蘇學(xué)軍，王 艷，高榮榮

（泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

雙水相萃取分離稻殼黃酮的工藝研究*

蘇學(xué)軍，王 艷，高榮榮

（泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

以濃縮后的稻殼粗提液為原料，采用乙醇/硫酸銨雙水相體系對稻殼黃酮分離純化，以確立雙水相萃取稻殼黃酮的工藝參數(shù)。通過單因素試驗(yàn)法探討了硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗提液加入量、溫度、pH值對稻殼黃酮萃取效應(yīng)的影響，并以萃取率為考察指標(biāo)，正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選出最佳萃取工藝條件。結(jié)果表明，在自然pH值及45℃條件下，當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為29%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%、粗提液加入量為3mL時(shí)，稻殼黃酮萃取率達(dá)96.26%。此法條件溫和，操作簡便，可作為從稻殼粗提液中分離純化稻殼黃酮的一種有效手段。

稻殼；雙水相體系；黃酮；乙醇/硫酸銨

前 言

黃酮類化合物是具有多種生物學(xué)活性的天然多酚類物質(zhì)，有明顯的抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂等多種藥理及保健作用[1，2]。因其來源廣泛，安全無毒，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可開發(fā)為植物源農(nóng)藥、植物生長調(diào)節(jié)劑及飼料添加劑[3，4]；在食品工業(yè)常用作天然甜味劑、保鮮劑、油脂抗氧化劑、天然色素或作為功能性保健食品的添加劑[5]，極具開發(fā)應(yīng)用前景。

稻殼是傳統(tǒng)意義上的農(nóng)業(yè)廢棄物，目前對稻殼資源的利用主要是燃燒發(fā)電或制備無機(jī)精細(xì)化工產(chǎn)品二氧化硅和活性炭。為實(shí)現(xiàn)稻殼資源的高值化利用，可將其中的黃酮類化合物進(jìn)行提取和分離。稻殼黃酮的提取方法主要有溶劑浸提法、超聲波提取法、微波輔助提取法和酶解法等[6]。不同提取法得到的黃酮粗提液一般需要經(jīng)過濃縮、分離純化、干燥等精制工藝處理，才有實(shí)際應(yīng)用意義。黃酮粗提液最常用的分離純化方法主要是液-液萃取法和大孔吸附樹脂法。液-液萃取法的生產(chǎn)能力大、時(shí)間短，但有機(jī)溶劑殘留多[7]。用大孔吸附樹脂法進(jìn)行純化，雖選擇性好、純度高，但樹脂的預(yù)處理過程繁瑣，吸附洗脫時(shí)間長[8]。雙水相萃取是一種高效溫和的綠色生物分離技術(shù)，具有操作簡單、過程易放大、分相速度快、選擇性好、易保留生物活性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品、生物及醫(yī)藥等領(lǐng)域[9，10]。本實(shí)驗(yàn)選用乙醇/硫酸銨雙水相體系分離純化稻殼黃酮，采用單因素試驗(yàn)法和正交實(shí)驗(yàn)法分析了目標(biāo)萃取物在雙水相體系中的分配行為，確定了雙水相萃取稻殼黃酮的最佳工藝條件,以期為稻殼廢棄物的綜合利用提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

稻殼產(chǎn)自江蘇省泰興市、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,上海伊卡生物技術(shù)有限公司、無水乙醇、三氯化鋁、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銨均為市售分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；sartorius電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；XA-1微型高速粉碎機(jī)，姜堰市銀河儀器廠；KQ5200DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；80-2臺(tái)式離心機(jī)，上海浦東物理光學(xué)儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市科華儀器設(shè)備有限公司；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 稻殼黃酮粗提液的提取

稻殼去雜、洗凈、烘干，粉碎后過40目的篩。精確稱取10g稻殼微粉,加入40mL的石油醚浸泡48h，過濾，烘箱內(nèi)低溫?fù)]盡石油醚，然后按1∶30（g/mL）的料液比加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液，置30℃恒溫水浴振蕩器中振蕩浸漬處理1h，再于60℃下超聲提取0.5h，趁熱過濾，濾渣以同樣方法再次超聲提取并抽濾，合并濾液。濾液過0.45μm的微孔濾膜，經(jīng)減壓濃縮回收乙醇至無醇味后，加水溶解并定容于100mL容量瓶內(nèi)，即得稻殼黃酮粗提液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乙醇/硫酸銨雙水相體系的形成

