閔學陽，劉文獻*，張正社，韋興燚，齊曉，張義，劉志鵬，王彥榮*

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020；2.全國畜牧總站，全國草品種審定委員會辦公室，北京 100125；3.全國畜牧總站，北京100193)

苜蓿DUS測試標準品種SSR分子標記指紋圖譜的構(gòu)建

閔學陽1，劉文獻1*，張正社1，韋興燚1，齊曉2，張義3，劉志鵬1，王彥榮1*

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020；2.全國畜牧總站，全國草品種審定委員會辦公室，北京 100125；3.全國畜牧總站，北京100193)

苜蓿在育種過程中，由于其異花授粉特性和骨干親本的集中使用，導致品種間的遺傳差異日益縮小，品種之間通過形態(tài)學鑒定愈加困難。通過構(gòu)建苜蓿DUS測試標準品種DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，可以實現(xiàn)苜蓿品種的快速、準確鑒定。本研究利用篩選得到的10個SSR標記對33個苜蓿DUS測試標準品種進行指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，10對SSR引物共擴增出69個等位基因，平均每個標記可產(chǎn)生6.9個等位基因；多態(tài)性比率(PPB)從25%到90%不等，平均值為56.7%；各SSR標記的多態(tài)信息含量(PIC)范圍為0.56～0.87，平均值為0.75。利用不同引物間的組合能有效區(qū)分33個苜蓿 DUS標準品種，并為每份標準品種建立了唯一標識的指紋代碼，為苜蓿品種的審定和保護以及遺傳背景分析提供了技術依據(jù)。

苜蓿; SSR標記; 指紋圖譜; 標準品種; DUS 測試

在過去的幾十年中，隨著植物育種和種子貿(mào)易的發(fā)展，植物新品種已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)建設的重要支撐和掌握農(nóng)業(yè)發(fā)展主動權(quán)的關鍵，因此對植物新品種進行保護就顯得尤為重要。植物特異性、一致性和穩(wěn)定性(distinctness, uniformity and stability, DUS)測試作為植物新品種保護的技術基礎，授權(quán)的科學依據(jù)和判斷品種真實性的技術手段，其重要性日益突出[1]。DUS測試技術體系包括以植物農(nóng)藝學形態(tài)特征測試為主導的傳統(tǒng)測試技術和對基因型測試的分子輔助技術兩部分。傳統(tǒng)的DUS測試雖然具有簡單直觀、經(jīng)濟方便等優(yōu)點，但其測試周期長，受環(huán)境條件影響大，穩(wěn)定性差，需要大面積的土地和專業(yè)的技術人才。同時隨著骨干親本的集中使用，相近品種之間的形態(tài)學差異縮小，在實際操作過程中較難執(zhí)行，進而阻礙了新品種授權(quán)的有效性和權(quán)威性[2-3]。

近年來，以PCR 技術為基礎的分子標記技術已經(jīng)被廣泛用于植物品種鑒定和指紋圖譜構(gòu)建[4-5]。與形態(tài)性狀不同，分子標記因具有多態(tài)性高、測試周期短、不受環(huán)境影響、易于自動化等優(yōu)勢，可以在DNA水平上揭示品種間基因型的差異，為種質(zhì)資源鑒定提供了一種直接、可靠和高效的途徑[6-7]。其中，SSR(simple sequence repeat)標記在DNA指紋鑒定上具有信息含量高、標記數(shù)量豐富、多態(tài)信息含量高、簡單快速、重復性好及共顯性遺傳的獨特優(yōu)越性，已成為當前多種農(nóng)作物標準品種指紋圖譜構(gòu)建及DUS 測試的首選標記[6]。作為植物新品種 DUS快速測試的核心技術之一，SSR標記分別對水稻(Oryzasativa)[8]、玉米(Zeamays)[9]、多花黑麥草(Loliummultiflorum)[10]和柱花草(Stylosanthesspp.)[11]等物種進行了研究，并成功將這項技術運用于植物標準品種指紋圖譜構(gòu)建和新品種DUS測試中。

