董笛，滕珂，于安東，檀鵬輝，梁小紅*,韓烈保*

(1.北京林業(yè)大學草坪研究所，北京100083；2.北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京100097)

溝葉結縷草八氫番茄紅素基因ZmPSY的克隆、亞細胞定位及表達分析

董笛1**，滕珂2**，于安東1，檀鵬輝1，梁小紅1*,韓烈保1*

(1.北京林業(yè)大學草坪研究所，北京100083；2.北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京100097)

八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase，PSY)是生物類胡蘿卜素合成途徑中的一個關鍵酶。本實驗從溝葉結縷草中克隆得到ZmPSY基因(Genbank登錄號為：KY264128)。該基因開放閱讀框為1230 bp,編碼409個氨基酸殘基。亞細胞定位結果顯示，ZmPSY定位于葉綠體中。實時熒光定量分析表明，ZmPSY基因在溝葉結縷草幼嫩的葉片中表達量最高。ZmPSY可受外施激素脫落酸(ABA)的誘導，但受外施激素水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)的抑制。本實驗為深入研究溝葉結縷草八氫番茄紅素合成酶基因的功能奠定了基礎。

溝葉結縷草；八氫番茄紅素基因；克??；亞細胞定位；表達分析

類胡蘿卜素是一種在植物體內(nèi)廣泛存在的色素，除了作為次級代謝物在光合作用中發(fā)揮作用外，它還有防止氧化、為植物著色等功能[1-3]。八氫番茄紅素(phytoene)是所有類胡蘿卜素物質合成的前體物質[4]。八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase，PSY)是調(diào)控類胡蘿卜素合成的一種關鍵酶，可催化香葉基香葉基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)轉化為八氫番茄紅素，此過程是類胡蘿卜素合成途徑中的第一個限速反應[5]。類胡蘿卜素合成途徑碳通量的增加往往導致PSY過表達植株出現(xiàn)矮化等表型，植株抗逆性亦有所提高。臍橙(Citrussinensis)CsPSY基因在香港金橘(Fortunellahindsii)中的異源表達導致β-胡蘿卜素及番茄紅素的積累量顯著增加[6]。過表達PSY基因的番茄(Solanumlycopersicum)[7]和煙草(Nicotianatabacum)[8]中表現(xiàn)出植株矮化的表型。過表達枸杞(Lyciumchinense)PSY基因的洋桔梗(Eustomagrandiflorum)抗逆性增強，耐強光性及耐鹽性均得到顯著提高[9]。

溝葉結縷草(Zoysiamatrella)是世界上最受歡迎的暖季型草坪草之一，因具有較強的抗旱、耐鹽和耐貧瘠能力，其被廣泛應用于高爾夫球場、運動場和城市綠化[10-11]。目前，擬南芥(Arabidopsisthaliana)[12]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)[13]、番茄[14]、小麥(Triticumaestivum)[15]等模式植物和重要作物中八氫番茄紅素合成酶基因的相關研究相繼展開，但溝葉結縷草的PSY基因鮮有研究報道，其功能并不清楚。本研究旨在從溝葉結縷草中克隆八氫番茄紅素合成酶基因(ZmPSY)，進而研究其表達特征和亞細胞定位情況，為深入研究其功能奠定基礎[16]。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料 本實驗所用溝葉結縷草為本實驗室保種，營養(yǎng)基質為蛭石、草炭、珍珠巖等體積的混合基質。采用12 cm×12 cm的花盆，置于人工氣候箱中，光周期為14 h/10 h(日/夜)，溫度為28/25 ℃(日/夜)，濕度約為70%。亞細胞定位本生煙草(Nicotianabenthamiana)為本實驗室保存，培養(yǎng)條件同溝葉結縷草。實驗時間為2016年8月至2017年3月。

1.1.2主要試劑 反轉錄試劑盒Prime ScriptRTReagent Kit、RACE試劑盒、限制性內(nèi)切酶BglⅡ、pMD18-T、PrimeSTAR MAX Premix均購自TaKaRa公司。GoldStar Best MasterMix、UltraSYBR Mixture購自北京康為世紀生物科技有限公司。RNA提取試劑盒(Plant RNA Kit)、PCR純化試劑盒(Cycle-Pure Kit)、質粒提取試劑盒(Plasmid Mini KitⅠ)購自OMEGA公司。In-fusion連接酶購自中美泰和生物公司。農(nóng)桿菌GV3101、EHA105、植物雙元表達載體3302Y3為本實驗室保存。激素脫落酸(abscisic acid， ABA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、水楊酸(salicylic acid, SA)購于SIGMA公司，大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自北京全式金公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗方法

