為F=40，T=10，R=4000。分別對上清液和沉淀中的絮凝劑采用乙醇沉淀法進行絮凝干物質(zhì)的提取，每升發(fā)酵液可獲得0.562g絮凝劑。

低溫產(chǎn)絮菌；絮凝劑純化

微生物絮凝劑是一類由微生物產(chǎn)生的有絮凝成分的代謝產(chǎn)物，以多糖、蛋白質(zhì)為主，還含有脂類、纖維素、DNA等物質(zhì)。它是利用生物技術(shù)得到的具有微生物分解性和安全性的新型、無毒、易降解、不產(chǎn)生二次污染的絮凝劑。微生物絮凝劑在廢水處理中應(yīng)用范圍很廣，它可以應(yīng)用于城市生活污水、建材和焦化廢水、畜產(chǎn)廢水、食品工業(yè)廢水、塑料工業(yè)廢水、電鍍廢水等處理中，并且微生物絮凝劑在染料廢水的脫色處理中效果非常好。1976年，J.Nakamura等對能產(chǎn)生絮凝效果的微生物就進行了研究，目前該方面也受到國內(nèi)研究者的重視。本實驗對篩選出來的菌株H8絮凝劑進行了分離、提純研究。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

實驗室分離出來的H8菌種。

1.2 試驗儀器

（1）755B紫外可光分光光度計（上海精密儀器科學(xué)有限公司）；

（2）雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；

（3）HH.Ⅱ420-S電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；

（4）阪神立式冷藏陳立柜（江蘇雪龍電器有限公司）；

（5）SPX-250B型生化培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；

（6）MLS-3020滅菌鍋（日本三洋）；

（7）Mettler AE240電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；

（9）恒溫磁力攪拌器（上海精科實業(yè)有限公司）。

1.3 產(chǎn)絮菌H8絮凝活性分布試驗

將篩選出的產(chǎn)絮菌H8連續(xù)傳代3次后，制成菌懸液，按最佳優(yōu)化培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，發(fā)酵液以5000rmp離心10min，分別取上清液、沉淀和發(fā)酵液測定它們對高嶺土懸濁液的絮凝活性。

1.4 不同離心轉(zhuǎn)速對絮凝活性的影響

將 發(fā) 酵 液 在 2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000rpm下分別離心10min，測定不同轉(zhuǎn)速下收集的上清與沉淀對高嶺土絮凝活性的影響。選取最佳離心的轉(zhuǎn)速。

1.5 發(fā)酵液離心后沉淀中絮凝物質(zhì)的獲取

本試驗用兩種方法進行沉淀中絮凝物質(zhì)的獲取，分別為超聲波震蕩法和機械震蕩法，并對兩種方法進行了優(yōu)化試驗。

（1）超聲波法處理沉淀獲取絮凝物質(zhì)的方法

將離心后得到的沉淀稱重，用蒸餾水50倍稀釋，混勻后置于超聲波振蕩器中超聲破碎，之后離心測定上清液的絮凝性。本試驗分別對超聲頻率和超聲時間進行了優(yōu)化，獲得了最佳的處理條件。

（2）振蕩法破碎沉淀獲取絮凝物質(zhì)的方法

將離發(fā)酵液獲得沉淀稱重，之后用蒸餾水50倍稀釋，混勻后用漩渦振蕩器震蕩分別測定不同時間下獲得的上清液的絮凝率。

1.6 產(chǎn)絮菌H8絮凝劑的分離提純方法

采用有機溶劑沉淀法對微生物絮凝劑進行提純，將離心后發(fā)酵液的上清及沉淀經(jīng)超聲波破碎后的上清中加入2倍體積在4℃預(yù)冷好的無水乙醇，于4℃放置24h，在離心機中8000rpm離心10min，將沉淀重溶于蒸餾水中，重復(fù)前面的步驟一次，將獲得的絮凝劑放在真空干燥箱中于室溫干燥，得到絮凝劑。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)絮菌H8絮凝活性分布試驗結(jié)果

