侯湖平,王 琛,李金融,丁忠義,張紹良,黃 磊,董 健,馬 靜,楊永均

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煤矸石充填不同復墾年限土壤細菌群落結(jié)構(gòu)及其酶活性

侯湖平,王 琛,李金融,丁忠義,張紹良*,黃 磊,董 健,馬 靜,楊永均

(中國礦業(yè)大學環(huán)境與測繪學院,江蘇徐州 221116)

基于徐州市3塊煤矸石充填復墾地(復墾時間分別為2015、2010和2001年)的土壤樣本,采用Illumina PE250測序方法測定微生物群落組分,以未受采煤塌陷影響區(qū)的土壤樣本為對照地,對比分析充填復墾區(qū)細菌群落的垂直結(jié)構(gòu)及其時間變化.結(jié)果表明:(1)與對照地相比,復墾土壤在各個分類水平的細菌種類數(shù)量減少,群落多樣性降低.隨著復墾年限的增加,復墾地與對照地的貼近度越高.(2)厚壁菌門、變形菌門是復墾土壤中門水平的優(yōu)勢菌,厚壁菌門在復墾土壤中優(yōu)勢地位上升,有從20~40cm土層向0~20cm土層轉(zhuǎn)移的趨勢.(3)芽孢桿菌綱在綱水平占絕對優(yōu)勢,在復墾土壤0~20cm土層中的數(shù)量多于對照土壤,在復墾土壤20~40cm土層的數(shù)量隨年限增加而減少.(4)乳桿菌目、芽孢桿菌目在目水平是優(yōu)勢菌,除硫單胞菌目對重金屬污染修復有重要作用,然而在復墾土壤的0~20cm土層中的數(shù)量比正常農(nóng)田土壤少74.81%~99.59%.(5)芽孢桿菌科、腸球菌科、鏈球菌科是科水平的優(yōu)勢菌,芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬是屬水平的優(yōu)勢菌,芽孢桿菌屬-JH7、屎腸球菌、乳球菌屬-piscium是種水平的優(yōu)勢菌,3大類在復墾土壤中的數(shù)量比例大于正常農(nóng)田,且在0~20cm土層中的差別更明顯,在復墾土壤的20~40cm土層的數(shù)量隨年限增加而減少.(6)脫氫酶活性與厚壁菌門下的多種細菌的數(shù)量呈顯著負相關(guān),與放線菌門的數(shù)量呈顯著正相關(guān),與γ-變形菌綱的數(shù)量呈極顯著正相關(guān).隨著復墾年限的增加,土壤優(yōu)勢菌群的類型沒有變化,但是數(shù)量結(jié)構(gòu)在變化.厚壁菌門在缺水和極端環(huán)境下適合生長,變形菌門有助于土壤氮素以及能量的循環(huán).采用微生物修復技術(shù),調(diào)整土壤細菌群落結(jié)構(gòu),可以改善土壤質(zhì)量,縮短土壤恢復年限.

煤矸石充填復墾；微生物群落；細菌群落；復墾年限；徐州礦區(qū)

煤炭資源開發(fā)在促進經(jīng)濟發(fā)展的同時,對生態(tài)環(huán)境也產(chǎn)生巨大的負效應(yīng),煤矸石堆積與土地沉陷是其中的問題之一.煤矸石充填復墾是處理煤矸石問題之一,它是以煤矸石為充填物并在上面填充土壤,使其土地達到可供利用狀態(tài)的復墾模式.該模式一方面解決煤矸石壓占土地的問題,另一方面,降低煤矸石對大氣、土壤和水等造成的一定程度污染,在我國被廣泛應(yīng)用[1].但是,復墾后的農(nóng)田與未受采煤塌陷的正常農(nóng)田相比,土壤理化性質(zhì)和土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)特征發(fā)生變化[2-4],進而影響著復墾后耕地的質(zhì)量.土壤細菌群落結(jié)構(gòu)特征和變化規(guī)律能夠反映礦區(qū)復墾土壤微生物群落多樣性和生態(tài)功能,反應(yīng)土壤復墾水平和質(zhì)量[5-8].