苜蓿(Medicagosativa)作為最重要和廣泛種植的豆科飼料作物，具有較高的營養(yǎng)品質(zhì)和經(jīng)濟價值。除此之外，其在飼草生產(chǎn)、生態(tài)治理和綠肥種植中都是首選物種[12-13]。栽培苜蓿為異花授粉的同源四倍體(2n=4x=32)，主要靠種子繁殖后代。由于其為四倍體遺傳，具有多個等位基因和顯著的近交繁殖抑制特性[14-15]。因此，采用多態(tài)性共顯性標記，例如SSR分子標記，可從分子水平區(qū)分和鑒定雜合和純合基因座，從而輔助選擇和提高苜蓿品種開發(fā)的效率。

在農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)技術試驗示范(國家草品種區(qū)域試驗)項目的資助下，本團隊經(jīng)過近3年的測試分析及品種評價，驗證和完善了48個苜蓿品種的19個基本性狀田間測試技術，篩選出的33個苜蓿標準品種列入中華人民共和國農(nóng)業(yè)部《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 紫花苜蓿和雜花苜蓿》(NY/T2747-2015)農(nóng)業(yè)行業(yè)標準文本[16]，不僅填補了我國苜蓿DUS測試技術體系的空白，也進一步促進了我國苜蓿新品種的審定和保護。為了從分子水平研究苜蓿品種間基因型的差異，本研究采用基于苜蓿開發(fā)的引物組合，對DUS測試指南中規(guī)定的33個苜蓿標準品種構(gòu)建標準品種指紋圖譜，并在此基礎上對品種間的遺傳相似性進行分析，從分子水平上為苜蓿品種的鑒定和保護提供更加準確、公正和客觀的判定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗材料

試驗于2016年9-12月進行。本研究所用的33個苜蓿品種由國內(nèi)和國外兩部分構(gòu)成，19份國外品種由美國農(nóng)業(yè)部提供，14份國內(nèi)品種由農(nóng)業(yè)部全國畜牧總站和國家草種質(zhì)資源庫提供，均為苜蓿DUS測試的標準品種(表1)。以上測試材料均種植在蘭州大學臨澤試驗站。

1.2基因組DNA的提取

對每個苜蓿品種，采用30個單株的新鮮葉片混合取樣[17]。利用CTAB法提取苜?；蚪M總DNA[18]，以1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，并用Nanodrop分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳測DNA濃度和質(zhì)量(OD260/OD280≈1.8)。將DNA樣品稀釋成25 ng/μL的工作液并置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 苜蓿品種鑒定試驗材料Table 1 Alfalfa varieties in the experiment

1.3PCR 擴增與檢測

本研究所用的SSR引物分別選自在苜蓿中具有通用性、多態(tài)性高、重復性好的MtTFSSR[18]，MsSSR[19]及MTRmiRSSR分子標記。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表2)。PCR反應體系為10 μL，在PTC-200熱循環(huán)儀上進行：模板DNA 1 μL，2×Taq PCR MasterMix 5 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 2 μL。PCR 擴增程序為：94 ℃變性30 s；60～56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，共5個循環(huán)；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；于4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行檢測。樣品點樣量為2 μL，200 V電壓下電泳110 min，凝膠用AgNO3溶液染色，照相保存。

表2 10對SSR引物信息Table 2 Information on SSR markers used in the study

TB: Total bands; PB: Polymorphic bands; PPB: Percentage of polymorphic bands; He: Expected heterozygosity; PIC: Polymorphic information content.

1.4數(shù)據(jù)分析

通過人工比對和軟件校正，對SSR 標記擴增產(chǎn)物進行統(tǒng)計。按照擴增條帶的分子量從大到小編號讀取，相同遷移位置有帶的記為1，無帶的記為0， 建立“0，1”矩陣。根據(jù)“0，1”矩陣，統(tǒng)計SSR標記擴增產(chǎn)物的總條帶數(shù)(total bands, TB)、多態(tài)性條帶數(shù)(polymorphic bands, PB)、多態(tài)性條帶比率(percentage of polymorphic bands, PPB)、預計雜合度(expected heterozygosity, He)和多態(tài)信息量(polymorphic information content, PIC)[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1SSR產(chǎn)物多態(tài)性分析