將產(chǎn)絮菌H8發(fā)酵液以5000rmp離心10min，分別測定上清液和沉淀菌體的絮凝活性。試驗結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明上清和沉淀的絮凝效果都在90%以上，因此要分別對上清和沉淀進行絮凝劑的提取。

圖1 產(chǎn)絮菌H8絮凝分布試驗結(jié)果

2.2 不同離心轉(zhuǎn)速對菌液絮凝性的影響

將發(fā)酵液在不同轉(zhuǎn)速下離心，得到的沉淀50倍稀釋，混勻后與上清一起分別測定他們對高嶺土的絮凝性，結(jié)果見圖2，由圖2可以看出，上清液對高嶺土的絮凝性隨著轉(zhuǎn)速的升高而下降，在4000rpm時絮凝性最好。沉淀在4000-6000rpm時與上清液的絮凝性相當(dāng)，高于6000rpm時沉淀的絮凝性增加，說明有效的絮凝物質(zhì)在胞內(nèi)外都存在。沉淀的最佳絮凝為8000rpm。

2.3 菌體離心沉淀中絮凝物質(zhì)的提取結(jié)果

2.3.1 振蕩法提取絮凝物質(zhì)

用漩渦振蕩器破碎沉淀，測定不同振蕩時間下獲得的上清對高嶺土的絮凝性，結(jié)果如圖3所示，由圖3可以看出在震蕩10min時絮凝效果較好，但是與超聲波破碎相比還略差一點，并且用振蕩器處理費力不易操作，因此以后均采用超聲波處理。

2.3.2 超聲波破碎法提取絮凝物質(zhì)

（1）超聲波頻率的優(yōu)化結(jié)果

將離心得到的沉淀50倍稀釋后在不同的超聲頻率下超聲波處理，8000rpm離心測定上清液的絮凝性，結(jié)果如圖4所示，由圖4可以看出在超聲波頻率為40、80、100HZ時，得到的上清對高嶺土的絮凝性較好。

圖2 不同轉(zhuǎn)速對菌液的絮凝性影響

圖3 不同振蕩時間對絮凝率的影響

圖4 超聲波頻率對沉淀提取的優(yōu)化

（2）超聲時間的優(yōu)化結(jié)果

在最佳超聲頻率下，分別測定不同時間下各個頻率的上清的絮凝情況，結(jié)果如圖5所示，由圖5可以看出頻 率 在 40HZ，80HZ，100HZ時分 別 超 聲10min，15min，10min時得到上清液的絮凝性最好。

（3）超聲波處理后菌懸液離心轉(zhuǎn)速的優(yōu)化結(jié)果

將三種超聲波最佳超聲時間下獲得的菌懸液在不同轉(zhuǎn)速下離心，優(yōu)化最好的離心條件，結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明F=40，T=10′，R=4000rpm；F=80，T=15′，R=4000rpm；F=100，T=10′，R=6000rpm時絮凝效果較好。

圖5 不同超聲時間下測得的絮凝率

圖6 不同轉(zhuǎn)速下用超聲波獲得的沉淀的絮凝性

圖7 用超聲波法優(yōu)化沉淀中絮凝物質(zhì)的最佳提取條件

2.4 沉淀中絮凝物質(zhì)獲取的最佳條件

將三種頻率下的獲得的上清在同一條件下測定絮凝率，結(jié)果如圖7所示，由圖7可以看出F=40和F=100時沉淀破碎后得到的上清對高嶺土的絮凝性較好，但是考慮到成本耗損情況，選擇F=40，T=10，R=4000的條件進行沉淀中絮凝物質(zhì)的提取。