國內(nèi)外學者對礦區(qū)復墾土壤中的微生物進行研究,主要有以下幾個方面:一是針對復墾土壤微生物的生物量及其數(shù)量進行研究,分析復墾前后不同復墾年限、不同植被模式下土壤細菌、真菌、放線菌的生物量及其數(shù)量變化[10-13].二是對復墾土壤中細菌群落多樣性的研究,包括不同復墾年限煤矸石填埋場的土壤微生物特性[3],對不同復墾植被類型和復墾年限對土壤細菌群落多樣性的影響[14],土壤pH值變化對復墾土壤細菌群落多樣性以及細菌門結(jié)構(gòu)特征的影響[15].三是對細菌群落結(jié)構(gòu)中優(yōu)勢菌群的研究,諸如中國東部礦區(qū)不同復墾植被類型和不同復墾時間土壤細菌的優(yōu)勢菌及其多樣性[16],我國準格爾地區(qū)煤礦不同復墾時間土壤細菌組成及其多樣性的變化[17].四是對復墾土壤中微生物量和土壤養(yǎng)分的相關(guān)性研究,諸如昆陽磷礦不同年限和不同植被的礦山恢復土壤的理化性狀和微生物的相關(guān)性[18],研究采石場不同開采模式和土壤恢復模式對土壤微生物群落的活性、生物量和遺傳結(jié)構(gòu)的影響[5].這些研究多針對復墾土壤中的微生物活動情況,但是對于煤矸石充填復墾土壤中細菌群落的研究不夠深入.本研究以徐州不同復墾年限的煤矸石復墾地為研究對象,研究復墾區(qū)土壤0~20cm和20~40cm深度的土壤樣本,采用Illumina PE250測序方法,測定土樣中細菌門、綱、目、科、屬、種6個水平的序列數(shù),研究煤矸石充填復墾土壤細菌群落的結(jié)構(gòu)、多樣性及其酶活性,目的在于分析煤矸石充填復墾地不同復墾年限土壤細菌群落的變化特征,為采用微生物修復措施提高復墾地質(zhì)量提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于江蘇省徐州市西北部的煤礦開采區(qū),屬于華東高潛水位平原區(qū),屬暖溫帶半濕潤季風氣候區(qū),四季分明.年氣溫13.8℃,年日照時數(shù)為2284~2495h,日照率為52%~57%,年均無霜期200~220d,年均降水量800~930mm,年均濕度72%.氣候資源豐富,適宜農(nóng)作物生長,為我國華東地區(qū)重要糧食產(chǎn)區(qū).該區(qū)域正常水旱輪作地的地下水位在(0.80±0.20)m,正常旱地地下水位在1.0m以下.受采煤影響,研究區(qū)復墾前最大沉陷量1~1.5m,最小沉陷量0.6m,平均沉陷量1.1m,大部分塌陷地出現(xiàn)積水,農(nóng)田絕產(chǎn).

煤矸石充填前,首先將積水清理,然后表土層剝離,采用統(tǒng)一矸石分層振壓回填復墾,充填煤矸石4.6m,壓實度為85%,覆土厚度為50cm.經(jīng)檢測,煤矸石有毒元素的平均含量分別為:Hg為0.104mg/kg(標準值為0.15mg/kg),Cd為0.086mg/ kg(標準值為0.2mg/kg),Pb為29.73mg/kg(標準值為35mg/kg),As為9.25mg/kg(標準值為15mg/kg),該含量均符合我國土壤的可接受水平[19].

在研究區(qū)內(nèi)選取3塊不同復墾年限的煤矸石充填復墾地,并在每塊復墾地附近1km以內(nèi)選取未受采煤塌陷影響的正常農(nóng)田作為對照地,對照地與復墾地具有相同的種植作物種類和施肥管理方式.第1塊復墾地S(116°48′44″E, 34°48′47″N),復墾年限為1年,對照地SC (116°48′36″E,34°48'25″N);第2塊復墾地M (117°23′48″E,34°21'25″N),復墾年限為6年,對照地MC(117°23′36″E,34°21′05″N);第3塊復墾地L(117°08′22″E,34°25' 24″N),復墾年限為15年,對照地LC(117°08′33″E,34°25'25″N).復墾地和對照地的地面作物以種植玉米和大豆為主,一年兩熟制,作物長勢良好.土壤以黃河沖積物為其母質(zhì)發(fā)育而成,土壤類型為普通褐土,土壤pH6~7呈弱酸性,土壤電導率為652.1~664.3μS/cm,屬于正常的鹽分濃度范圍.