1.2.1引物設計 根據(jù)前期獲得的ZmPSY基因片段，利用Preme Primer 5.0軟件設計3′端特異性引物ZmPSY-RACE-3′-1、ZmPSY-RACE-3′-2和5′端特異性引物ZmPSY-RACE-5′-1、ZmPSY-RACE-5′-2用于RACE擴增ZmPSY基因的3′端及5′端。將3′端及5′端擴增序列進行比對拼接，設計擴增基因全長引物ZmPSY-F和ZmPSY-R。另設計qPCR-F及qPCR-R用于熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)。以結縷草Actin基因(登錄號：GU290546)[17]作為內(nèi)參基因，設計熒光定量的內(nèi)參基因序列Actin-F/R，根據(jù)3302Y3載體序列和基因序列設計用于構建載體的引物Y3-ZmPSY-F/R。

1.2.2基因克隆 選取生長12周的健康溝葉結縷草植株葉片，參照試劑盒說明書提取RNA并進行反轉錄，獲得的cDNA置于-20 ℃保存。3′RACE以ZmPSY-RACE-3′-1/UPM為引物進行第一輪擴增，再以第一輪擴增產(chǎn)物為模板， ZmPSY-RACE-3′-2/NEST為引物進行第二輪擴增，反應程序均為95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，12 ℃保溫。5′RACE以ZmPSY-RACE-5′-1/UPM為引物進行第一輪擴增，反應程序均為95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，12 ℃保溫。再以第一輪擴增產(chǎn)物為模板，ZmPSY-RACE-5′-2/NEST為引物進行第二輪擴增，反應程序為95 ℃ 10 min； 95 ℃ 30 s， 62 ℃ 30 s， 72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，12 ℃保溫。上述第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化并連接pMD18T載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)。經(jīng)篩選后送至生物公司進行測序。

表1 引物序列及用途Table 1 Sequence and usage of primers

利用DNAMAN 7.0軟件對3′端及5′端測序結果進行拼接，根據(jù)拼接結果設計引物ZmPSY-F/R進行基因全長擴增。反應程序為95 ℃ 10 min, 95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min；12 ℃保溫。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后連接pMD18-T載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)，挑取陽性克隆的菌液送至生物公司測序。

1.2.335S-ZmPSY-YFP載體構建 對上述測序結果正確的菌液大量提取質粒，并以其為模板，以Y3-ZmPSY-F/R為引物進行目的片段的擴增，反應程序為98 ℃ 10 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，25個循環(huán)；72 ℃ 3 min；12 ℃保溫。將提取的3302Y3載體質粒用限制性內(nèi)切酶BglⅡ進行單酶切。PCR產(chǎn)物以及酶切產(chǎn)物純化后利用無縫連接酶進行連接，轉化大腸桿菌并對測序正確的菌液進行保存，用于后續(xù)實驗。

1.2.4生物信息學分析 采用NCBI網(wǎng)站Conserved DomainSearch功能進行ZmPSY蛋白保守結構域分析。利用ExPASy數(shù)據(jù)庫(http://expasy.org/)以及SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對ZmPSY蛋白的一級結構、二級結構等特性進行分析。利用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測目的基因信號肽。通過Cell-PLoc package(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/)進行亞細胞定位預測。通過BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在數(shù)據(jù)庫中尋找ZmPSY蛋白的同源序列，利用DNAMAN 7.0對不同物種的PSY蛋白序列進行同源比對。通過MEGA 5.0對不同物種PSY基因編碼同源蛋白構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5亞細胞定位 對含有構建成功的35S-ZmPSY-YFP載體的大腸桿菌提取質粒，轉化EHA105農(nóng)桿菌，注射健康生長2周的本生煙草葉片，注射后的煙草置于黑暗環(huán)境下培養(yǎng)48 h[18]。于共聚焦顯微鏡下觀察YFP信號在細胞中的分布情況。

1.2.6基因表達分析 對不同生長時期、不同部位及激素處理后的ZmPSY基因進行表達分析。具體做法為：采集生長12個月的健康溝葉結縷草幼嫩、成熟、衰老葉片以及成熟的根、莖、葉組織，分別提取RNA。選取健康生長的盆栽溝葉結縷草，分別噴施10 μmol/L ABA，10 μmol/L MeJA，0.5 mmol/L SA。在噴施后第0，1，3，6，12和24 h分別于各盆中取樣，樣品在液氮中速凍后于-80 ℃保存,之后分別提取RNA。每個處理3次重復。將上述RNA反轉錄為cDNA。以qPCR-F、qPCR-R為引物，結縷草Actin基因為內(nèi)參，利用BIO-RAD熒光定量儀進行定量分析。反應程序為95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，30個循環(huán)。