在50mL燒杯中加入一定量硫酸銨，將其置于25℃恒溫水浴中，加入蒸餾水溶解，磁力攪拌下緩慢滴加無水乙醇，觀察體系變化，至溶液剛好出現(xiàn)渾濁時(shí)，記錄乙醇的加入量。然后向體系滴加蒸餾水，溶液澄清，記錄水的加入量。繼續(xù)滴加乙醇，再次出現(xiàn)渾濁，如此反復(fù)操作。計(jì)算出每次渾濁時(shí)乙醇、硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并繪制乙醇/硫酸銨雙水相相圖。

1.2.3 雙水相體系萃取稻殼黃酮

依據(jù)乙醇/硫酸銨雙水相相圖，在兩相區(qū)選取合適的雙水相萃取體系。設(shè)計(jì)雙水相系統(tǒng)總質(zhì)量為20g，在25mL具塞刻度管中加入一定量的乙醇、硫酸銨及適量體積的稻殼黃酮粗提液，余補(bǔ)足蒸餾水。充分振蕩搖勻，于恒溫水浴中靜置，直至完全分相后，讀出上、下相體積。吸取上、下相溶液適量進(jìn)行分析，采用AlCl3比色法[11]測定黃酮含量，并通過相比（R）、分配系數(shù)（K）及萃取率（Y）考察稻殼黃酮在雙水相體系中的分配行為，計(jì)算公式如下：

式中，Vi、Vj分別為上、下相體積（mL）；Ci、Cj分別為上、下相稻殼黃酮的質(zhì)量濃度（mg/mL）。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對稻殼黃酮萃取率的影響

在25℃，粗提液加入量為2mL，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17%的雙水相體系中，加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的無水乙醇，考察對稻殼黃酮的萃取效果，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對萃取率的影響Fig.1 Effect of ethanol mass fraction on extraction rate

由圖1可見，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，萃取率隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大，當(dāng)乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到27%時(shí)，萃取變得平衡。這是因?yàn)辄S酮類化合物具有一定的醇溶性，隨著雙水相體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，目標(biāo)萃取物和溶劑的接觸面積變大，使得其在富含乙醇的上相中有較大的分配系數(shù)。但當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增大時(shí)，會(huì)造成相比過大，上相體積過多，反而不利于黃酮的富集。綜合考慮，合適的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇27%即可。

2.2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對稻殼黃酮萃取率的影響

在25℃，粗提液加入量為2mL，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%的雙水相體系中，加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硫酸銨，考察對稻殼黃酮的萃取效果，結(jié)果見圖2。

由圖2可見，在成相濃度范圍內(nèi)，萃取率隨硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時(shí)達(dá)到了最大值。這是因?yàn)榱蛩徜@質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，其水合能力增強(qiáng)，導(dǎo)致下相體積增大，極性增強(qiáng)，稻殼黃酮在下相的溶解度減小。上相中水的減少，使得乙醇濃度相應(yīng)地增大，因而上相中黃酮的溶解度增大，分配系數(shù)和萃取率隨之增大。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過20%時(shí)，雙水相體系中硫酸銨濃度已達(dá)飽和，出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象，反而影響了黃酮的浸出，故合適的硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇18%。

圖2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對萃取率的影響Fig.2 Effect of mass fraction of ammonium sulfate on extraction rate

2.3 粗提液加入量對稻殼黃酮萃取率的影響

在25℃，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%的雙水相體系中，考察粗提液加入量對稻殼黃酮的萃取效果，結(jié)果見圖3。

圖3 粗提液加入量對萃取率的影響Fig.3 Effect of mass fraction of crude extract on extraction rate

由圖3可見，當(dāng)乙醇和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨雙水相體系中粗提液加入量的增多，萃取率呈先快速上升后緩慢下降趨勢。粗提液加入量會(huì)影響鹽的溶解度，進(jìn)而影響分配行為和萃取率。因而，合適的粗提液加入量選擇2mL。

2.4 pH值對稻殼黃酮萃取率的影響

在25℃，粗提液加入量為2mL，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%時(shí)，考察不同pH值體系對稻殼黃酮的萃取效果，結(jié)果見圖4。