1.2 土壤樣本采集

采樣時間為2016年6月.每塊樣地以S型采樣,利用無菌取土器取0~20cm和20~40cm深度的土壤樣品各約1kg,共采樣12個點,每個點取樣取5次重復,然后混合作為樣本.將一部分新鮮土樣研磨過2mm篩后,置于-20℃冰箱中保存待用,3d內(nèi)進行土壤微生物指標分析;另一部分土樣進行自然風干,研磨處理,過0.149mm篩后,用于土壤理化性質(zhì)和酶活性指標分析.

1.3 土壤細菌的16S rRNA 基因測序

1.3.1 DNA提取和PCR擴增 利用E.Z.N. A.Soil DNA試劑盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)提取12個土壤樣本DNA.針對細菌的16S rRNA的V4-V5區(qū)進行PCR擴增.使用的兼并引物為:515F 5’-barcode-GTGCCAGCMGC- CGCGG)-3’和907R 5’-CCGTCAATTCMTTT- RAGTTT-3’.PCR,擴增程序如下:95℃預變性2min,隨后95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共25個循環(huán);最后72℃最終延伸5min結(jié)束. PCR反應(yīng)在一式3份的20μL含有4μL 5×FastPfu緩沖液,2μL 2.5m dNTP,0.8μL每種引物(5μmol/ L),0.4μL FastPfu聚合酶和10ng模板DNA的混合物中進行.從2%瓊脂糖凝膠中提取擴增子,并利用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences,Union City,CA,U.S.)進行純化,并使用QuantiFluor TM-ST(Promega,U.S.)進行定量.實驗過程中,每個樣本進行3個重復.

1.3.2 文庫的構(gòu)建及測序 純化的PCR產(chǎn)物通過Qubit?3.0(Life Invitrogen)定量,并且序列不同的每12個擴增子混合均勻.在Illumina的基因組DNA文庫制備程序之后,將匯集的DNA產(chǎn)物用于構(gòu)建Illumina Pair-End文庫.然后根據(jù)標準方案在Illumina MiSeq平臺(上海BIOZERON有限公司)上對擴增子文庫進行配對終點測序(2×250).原始讀取存儲在NCBI序列讀取存檔(SRA)數(shù)據(jù)庫中.

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 原始數(shù)據(jù)處理與樣本序列數(shù)目統(tǒng)計 使用QIIME(1.17版本)對原始fastq文件進行質(zhì)量過濾:在任何平均質(zhì)量評分小于20的位點,在10bp滑動窗口上截斷250bp讀數(shù),丟棄短于50bp的截斷讀數(shù).精確條碼匹配,引物匹配中的2個核苷酸不匹配,去除包含模糊字符的讀數(shù).根據(jù)重疊序列僅組裝長度大于10bp的序列,無法組裝的讀數(shù)被丟棄.使用UPARSE(版本7.1)將操作單位(OTU)聚類為具有97%的相似性截斷,并使用UCHIME鑒定和去除嵌合序列.通過使用70%的置信閾值的RDP分類器[20],對silva(SSU123)16S rRNA數(shù)據(jù)庫分析每個16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)生親緣關(guān)系.

1.4.2 生物信息學分析 基于Mothur v.1.21.的分析[21],計算Shannon和Chao多樣性指數(shù)[22].使用UniFrac進行β多樣性分析[23],比較使用群落生態(tài)包R-forge的主成分分析(PCA)的結(jié)果,使用SPSS(ver.22.0)軟件通過平均連結(jié)的聚類技術(shù)對從RDP分類器獲得的門進行聚類,利用基于Spearman的方法計算相關(guān)性系數(shù),用OriginPro (ver.9.0)進行繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 復墾地與對照地土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的對比分析