1.3數(shù)據(jù)分析

利用Bio-Rad CFX Manager進行數(shù)據(jù)收集及數(shù)據(jù)錄入，利用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1ZmPSY基因的克隆

以溝葉結縷草cDNA為模板，以ZmPSY-F、ZmPSY-R為引物，進行ZmPSY基因擴增，獲得約1200 bp單一條帶(圖1)。測序結果正確，表明成功獲取ZmPSY基因全長。

圖1 ZmPSY基因的克隆Fig.1 Cloning of ZmPSY A：3′ RACE；B：5′ RACE；C：基因全長。A：3′ rapid amplification of cDNA ends；B：5′ rapid amplification of cDNA ends；C：The full length of gene.

2.2生物信息學分析

ZmPSY基因開放閱讀框共1230 bp，編碼409個氨基酸殘基。保守結構域分析表明該基因屬于Isoprenoid_Biosyn_C1超家族，為類異戊二烯生物合成酶家族。一級結構分析表明，ZmPSY基因編碼蛋白質分子量為46.365 kDa；負電荷氨基酸殘基以及正電荷氨基酸殘基數(shù)目分別為48及58；理論等電點為9.20；不穩(wěn)定系數(shù)為63.49，說明該基因編碼蛋白質不穩(wěn)定；總平均親水性為-0.329，為親水蛋白。二級結構分析顯示，ZmPSY蛋白氨基酸殘基形成的組件中α螺旋及無規(guī)則卷曲占大部分，分別占總數(shù)的51.10%和25.18%，延伸鏈、β轉角數(shù)目共占總數(shù)的23.71%。SignalP 4.1信號肽預測結果顯示，基于Y值最高點判定，ZmPSY蛋白具有信號肽，且其最可能的剪切位點預測在第20和第21位點之間。Cell-PLoc package亞細胞定位預測結果表明，ZmPSY蛋白最有可能定位于細胞葉綠體中。BLAST數(shù)據(jù)庫分析顯示，ZmPSY蛋白較為保守，不同物種的PSY蛋白質與ZmPSY有較高的同源性。進一步構建PSY系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，ZmPSY與粟(Setariaitalica)的PSY親緣關系最近(圖2)。

圖2 ZmPSY蛋白的遺傳進化樹分析Fig.2 Phylogenetic analysis of ZmPSY protein orthologs

2.3亞細胞定位

將含有35S-ZmPSY-YFP載體的EHA105農(nóng)桿菌注入健康生長的本生煙草葉片，48 h黑暗處理后于共聚焦顯微鏡下觀察煙草葉片中黃色熒光蛋白分布情況(圖3)。圖中紅色熒光為葉綠體自發(fā)熒光，黃色熒光為YFP蛋白所發(fā)熒光。亞細胞定位結果表明ZmPSY定位于葉綠體中，此結果與前期亞細胞定位預測結果相符。

圖3 ZmPSY亞細胞定位情況Fig.3 Subcellular localization of ZmPSY A：葉綠體自發(fā)熒光 Chloroplast autofluorescence；B：激發(fā)光下 35S-ZmPSY-YFP Ultraviolet field；C：融合場 Merged.

2.4ZmPSY基因的表達分析

圖4 ZmPSY在不同組織中的表達分析Fig.4 ZmPSY expression in different organs of Z. matrella 不同字母表示差異顯著(Plt;0.05)。下同。Different letters mean significant differences (Plt;0.05). The same below.

圖5 ZmPSY在葉片不同生長時期中的表達分析Fig.5 ZmPSY expression in different developmental stages of leaves

2.4.1ZmPSY基因在不同組織的表達分析 熒光定量結果表明，ZmPSY基因的表達量在溝葉結縷草的不同組織中存在差異。在根、莖中，ZmPSY基因表達量均較低，葉片中ZmPSY基因的表達量最高，分別是根中的4.73倍和莖中的5.27倍(圖4)。

2.4.2ZmPSY基因在葉片不同發(fā)育時期的表達分析 選擇幼嫩、成熟、衰老3個不同時期的植物葉片材料，熒光定量結果表明，在幼嫩時期，ZmPSY基因的表達量最高。成熟時期基因表達量變?yōu)橛啄蹠r期的0.64倍。在衰老時期，ZmPSY基因的表達量顯著降低，為幼嫩時期的0.03倍(圖5)。