本研究采用本課題組開發(fā)的具有較高遺傳多樣性的10 對核心SSR引物，對33個苜蓿品種進行了遺傳多樣性分析(表2)，這些引物均可擴增出多態(tài)性高且清晰的條帶。每對引物多態(tài)性條帶數(shù)量(PB)從1(MtTFSSR-20和MTRmiR078)到9(MtTFSSR-10)不等，平均值為 4.2；10對SSR引物的多態(tài)性比率(PPB)從25%(MtTFSSR-20)到90%(MtTFSSR-10)不等，平均值為56.7%；多態(tài)信息含量(PIC)范圍為 0.56(MTRmiR078)～0.87(MtTFSSR-19, Ms-50)，平均值為0.75，這表明本研究中的33個標準品種具有豐富的遺傳多樣性；每個標記預計雜合度(He)范圍為0.64(MTRmiR078)～0.88(MtTFSSR-19, Ms-50)?；谝陨辖Y(jié)果， MtTFSSR-10的PB和PPB均為最大值，MtTFSSR-19和Ms-50的PIC和He均為最大值，因此，MtTFSSR-10、MtTFSSR-19和Ms-50這3對引物在苜蓿遺傳多樣性分析及品種鑒定中具有更大的潛力。

2.2SSR引物鑒定苜蓿品種效率分析

在篩選出的10對核心SSR多態(tài)性引物中，每個多態(tài)性引物分別能擴增出1～9 條多態(tài)性條帶，不同引物能夠區(qū)分的苜蓿品種數(shù)不同，其范圍在1～7之間(表3)。例如，引物MtTFSSR-10能擴增出10條多態(tài)性條帶，可以一次性區(qū)分7個品種；而引物MtTFSSR-20擴增出4條多態(tài)性條帶，僅能鑒定出Ranger一個品種。但不同引物的組合可以大大提高對不同品種的鑒別能力。例如，MtTFSSR-10引物能鑒別7個品種，與引物MtTFSSR-19組合后可鑒別品種的數(shù)量增加到16個；引物MtTFSSR-19能鑒別3個品種，與引物MtTFSSR-41組合后能鑒別的品種數(shù)增至12個。采用以上10對SSR引物對33個品種進行分析，14個品種具有特征譜帶(表3)，即僅用1個特征引物即可將該品種與其他品種區(qū)分開。例如，MtTFSSR-10和MtTFSSR-19均在中蘭1號上具有特征譜帶；MTRmiR079在Abi 700中具有特征譜帶(圖1)。因此在對品種鑒定時可優(yōu)先采用相應特征引物快速鑒定。

表3 14個苜蓿品種的5對特征引物列表Table 3 Five primer pairs with specific bands for 14 alfalfa varieties

圖 1 部分SSR引物在編號為1～33的苜蓿品種中的擴增結(jié)果Fig.1 SSR amplification results of alfalfa varieties coded from 1 to 33 with part of primers A: MtTFSSR-10; B: MtTFSSR-19; C: MTRmiR077;M:DNA marker.

2.3苜蓿標準品種指紋圖譜的構(gòu)建

33個標準品種的SSR引物擴增條帶， 詳見表4。 在擴增結(jié)果中， 有條帶記為“1”，無帶記為“0”。10對引物組合在一起即為苜蓿的DNA指紋圖譜，如用所有10對SSR引物，擴增Abi 700，得到的圖譜分別為1111111111、1100001110、 0111、 111111、 11111、 111111、 011、 1110、 000111011和100111101011， 將其組合到一起為1111111111-1100001110-0111-111111-11111-111111-011-1110-000111011-100111101011(表4)。 將10對SSR引物的擴增結(jié)果組合在一起，可得到由79個“0” 和“1” 組成的數(shù)字圖譜。這些組合的數(shù)字圖譜構(gòu)成了33個苜蓿品種的組合指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。當33條字符串形成能夠唯一標識一份品種的字符串時，即表明這10個SSR標記能將33份材料全部區(qū)分開，即每一條字符串可以作為每一份品種的分子身份證號碼。

表4 33個苜蓿品種的DNA指紋圖譜Table 4 DNA fingerprint of the 33 alfalfa varieties

A: MtTFSSR-10；B: MtTFSSR-19；C: MtTFSSR-20；D: MtTFSSR-41；E: MTRmiR072；F: MTRmiR077；G: MTRmiR078；H: MTRmiR079；I: MTRmiR124；J: Ms-50.

