李江,嚴(yán)家俊,綦艷,佘之蘊(yùn),張娟,黃寶瑩,趙玲

(廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(廣東),佛山 528300)

酶聯(lián)免疫法快速檢測(cè)奶粉中的葉酸

李江,嚴(yán)家俊,綦艷,佘之蘊(yùn),張娟,黃寶瑩,趙玲

(廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(廣東),佛山 528300)

建立一種檢測(cè)奶粉中葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酶聯(lián)免疫分析方法.奶粉樣本經(jīng)純水溶解提取,再做1∶4稀釋,通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定奶粉中的葉酸.結(jié)果表明,當(dāng)加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20,40 μg/kg和80 μg/kg時(shí),空白基質(zhì)奶粉中葉酸的提取回收率為93.5%~118.0%;非空白基質(zhì)樣品中葉酸的加標(biāo)回收率為88%~92%;方法檢出限為4 μg/kg;與高效液相色譜法結(jié)果的相對(duì)偏差小于10%.酶聯(lián)免疫法能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)奶粉中的葉酸.

葉酸;酶聯(lián)免疫法;奶粉

0 引言

葉酸,也叫維生素B9,是一種重要的水溶性B族維生素[1],缺乏葉酸會(huì)導(dǎo)致人體產(chǎn)生各種疾病,如孕婦缺乏葉酸會(huì)造成新生兒神經(jīng)管缺陷(NTDs)或無腦等疾病[2-3].目前,《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定嬰幼兒配方乳粉中葉酸限值:一為500~2 500 μg/kg[4].葉酸是人體維持正常生理功能必須的微量物質(zhì),對(duì)孕婦和新生兒也有著特殊的重要性[5],因此建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)分析方法就顯得格外重要.

現(xiàn)葉酸含量多采用紫外分光光度法、熒光法[6-7]、液相色譜法和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等方法[8-9],由于嬰幼兒乳制品中葉酸含量低、基質(zhì)復(fù)雜,定量分析困難;而ELISA法因其檢測(cè)結(jié)果快速準(zhǔn)確,靈敏度高,操作簡(jiǎn)便,可廣泛用于奶粉樣品中葉酸的檢測(cè).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

甲醇(分析純),葉酸標(biāo)準(zhǔn)品.

葉酸檢測(cè)試劑盒,試劑盒的組成:包被有葉酸抗原的酶標(biāo)板、葉酸抗體、酶標(biāo)二抗、葉酸標(biāo)準(zhǔn)品、底物顯色A、B液、終止液和濃縮洗滌液,試劑盒快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定,無需長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng).

MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀,渦旋儀,Thermo高速離心機(jī),微量移液器,Gamp;G電子天平.

奶粉樣本(市售).

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

稱取2.0 g奶粉樣品于50 mL離心管中,加入40 mL純水溶解;于渦旋儀上劇烈振蕩2 min至奶粉充分溶解;取200 μL上述樣品,加入800 μL樣本稀釋液;充分振蕩混勻,取50 μL進(jìn)行分析.

1.2.2 ELISA檢測(cè)樣本中葉酸

將葉酸檢測(cè)試劑盒從冰箱中取出,置于室溫(23~25℃)平衡30~40 min,取出微孔板,將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào);加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50 μL到對(duì)應(yīng)的微孔中,加入葉酸酶標(biāo)物50 μL/孔,再加入葉酸抗試劑50 μL/孔,輕微搖動(dòng)混勻,置室溫避光反應(yīng)30 min;反應(yīng)時(shí)間結(jié)束,小心揭開膜,將微孔內(nèi)液體甩干,用洗滌液300 μL/孔,充分洗滌5次,每次間隔15 s,然后在吸水紙上拍干;加入底物顯色A液50 μL/孔,再加入底物顯色B液50 μL/孔,輕輕搖動(dòng)混勻,置室溫避光反應(yīng)15 min;反應(yīng)時(shí)間結(jié)束,加入終止液50 μL/孔,在雙波長(zhǎng)450/630 nm處測(cè)定每孔OD值.

1.3 定量分析方法

采用試劑盒專用的分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,該試劑盒靈敏度為0.003 μg/kg,變異系數(shù)小于10%.最終檢測(cè)結(jié)果以實(shí)際測(cè)定的吸光度值與稀釋倍數(shù)換算后得出.