2.4.3ZmPSY基因在不同激素處理下的表達分析 熒光定量結果表明，10 μmol/L的ABA對溝葉結縷草ZmPSY基因的表達有促進作用。在ABA處理的早期，ZmPSY基因的表達受到輕微抑制，1和3 h的表達量分別為處理前的0.84和0.74倍。隨著處理時間的增加，ZmPSY基因的表達量顯著增加并在6 h達到峰值，為對照的18.01倍，在處理24 h時ZmPSY基因的表達量逐漸下降(圖6)。

10 μmol/L 的MeJA噴施處理溝葉結縷草，1 h即表現(xiàn)出顯著的抑制作用，ZmPSY基因的表達量為處理前的49.9%。ZmPSY基因的表達量在處理3 h后到達最低值，為對照組的19.7%。用MeJA處理后，ZmPSY基因的表達呈先下降后上升的趨勢，且總體上受到明顯抑制(圖7)。

圖6 ZmPSY在ABA處理后的葉片中的表達分析Fig.6 ZmPSY expression under ABA treatment in leaf

在0.5 mmol/L SA處理的早期，ZmPSY基因的表達量有所下調(diào)。處理1和3 h后，ZmPSY基因的表達量分別為處理前的0.29和0.22倍。隨著處理時間的延長，ZmPSY基因的表達量有所上升，處理12 h時的表達量為處理前的0.72倍。經(jīng)SA處理后，ZmPSY基因的表達量總體呈先下降后逐步恢復的趨勢(圖8)。

圖7 ZmPSY在MeJA處理后的葉片中的表達分析Fig.7 ZmPSY expression under MeJA treatment in leaf

圖8 ZmPSY在SA處理后的葉片中的表達分析Fig.8 ZmPSY expression under SA treatment in leaf

3 討論

ZmPSY催化香葉基香葉基焦磷酸轉化為八氫番茄紅素，而后八氫番茄紅素進經(jīng)過一系列的反應最終形成番茄紅素。番茄紅素在番茄紅素環(huán)化酶作用下降解形成α-胡蘿卜素以及β-胡蘿卜素[19]。類胡蘿卜素合成過程中，PSY為類胡蘿卜素合成過程中重要的限速酶[20]，故而在生物工程中常將PSY作為控制類胡蘿卜素合成的調(diào)控基因[21]。

本研究從溝葉結縷草內(nèi)克隆得到ZmPSY基因。生物信息學分析表明ZmPSY基因開放閱讀框共1230 bp，編碼409個氨基酸。該蛋白屬于Isoprenoid_Biosyn_C1超家族，為類異戊二烯生物合成酶，有相同的“類異戊二烯合酶折疊”，且催化位點由大部分反向平行的α螺旋形成的大中心腔和位于相對壁上的兩個富含天冬氨酸的區(qū)域組成。ZmPSY主要組件為α螺旋及無規(guī)則卷曲，還有少量的延伸鏈、β轉角。信號肽預測結果顯示ZmPSY蛋白具有信號肽，且其最可能的剪切位點預測在第20和第21位點之間。同源比對結果表明PSY是一個相對保守的蛋白，其在不同物種中的同源性很高。進化樹構建顯示ZmPSY與粟中PSY親緣關系最近。亞細胞定位結果顯示，ZmPSY蛋白定位于葉綠體中。這與Qin等[22]對檸檬(Cucumismelo)PSY的亞細胞定位結果一致。類胡蘿卜素在葉綠體內(nèi)生成并累積，PSY通常定位于葉綠體內(nèi)[23]。

熒光定量結果顯示，不同組織中ZmPSY表達量存在明顯差異，葉片組織中的表達量顯著高于根、莖組織，此結果與前人實驗結果類似[24-25]。葉片組織中葉綠體含量較高，且葉片為類胡蘿卜素產(chǎn)生的主要器官[26]。葉片中的ZmPSY表達量也存在一定程度的差異，衰老葉片內(nèi)ZmPSY表達量少于幼嫩葉片、成熟葉片表達量。Salvini等[27]在向日葵(Helianthusannuus)中進行的不同植物組織PSY表達量分析的結果表明向日葵成熟葉片的PSY相對表達量略高于幼嫩葉片，本實驗結果與此存在一定差異，這可能是由于物種之間存在差異，具體原因有待進一步研究。