圖2 SSR引物擴增結(jié)果相關性分析Fig.2 The correlation analyze based on the SSR productions

利用10對核心引物在33個苜蓿品種的電泳帶型對引物間擴增結(jié)果的相關性進行分析。相關性分析結(jié)果如圖2所示。10對引物間，MTRmiR079與MtTFSSR-20之間相關性最強，相關系數(shù)達到0.94，兩者之間擴增帶型差異最??；而Ms-50與MtTFSSR-20之間相關性最差， 相關系數(shù)為-0.09，他們之間的擴增帶型差異最大。因此，根據(jù)引物間擴增結(jié)果的相關性高低，可以進一步輔助在進行品種鑒定時進行引物間的優(yōu)化組合，即利用相關性較差的引物組合可以更加利于進行品種間的鑒定。同時，進一步利用10對引物在不同品種中的擴增產(chǎn)物所對應的分子量大小對每個品種的DNA指紋圖譜進行作圖，從而可以更直觀地對不同品種間的差異進行比較(圖3)。

3 討論

隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，牧草種子的市場需求量日趨增大，新的牧草品種急劇增加。因此，如何快速、準確地檢測品種純度與真實性的工作也變得越來越重要。傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定法具有耗時長、受環(huán)境限制、需要大量的土地面積等缺點[4]。隨著以PCR 技術為基礎的分子標記技術的不斷發(fā)展與完善，解決了傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定法、同工酶蛋白和電泳鑒定中存在的多個問題。目前，該技術已被成功地運用于水稻、玉米和多花黑麥草等植物的品種鑒定中。同時，大量研究表明SSR標記由于具有高分辨力特性及共顯性的遺傳方式，使其成為指紋構(gòu)建和品種鑒定的理想標記技術[6,8,21]。

苜蓿品種大多為通過表型輪回選擇或大量自然選擇培育的綜合品種(群體)，有多個親本參與雜交，這就造成部分育成品種間或多或少有著親緣關系。品種的遺傳多樣性分析重在揭示品種間的親緣關系及遺傳基礎，在研究中只要品種間一個 DNA 位點(片段)的基因型(帶型)不同, 便視為不同品種，篩選核心引物的重要指標之一是可以利用DNA帶型區(qū)分更多的品種。品種指紋圖譜作為植物品種特異性檢測的分子標記，不僅需要區(qū)別盡可能多的品種，還應能從眾多品種中篩查出相似度高的品種。苜蓿指紋圖譜則是通過統(tǒng)計多態(tài)性條帶信息構(gòu)建的，而不同苜蓿品種的遺傳多樣性正是通過多態(tài)性位點差異體現(xiàn)的。本研究把10對SSR引物的擴增結(jié)果組合在一起就可以將33個苜蓿品種完全區(qū)分開，即每個苜蓿品種都有能夠唯一標識的一份品種字符串。苜蓿SSR指紋圖譜的構(gòu)建不僅可以為SSR標記技術在苜蓿DUS測試中應用奠定基礎，而且在育種策略調(diào)整和選配優(yōu)良雜交組合培育新品種等方面具有現(xiàn)實意義。

本研究中所選用10對引物中，有5對引物具有特征條帶，可以直接對14個苜蓿品種進行鑒定。因此，若想獲得其他品種的特異性譜帶，還需要擴大引物的篩選范圍。同時，隨著參試品種數(shù)量的增加，一些特征譜帶可能會失去其特異性，只能對特定的材料有效。研究表明，通過不同引物的有限組合能夠提高引物的鑒別效率。如張玉翠等[22]通過5對引物的有效組合，即可將32個棉花(Gossypiumhirsutum)品種完全區(qū)分開。羅永聰?shù)萚10]利用12對引物的組合提高了引物在多花黑麥草品種間的鑒別能力，例如，01-01B引物可以鑒別12個品種，但是與引物12-10F組合后即能鑒別全部供試的21個品種。本研究結(jié)果也證實了這一結(jié)論，如引物MtTFSSR-10能鑒別6個品種，引物MtTFSSR-19能鑒別3個品種，但是將這兩個引物組合就可以鑒別14(42%)個品種，表明本研究篩選的10對SSR引物具有多態(tài)性高和穩(wěn)定性強的特點，可作為一套鑒定苜蓿品種的核心引物。