2.5 有機溶劑法分離微生物絮凝劑

采用無水乙醇沉淀法，每升發(fā)酵液上清可獲得0.402g絮凝劑。沉淀通過超聲處理后上清獲得絮凝劑量為0.4g/L。所提取的絮凝劑都是略帶微黃的白色粉末，溶于水，將絮凝劑制成濃度20g/L的溶液。所提取的絮凝劑對高嶺土的絮凝情況見圖8，由圖8可以看出，上清中提取的絮凝劑比沉淀中提取的絮凝劑對高嶺土的絮凝顆粒要大一些，并且20mg的絮凝劑就可以對50ml的0.4%的高嶺土懸濁液產(chǎn)生很好的凝效果。文獻中每升高嶺土要加入700mg絮凝劑才能產(chǎn)生較好的絮凝效果，與此相比本絮凝劑有低劑量高絮凝的特點。

圖8 絮凝劑對高嶺土的絮凝情況

3 小結(jié)

（1）通過絮凝分布試驗，確定了有效的絮凝物主要分布在發(fā)酵液的上清和沉淀中，

（2）用超聲波破碎法和振蕩破碎法對沉淀中的絮凝物質(zhì)進行破碎提取，結(jié)果表明超聲波破碎法較好，采用超聲波法對沉淀進行破碎提取絮凝劑。

（3）對超聲波破碎法進行優(yōu)化，確定了在沉淀中獲取絮凝物質(zhì)的最佳條件為F=40，T=10，R=4000。

（4）分別對上清液和沉淀中的絮凝劑采用乙醇沉淀法進行絮凝劑的提取，產(chǎn)量為0.562g/L，每升高嶺土溶液中加入400mg絮凝劑，就能產(chǎn)生很好的絮凝效果，絮凝率達98%以上。

〔1〕張一卉等.微生物絮凝劑概況及發(fā)展前景.生命科學(xué)研究.2005，（9）：35-38.

〔2〕Kumar C.G.，Joo H.S，Choi J.W.，Koo Y.M.and Chang C.S..Purification and characterization ofan extracellular polysaccharide from haloalkalophilic Bacillus sp.I-450.Enzyme and Microbial Technology.2004，（34）：673–681.

〔3〕He N.，Li Y.andChen J.Production of a novel polygalacturonic acid bio.occulant REA-11by Corynebacterium glutamicum.Bioresource Technology.2004，（94）：99–105.

〔4〕Salehizadeh H，Vossoughi M and Alemzadeh I.Extracellular biopolymeric flocculants Recent trends and biotechnological importance.Biotechnology Advances.2001，（19）：371-385.

〔5〕He N.，Li Y.，Chen J.，Lun S.Y.I..dentification of a novel bioflocculant from a newly isolated Coryne bacterium glutamicum.Biochemical Engineering Journal.2002，（11）：137-148.

〔6〕賈省芬.處理城市污水的多功能混合菌研究〔J〕.環(huán)境科學(xué).2000，24（2）：38-42.

〔7〕Kurane R，Matsuyama H.Production of a bioflocculant by mixed culture 〔J〕.Biosci.Biotechnol.Biochem.1994，58（2）：1589-1594.

〔8〕朱曉江，尹雙風(fēng).微生物絮凝劑的研究和應(yīng)用〔J〕.中國給水排水.2001，17（6）：19-22.

〔9〕Deng，S.B.，Bai，R.B.，Hu，X.M.，Luo，Q..Characteristicsof a bioflocculant produced by Bacillus mucilaginosusand its use in starch wastewater treatment.Appl.Microbiol.Biotechnol.，2003，60：588-593.

Isolation and Purification of Strain H8 Flocculant

ShiLei（Environment Monitoring Center Station of Qiqihaer City Qiqihaer HeiLongjiang 161005）

We determined effective distribution of flocs through flocculation experiment.Flocs were mainly distributed in the supernatant and sedimentation of fermentation liquid.We used ultrasonic method to crush sedimentation and extract flocculant and obtained the optimum condition for F=40，T=10，R=4000.We used ethanol precipitation method to extract flocculation dry matter from flocculant in supernatant and sedimentation.Each liter of fermentation liquid could get 0.562 grams of flocculant.

Low temperature floc bacteria Flocculant Purification

X172

A

1674-263X（2017）03-0065-05

2017-09-20

石磊（1982-），男，本科，高級工程師，從事環(huán)境監(jiān)測工作。