ABA、MeJA、SA 3種不同激素處理溝葉結縷草，并于處理后不同時間點測定ZmPSY相對表達量。結果表明10 μmol/L ABA對溝葉結縷草ZmPSY基因的表達有促進作用，處理6 h后ZmPSY基因的表達量明顯提高。研究表明，外源ABA能在一定程度上促進番茄果實中番茄紅素含量增加[28]。高等植物中，質體中的類胡蘿卜素降解轉化間接合成脫落酸，溝葉結縷草ZmPSY基因的轉錄可能受到ABA的抗逆信號轉導途徑的影響，并與植物抗逆性有一定關系[29]。MeJA、SA處理溝葉結縷草對ZmPSY基因的表達有抑制作用，MeJA、SA處理后ZmPSY基因的表達量均呈先下降后上升隨后趨于穩(wěn)定的趨勢，但總體趨勢均為降低。有實驗證明SA處理過的果實番茄紅素含量較低[30]，也有實驗顯示SA可增強類胡蘿卜素合成途徑中PSY基因的表達[31]，實驗結論的差異可能是由于SA施用濃度的不同引起的。對PSY基因激素反應元件的分析結果顯示MeJA反應元件存在于部分物種的PSY基因啟動子中，一定濃度的MeJA處理抑制果實番茄紅素、類胡蘿卜素的積累[32-34]。

4 結論

本研究首次從溝葉結縷草中克隆得到八氫番茄紅素合成酶基因，ZmPSY基因開放閱讀框1230 bp，編碼409個氨基酸，屬于Isoprenoid_Biosyn_C1超家族。ZmPSY具有信號肽，且定位在葉綠體中。熒光定量結果表明，ZmPSY基因在幼嫩的葉片中表達量最高。外施ABA激素可誘導該基因的表達，而SA、MeJA則可抑制ZmPSY的表達。本研究為進一步研究ZmPSY基因功能奠定了基礎。

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Cloning,subcellularlocalizationandexpressionanalysisofanovelphytoenesynthasegene,ZmPSY,inZoysiamatrella

DONG Di1**, TENG Ke2**, YU An-Dong1, TAN Peng-Hui1, LIANG Xiao-Hong1*, HAN Lie-Bao1*

1.Turfgrass Research Institute of Beijing Forestry University, Beijing 100083, China； 2.Beijing Research amp; Development Center for Grass and Environment, Beijing 100097, China

The formation of phytoene by phytoene synthase is a key limiting step in the carotenoid biosynthesis pathway. In this study a novel gene,ZmPSY(GenBank Accession number: KY264128), was cloned fromZoysiamatrella. Subcellular localization results proved that ZmPSY was localized in the chloroplasts. Expression analysis showed thatZmPSYhad a higher expression level in leaves compared to roots and stems. The expression ofZmPSYin leaves also varied at different development stages, with the greatest expression seen in young leaves. qRT-PCR determination revealed thatZmPSYcould be induced by exogenous abscisic acid (ABA), but suppressed by salicylic acid (SA) and methyl jasmonate (MeJA). This study paved the way for further discovery of the functional roles ofZmPSY.

Zoysiamatrella; phytoene synthase gene; cloning; subcellular localization; expression analysis

10.11686/cyxb2017176http//cyxb.lzu.edu.cn

董笛, 滕珂, 于安東, 檀鵬輝, 梁小紅, 韓烈保. 溝葉結縷草八氫番茄紅素基因ZmPSY的克隆、亞細胞定位及表達分析. 草業(yè)學報, 2017, 26(11): 69-76.

DONG Di, TENG Ke, YU An-Dong, TAN Peng-Hui, LIANG Xiao-Hong, HAN Lie-Bao. Cloning, subcellular localization and expression analysis of a novel phytoene synthase gene,ZmPSY, inZoysiamatrella. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(11): 69-76.

2017-04-06；改回日期：2017-05-12

北京市博后基金“苔草優(yōu)良耐蔭基因的挖掘與分子調(diào)控機制研究(No.2017-ZZ-087)”,北京市農(nóng)林科學院博后基金，深圳市科技計劃項目(JCYJ20160331151245672，JSGG20160229155434792)和國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(2013AA102607)資助。

董笛(1994-)，女，山東青島人，在讀碩士。E-mail: didoscori@163.com。滕珂(1989-)，男，山東淄博人，在讀博士后。E-mail: tengke.123@163.com。**共同第一作者These authors contributed equally to this work.

*通信作者Corresponding author. E-mail: liang81511@163.com, hanliebao@163.com