值得注意的是，本研究中所用的大部分品種來源于國外，由于某些原因難以獲得其育種系譜關系，加之苜蓿為典型的異花授粉植物，具有復雜的品種遺傳基礎，增大了研究品種間遺傳相似性關系的難度。因此，對于異花授粉的植物，在構(gòu)建指紋圖譜及遺傳關系分析時應該特別注意系譜關系的收集，以便于后續(xù)的分析，進而建立更為完善的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。

4 結(jié)論

本研究以10對核心引物構(gòu)建了33個用于苜蓿DUS測試的品種的DNA指紋圖譜，可以從分子水平快速準確鑒別和了解苜蓿品種的遺傳多樣性，能夠在品種鑒定和知識產(chǎn)權(quán)保護等方面發(fā)揮積極作用，為合理利用苜蓿種質(zhì)資源和選配優(yōu)良雜交組合培育新品種提供理論依據(jù)。

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ConstructionofSSRmarkerfingerprintdatabaseofstandardalfalfavarietiesutilizingDUStests

MIN Xue-Yang1, LIU Wen-Xian1*, ZHANG Zheng-She1, WEI Xing-Yi1, QI Xiao2, ZHANG Yi3, LIU Zhi-Peng1, WANG Yan-Rong1*

1.State Key Laboratory of Grassland Argo-ecosystems, Key Laboratory of Grassland Livestock Industry Innovation, Ministry of Agriculture, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China; 2.National Animal Husbandry Service, Office of the Chinese Herbage Cultivar Registration Board, Beijing 100125, China; 3.National Animal Husbandry Service, Beijing 100193, China

Due to cross-pollinating characteristic and the excessive use of backbone materials during the alfalfa breeding, the genetic diversity of alfalfa varieties is declining, and the discrimination of different varieties through phenotypical characteristics is becoming more difficult. The construction of a DNA fingerprint database of standard alfalfa varieties through the distinctness, uniformity and stability (DUS) test can facilitate the identification of alfalfa varieties. In this study we analyzed the genetic diversity among 33 standard alfalfa varieties with a DUS test and the DNA fingerprint of each variety was constructed based on 10 SSR markers. The results showed that a total of 69 alleles were generated from the 10 SSR markers, with an average of 6.9 alleles per marker; the polymorphic ratio varied from 25% to 90%, with an average of 56.7%. The polymorphic information content per SSR marker varied from 0.56～0.87, with an average of 0.75. The 33 varieties could be clearly distinguished by the 10 SSR markers. The DNA fingerprint of each variety was established providing a technical basis for the validation and conservation of alfalfa varieties and genetic background analysis.

alfalfa; SSR markers; DNA fingerprinting; example varieties; DUS testing

10.11686/cyxb2017038http//cyxb.lzu.edu.cn

閔學陽, 劉文獻, 張正社, 韋興燚, 齊曉, 張義, 劉志鵬, 王彥榮. 苜蓿DUS測試標準品種SSR分子標記指紋圖譜的構(gòu)建. 草業(yè)學報, 2017, 26(11): 47-56.

MIN Xue-Yang, LIU Wen-Xian, ZHANG Zheng-She, WEI Xing-Yi, QI Xiao, ZHANG Yi, LIU Zhi-Peng, WANG Yan-Rong. Construction of SSR marker fingerprint database of standard alfalfa varieties utilizing DUS tests. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(11): 47-56.

2017-02-14；改回日期：2017-04-10

國家自然科學基金項目(31502000)，教育部創(chuàng)新團隊(IRT_17R50)，高等學校學科創(chuàng)新引智計劃(B12002)，國家草品種區(qū)域試驗項目(21301060001)和蘭州大學中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(lzujbky-2016-8)資助。

閔學陽(1991-)，男，甘肅張掖人，在讀碩士。E-mail: minxy15@lzu.edu.cn

*通信作者Corresponding author. E-mail： liuwx@lzu.edu.cn， yrwang@lzu.edu.cn