2 結(jié)果與分析

2.1 加標(biāo)回收率結(jié)果

對(duì)加標(biāo)后的空白基質(zhì)奶粉(加標(biāo)濃度分別為20.0,40.0 μg/kg和80.0 μg/kg)按照試劑盒操作方法提取、稀釋、測(cè)定(雙孔雙平行),計(jì)算出葉酸加標(biāo)回收率的結(jié)果(見表1).由表1可知,加標(biāo)回收率結(jié)果在93.5%~118.0%,說明該方法適用于奶粉中葉酸的測(cè)定.

表1 空白基質(zhì)樣品加標(biāo)回收率結(jié)果(n=6)

2.2 進(jìn)一步增大稀釋比例結(jié)果

為使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確,在提取比例1∶20不變條件下對(duì)提取后的稀釋比例進(jìn)一步分析、優(yōu)化,考慮方法檢出限不能過高的原因,因此選取1∶4,、1∶6和1∶9(體積比)三個(gè)稀釋比例,的檢測(cè)結(jié)果,由結(jié)果可知三個(gè)稀釋比例條件下回收率都在可接受的范圍內(nèi)(見表2),本研究方法選用1∶4比例稀釋,樣本檢測(cè)結(jié)果見表3.

2.3 方法檢出限

用試劑盒分別檢測(cè)6份采用液相色譜方法測(cè)定為陰性的樣本,計(jì)算樣本中葉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù),方法的檢出限等于陰性空白樣本的檢測(cè)平均值加上陰性樣本檢測(cè)濃度的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差,檢測(cè)結(jié)果如表4所示.

表2 進(jìn)一步增加稀釋比例的回收率結(jié)果(n=6)

表3 樣本檢測(cè)結(jié)果

表4 方法檢出限的結(jié)果(n=6)

2.4 結(jié)果與液相方法比較

為確定研究方法的準(zhǔn)確性,選取已知濃度的5個(gè)奶粉樣本與液相檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較(表5).由表5結(jié)果可以看出,試劑盒法與液相法符合率在91.4%~107.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%,說明該方法能夠?qū)δ谭壑腥~酸進(jìn)行定量檢測(cè).

表5 試劑盒方法與液相方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

3 結(jié)論

建立了一種對(duì)奶粉中葉酸進(jìn)行檢測(cè)的酶聯(lián)免疫分析方法,通過對(duì)整個(gè)檢測(cè)體系的優(yōu)化,用純水1∶20提取,再以1∶4水稀釋,方法靈敏度高,精密度均小于10%,與液相檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%,檢測(cè)效率高、實(shí)驗(yàn)周期短、為進(jìn)一步探究其他食品中葉酸的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ).

[1]文小青,楊月欣.食物中維生素A、葉酸和維生素E分析方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2004,16(1):65-70.

[2]劉莉治,羅曉燕,周洪偉,等.高效液相柱后衍生法測(cè)定嬰幼兒食品中的葉酸[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,17(7):1179-1180.

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[4]GB 14880-2012食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S]2012.

[5]羅敏婷,吳克剛,黃偉乾,等.嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品中葉酸的測(cè)定方法[J].食品與機(jī)械,2016,32(9):34-38.

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Rapid detection of folic acid in milk powder by enzyme linked immunosor bent assay

LI Jiang,YAN Jiajun,QI Yan,SHE Zhiyun,ZHANG Juan,HUANG Baoying,ZHAO Ling
(Guangdong Testing Institute for Product Quality Supervision,China National Quality Supervision and Testing Center for Foods,Foshan 528300,China)

To establish a method for the detection of folic acid in milk powder by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Milk pow?der was extracted with pure water and processed with 1∶4 dilution,and then the content of folic acid in samples was determined by ELISA.When the spiked concentrations were 20,40 μg/kg and 80 μg/kg,the recoveries of folic acid in blank milk powder were 93.5%~118.0%;the recoveries of folic acid in milk powder were 88%~92%;the limit of detection was 4 μg/kg.Compared with the high performance liquid chromatography(HPLC)method,the relative standard deviation of result was less than 10%.This method can detect folic acid in milk pow?der quickly and accurately.

folic acid;enzyme linked immunosorbent assay;milk powder

TS252.7

A

1001-2230(2017)10-0037-02

2017-04-07

國(guó)家質(zhì)檢總局項(xiàng)目(2013QK281).

李江(1985-),男,工程師,主要研究方向?yàn)槭称钒踩L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和毒理學(xué)研究.