由圖4可見，當(dāng)雙水相體系一定時(shí)，萃取率隨著溶液pH值升高快速增大，至pH值=5時(shí)，萃取變得平衡。對于乙醇/硫酸銨雙水相體系而言，上相電位為正，下相電位為負(fù)。稻殼黃酮為一種C-糖苷類物質(zhì)[11]，分子結(jié)構(gòu)中含多個(gè)羥基，不同pH值條件會(huì)影響其表面的電荷性。隨著雙水相體系pH值的降低,體系中H+數(shù)量增多，黃酮能結(jié)合更多的H+而帶正電荷，會(huì)朝電位為負(fù)的下相富集，從而導(dǎo)致萃取率的降低[12]。就整個(gè)雙水相體系而言，當(dāng)pH值控制在5～7范圍內(nèi)，pH值的變化對萃取率的影響較小，而雙水相體系的自然pH值則在此范圍內(nèi)，基于經(jīng)濟(jì)性及易操作性，選擇自然pH值條件進(jìn)行操作即可。

圖4 pH值對萃取率的影響Fig.4 Effect of pH value on extraction rate

2.5 溫度對稻殼黃酮萃取率的影響

在25℃，粗提液加入量為2mL，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%時(shí)，考察不同溫度對稻殼黃酮的萃取效果，結(jié)果見圖5。

圖5 溫度對萃取率的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction rate

由圖5可見，當(dāng)溫度低于45℃時(shí)，隨著溫度的升高，稻殼黃酮的萃取率不斷變大，但當(dāng)雙水相體系溫度進(jìn)一步升高時(shí)，萃取率呈明顯下降趨勢。這可能由于溫度的升高，使得相際之間傳質(zhì)速率加快，加速了水溶性多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)向下相富集[13]，黃酮向上相富集，因而萃取率變大。但溫度過高也能增強(qiáng)溶質(zhì)的擴(kuò)散作用，進(jìn)而影響黃酮在上相的分配比，造成萃取率下降。此外，溫度越高硫酸銨的溶解度越大，降低了雙水相系統(tǒng)的分相能力，當(dāng)溫度高于75℃時(shí)，相界面已模糊，故合適的溫度選擇45℃為宜。

2.6 雙水相萃取稻殼黃酮正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素分析基礎(chǔ)上，按表1設(shè)計(jì)L9（34）正交表。以稻殼黃酮的萃取率Y作為評價(jià)指標(biāo)考察雙水相的萃取效果，確定萃取最優(yōu)工藝條件，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

由表2可知，在實(shí)驗(yàn)所選的水平內(nèi)，各因素對雙水相體系萃取稻殼黃酮的影響關(guān)系為C＞A＞B＞D，以粗提液加入量對黃酮萃取率的影響最大，溫度的影響則最小。直觀分析可得最佳萃取條件為A3B2C3D2，即溫度45℃，乙醇、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為29%、18%，粗提液加入量為3mL。在此條件下，進(jìn)行了5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示平均萃取率為96.26%。

3 結(jié)論

乙醇/硫酸銨雙水相體系中兩相的極性差異直接影響著稻殼黃酮的分配行為，在自然pH值及45℃條件下，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為29%的乙醇及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%硫酸銨雙水相體系，從添加量為3mL的稻殼粗提液中萃取稻殼黃酮的萃取率為96.26%。該法操作簡單，條件溫和，過程易放大，可作為一種稻殼黃酮分離純化的有效方法。

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Research on the Separation of Rice Hull Flavonoids by Aqueous Two-phase Extraction

SU Xue-jun,WANG Yan and GAO Rong-rong
（College of Pharmacy,Taizhou Polytechnic Institute,Taizhou 225300,China）

In order to establish the technological parameters of the extraction of rice hull flavonoids,the separation of flavonoids from the concentrated crude extract of rice husk by aqueous two-phase system of ethanol/ammonium sulfate was studied.Factors of mass fraction of ammonium sulfate,mass fraction of ethanol,adding amount of crude extract,temperature and pH value on the extraction of flavonoids were investigated by single factor analysis,and the optimum extraction condition was determined by the orthogonal test method with the extraction rate as the index.The results showed that the optimum phase composition was the ethanol mass fraction 29%，ammonium sulfate mass fraction 18%and the amount of crude extract of 3mL at natural pH and 45℃,the extraction rate of flavonoids was up to 96.26%.Therefore,the method is mild and easy to operate,and can be used as an effective method for separating and purifying flavonoids from the crude extract of rice hull.

Rice husk；aqueous two-phase system；flavonoids；ethanol/ammonium sulfate

TS914.1

A

1001-0017（2017）05-0356-04

2017-03-17 *基金項(xiàng)目：泰州市科技支撐計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（編號：SSF20140087）；江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目（編號民：201512106014X）。

蘇學(xué)軍（1974-），男，江蘇泰興人，副教授，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物活性成分的提取與分離研究。