2.1.1 細菌群落多樣性分析 由表1可知,復墾土壤中細菌群落在各個分類水平的細菌種類數(shù)量都少于對照地,但是在不同復墾年限中,細菌種類數(shù)量的變化規(guī)律性不強.細菌群落多樣性和物種豐富度降低,Shannon、Chao指數(shù)(圖1)在0~20cm土層中復墾地比對照地降低33.39%~ 66.94%和34.75%~85.32%,在20~40cm土層中復墾地比對照地降低13.41%~65.62%和12.43%~ 84.80%.可見,經(jīng)過煤炭資源開采、土地塌陷、煤矸石充填復墾工程等嚴重擾動后,土壤細菌群落在1年內(nèi)立即產(chǎn)生響應(yīng),煤矸石充填復墾后的土壤細菌群落的數(shù)量減少,直到復墾15年后細菌群落多樣性仍未完全恢復,并且在0~20cm深度比在20~40cm深度的變化更劇烈.隨著復墾年限增加,20~40cm土層的群落多樣性指數(shù)增加,因為隨著時間的推移,微生物生存環(huán)境不斷改善,細菌群落多樣性呈現(xiàn)變好的趨勢.

表1 樣本中的細菌種類數(shù)

圖1 97%相似度水平下不同土層的細菌群落Chao、Shannon指數(shù)

采用行聚類分析法對12個樣本的土壤細菌群落在門水平的序列數(shù)進行聚類,結(jié)果如圖2所示.當聚類分為2類時,分別為復墾地樣本S、M、L聚為一類,SC、MC、LC樣本聚為一類,說明了復墾土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和對照土壤細菌結(jié)構(gòu)之間的差異明顯.

2.1.2 土壤優(yōu)勢菌分析 在復墾土壤中,各樣本中占主要數(shù)量比例的細菌序列數(shù)統(tǒng)計見表2.從物種組成來看,復墾地與對照地比較,復墾細菌群落構(gòu)成相對簡單,呈現(xiàn)物種數(shù)量少,豐富度低.本結(jié)論和Poncelet等[2]、馬守臣等[3]、李媛媛等[24]、錢奎梅等[25]的結(jié)果類似.可見,礦區(qū)經(jīng)過煤矸石充填復墾工程擾動后,土壤生態(tài)環(huán)境受到嚴重影響,土壤微生物多樣性有降低的趨勢.但是,隨著復墾年限的增加,植物生長導致土壤有機質(zhì)含量上升,為微生物的生長和繁殖提供有利條件,復墾土壤的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)會有提高的趨勢,這一結(jié)論與樊文華等[13]、錢奎梅等[25]對不同復墾年限對土壤微生物多樣性的影響研究一致.隨著復墾年限的增加,復墾土壤中的細菌優(yōu)勢菌種不變,都是以厚壁菌門和變形菌門為主,但是數(shù)量比例略有變化.

圖2 不同樣本細菌群落聚類

表2 土壤中主要細菌的序列數(shù)

在門水平,復墾土壤和對照土壤中的優(yōu)勢菌均為厚壁菌門和變形菌門,二者在復墾土壤中共占87.56%~93.96%,在對照土壤中共占64.22%~ 69.37%.在綱的水平上,芽孢桿菌綱占絕對優(yōu)勢,在復墾土壤中相對豐度為64.55%~76.24%,然而在對照地土壤中為25.01%~35.25%.在目水平上,乳桿菌目、芽孢桿菌目共占64.55%~75.84%.在科水平上,復墾土壤中的芽孢桿菌科腸球菌科鏈球菌科共占58.75%~69.70%.在屬水平上,復墾土壤的芽孢桿菌屬腸球菌屬乳球菌屬共占57.65%~68.37%.在種水平上,芽孢桿菌屬-JH7、屎腸球菌乳球菌屬-piscium是優(yōu)勢菌種,在數(shù)量上共占54.79%~65.12%.

復墾土壤中幾乎所有細菌門的數(shù)量比對照地少,但是厚壁菌門在復墾土壤中的數(shù)量比例大于對照地土壤,在復墾土壤0~20cm和20~40cm土層中的數(shù)量分別比對照地土壤多155.96%~ 614.01%和4.06%~241.73%.厚壁菌門有從20~ 40cm土層向0~20cm土層轉(zhuǎn)移的趨勢.芽孢桿菌綱屬于厚壁菌門,在復墾地中的數(shù)量大于對照地,在0~20cm土層中的數(shù)量比對照地多191.04%~ 764.03%,差別更明顯,其在復墾土壤的20~40cm土層的數(shù)量隨年限增加而減少.乳桿菌目、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、腸球菌科、鏈球菌科、類芽孢桿菌科屬于芽孢桿菌綱,在復墾地中的數(shù)量大于對照地,在0~20cm土層中的差別更明顯,復墾土壤中的數(shù)量分別比對照地多197.27%~ 826.72%、147.74%~703.36%、159.92%~751.21%、202.10%~812.17%、194.24%~846.47%、113.73%~536.51%.屬和種水平,厚壁菌門下的芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬-JH7、屎腸球菌、乳球菌屬-piscium均有同樣的分布特征,在復墾地的數(shù)量大于對照地,在0~ 20cm土層中的差別更明顯,復墾土壤中的數(shù)量分別比對照地多173.06%~754.78%、202.10%~ 812.17%、194.24%~846.47%、197.46%~765.10%、202.10%~812.17%、197.63%~45.74%.上述細菌目、科、屬、種在復墾土壤的20~40cm土層的數(shù)量均隨年限增加而減少.

變形菌門下的-變形菌綱、-變形菌綱、-變形菌綱在復墾土壤中數(shù)量均小于對照地,分別少13.02%~34.04%、3.42%~98.54%、3.14%~ 97.52%.-變形菌綱下的腸桿菌目、腸桿菌科在復墾地中的數(shù)量大于對照地,在0~20cm土層中的差別更明顯,復墾土壤中的數(shù)量分別比對照地多162.79%~756.89%和162.79%~181.96%.-變形菌綱下的除硫單胞菌目在復墾地中的數(shù)量比對照地少34.39%~98.84%,在研究區(qū)復墾土壤中的含量低于正常水平.

放線菌門作為高G+C革蘭氏陽性菌,能促使土壤中的動物和植物遺骸腐爛.而在研究區(qū)的復墾地土壤中,20~40cm土層的數(shù)量比對照地少19.18%~97.04%.

2.2 不同復墾年限土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的對比

通過分析不同樣本OTU(97%相似性)組成,對3組樣地的土壤細菌群落數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA),不同環(huán)境間的樣本表現(xiàn)出分散或聚集的分布情況(圖3).PC1軸的可信度為97.12%, PC2軸的可信度為1.01%,累計貢獻率達98.13%.在PC1軸上,復墾地土壤樣本與對照地土壤樣本從PC1的0值位置顯著分離,表明煤矸石充填復墾后土壤細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化,此結(jié)果與不同樣品間的聚類分析結(jié)果一致.同時,不同復墾年限對土壤微生物的影響差異在PC1軸和PC2軸上均有較好的體現(xiàn),復墾地樣本L和LC距離最遠,M和MC樣本次之,S和SC樣本距離最近,表明隨著時間的推移,復墾土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)組成會逐漸發(fā)生變化,與對照地土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)將偏離正常土壤的水平.

圖3 土壤樣本主成分分析

2.3 細菌群落優(yōu)勢菌和脫氫酶的相關(guān)性分析

土壤酶在土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化過程中有重要作用[26].土壤酶活性能表征土壤的綜合肥力特征及土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化進程[27-29].已有研究表明,土壤酶和土壤微生物之間存在相互促進和制約的復雜關(guān)系[30].由于作物和微生物的分泌物及對其殘體的分解物是土壤酶的主要來源,增加土壤中微生物的含量,有利于提高土壤的酶活性,土壤酶與土壤細菌的相互作用能夠推動土壤有機質(zhì)的礦化分解和養(yǎng)分循環(huán)轉(zhuǎn)化.因此,土壤酶活性能夠敏感地反映土壤微生物的活性狀況,在復墾土壤中起到重要的生態(tài)指示作用.本研究中測得土壤中脫氫酶活性(圖4),在復墾土壤和對照土壤中,脫氫酶活性均表現(xiàn)出0~20cm土層的含量大于20~40cm土層,在復墾土壤中多出1.62%~9.43%,在對照土壤中多出4.35%~17.49%,土壤脫氫酶含量在不同土層的分布上總體呈現(xiàn)出隨土壤深度的增加而遞減的規(guī)律.用復墾樣本數(shù)據(jù)除以對照樣本,得到的百分數(shù)可以表示復墾地土壤相比對照土壤的貼近度.經(jīng)過計算,0~ 20cm土層的S、M、L樣本的貼近度分別為83.76%、86.05%、89.57%,呈現(xiàn)L>M>S的規(guī)律.此數(shù)據(jù)表明,采煤塌陷與復墾工程改變了土壤脫氫酶活性及其分布,隨著復墾年限增加,土壤脫氫酶活性正逐步恢復到正常土壤.20~40cm土層的S、M、L樣本的貼近度分別為89.93%、88.31%、91.98%,說明復墾年限的變化對20~40cm的土層酶活性沒有明顯的影響.

圖4 土壤樣品中脫氫酶含量

土壤脫氫酶的活性能表征土壤微生物的氧化能力,可以作為微生物氧化還原系統(tǒng)的指標[31].細菌群落優(yōu)勢菌和脫氫酶的相關(guān)性見表3,土壤中脫氫酶活性與厚壁菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目、芽孢桿菌目,芽孢桿菌科、鏈球菌科、腸球菌科、芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬-JH7、屎腸球菌和乳球菌屬-piscium成顯著負相關(guān),與放線菌門成顯著正相關(guān),和γ-變形菌綱成極顯著正相關(guān),說明土壤中脫氫酶活性與土壤中細菌數(shù)量有密切的關(guān)系,脫氫酶活性可作為判斷細菌群落結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化的指標之一.其原因在于部分土壤微生物體內(nèi)的脫氫酶通過催化生物氧化還原反應(yīng),而后經(jīng)過氧化磷酸化作用生成腺苷三磷酸(ATP),以作為異養(yǎng)生物能量的主要來源,該類土壤細菌得以生存.

注:*、**分別代表差異達到極顯著(<0.01)、顯著(<0.05)水平.

3 討論

根據(jù)Shannon指數(shù)和Chao指數(shù),將復墾樣本數(shù)據(jù)除以對照樣本計算貼近度,表征復墾地土壤相比正常農(nóng)田土壤的生物多樣性的貼近程度.在0~20cm土層,S、M、L樣本的Shannon指數(shù)貼近度分別為66.61%、65.04%、33.06%,Chao指數(shù)的貼近度分別為54.88%、65.25%、14.69%,說明在0~20cm深度的土層,隨著復墾年限增加,煤矸石充填復墾土壤的細菌群落多樣性和物種豐富度會偏離正常農(nóng)田的水平.在20~40cm土層,S、M、L樣本的Shannon指數(shù)貼近度分別為60.74%、34.38%、86.59%,Chao指數(shù)的貼近度分別為44.87%、15.20%、87.57%,數(shù)值雖有波動,但是值得注意的是,復墾15年的20~40cm深度的樣本中,細菌群落多樣性和物種豐富度已經(jīng)與正常農(nóng)田的水平十分接近.

從不同分類水平上對土壤微生物優(yōu)勢菌進行分析,厚壁菌門、變形菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、腸球菌科、鏈球菌科、芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬-JH7、屎腸球菌、乳球菌屬-piscium是研究區(qū)煤矸石充填復墾土壤中的優(yōu)勢菌(表2).這與陳來紅等[16]對露天煤礦區(qū)復墾多樣性的研究結(jié)果類似.而李媛媛等[24].對采煤塌陷區(qū)泥漿泵復墾的研究發(fā)現(xiàn),土壤細菌主要由變形菌、放線菌、浮霉菌、酸桿菌、綠彎菌、擬桿菌、芽單胞菌、厚壁菌和硝化螺旋菌組成,且復墾的效果優(yōu)于本研究區(qū),這可能由于復墾方式和農(nóng)田耕作方式的不同引起的差異,說明復墾方式對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響顯著,也說明土壤微生物對生態(tài)環(huán)境變化十分敏感.計算優(yōu)勢菌的貼近度,結(jié)果見表4:厚壁菌門以及厚壁菌門下屬的芽孢桿菌綱、乳桿菌目、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、鏈球菌科、腸球菌科、芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬-JH7、屎腸球菌、乳球菌屬- piscium等的貼近度基本呈現(xiàn)樣本SM>L的規(guī)律,說明在煤矸石充填復墾土壤的演替過程中,變形菌門在減少.而在20~40cm土層中,優(yōu)勢菌的相對豐富度隨著復墾年限的增加有波動規(guī)律,因此0~20cm土層中的細菌群落結(jié)構(gòu)比20~40cm土層中的細菌群落更容易受人為擾動或時間推演而發(fā)生變化.

不同復墾年限土壤細菌的演替是有差異的,在不同復墾年限,土壤生態(tài)系統(tǒng)優(yōu)勢菌群的比例在不斷發(fā)生變化.在0~20cm土層的復墾土壤中,厚壁菌門的相對豐度隨著復墾年限增加而增加,在復墾15年的樣本中厚壁菌門占絕對優(yōu)勢,相對豐度高達93.83%.厚壁菌門中主要的細菌目、細菌科、細菌屬在復墾土壤中的數(shù)量比例會大于正常農(nóng)田土壤,說明厚壁菌門有特殊的生理結(jié)構(gòu),多數(shù)菌種能通過形成孢子適應(yīng)礦區(qū)缺水和極端環(huán)境,因此對于采煤塌陷地的生態(tài)修復、土壤生態(tài)系統(tǒng)的重建有重要意義.芽孢桿菌屬具有耐高熱、低溫、輻射等抵抗極端環(huán)境的能力,并去除土壤中的重金屬污染,是一種環(huán)境友好型生物農(nóng)藥[32].類芽孢桿菌的菌株具有抗性強、固氮、抑菌等優(yōu)良特性,可以作為促生菌劑促進植物生長[33].芽孢桿菌屬-JH7具有耐堿耐熱性[34],屎腸球菌長速快,有較好的黏附能力,能產(chǎn)生乳酸及一些抗菌物質(zhì)[35],可用作益生菌制劑.因此上述幾種菌能與經(jīng)過復墾工程后發(fā)生改變的生態(tài)系統(tǒng)相適應(yīng),能改良土壤環(huán)境,改善養(yǎng)分相對貧瘠的復墾土壤,表現(xiàn)出復墾后土壤質(zhì)量提升的目的.賀龍等[14]也有同樣的研究結(jié)果,其研究認為,露天煤礦復墾土壤的優(yōu)勢菌群多為化能自養(yǎng)或化能異養(yǎng)型細菌或參與氮循環(huán)、或降解多環(huán)芳烴類有機物等有利于污染土壤的生態(tài)修復和土壤肥力恢復的功能細菌屬,能在營養(yǎng)貧瘠的環(huán)境下生長繁殖,這對于復墾土壤肥力恢復具有重要作用,尤其是對露天煤礦的土壤修復、生態(tài)系統(tǒng)改善具有重要的利用價值.變形菌門以及變形菌門下的-變形菌綱、-變形菌綱、-變形菌綱、除硫單胞菌目的數(shù)量變化和厚壁菌門相反,在0~20cm土層中隨著年限增加而減少,在20~ 40cm土層中隨著年限增加而增加,因此有向下層土壤轉(zhuǎn)移分布的趨勢.變形菌門是革蘭氏陰性菌,是細菌中數(shù)量最多、可培養(yǎng)細菌最多、代謝多樣性最高的門.變形菌門在維持土壤生態(tài)系統(tǒng)功能中扮演著重要的角色,為整個系統(tǒng)的氮素以及能量的循環(huán)提供幫助,對農(nóng)業(yè)有重要意義的菌種,可以有效提高土壤的質(zhì)量.放線菌門菌群能促使土壤中的動物和植物遺骸腐爛,對有機物的礦化有著重要作用.在土壤中增加放線菌,有利于土壤中有機質(zhì)的增加,提高土壤養(yǎng)分,改良土壤,促進植被生長.而本研究復墾土壤中的含量低于正常水平,說明煤矸石充填復墾土壤的修復能力低于正常農(nóng)田土壤,在今后的土地復墾中可適量培育放線菌門,以增加土壤的自身修復能力,以達到改善土壤質(zhì)量的目的.通過對比復墾地和對照地的細菌群落特征,0~20cm土層中的細菌群落結(jié)構(gòu)比20~40cm土層中的細菌群落更容易受人為擾動或時間推演而發(fā)生變化,同時,發(fā)現(xiàn)土壤生態(tài)系統(tǒng)不穩(wěn)定的復墾地中缺少某些有益菌,通過增施生物有機肥或特定的微生物肥,調(diào)節(jié)土壤環(huán)境微生態(tài),使土壤中有機質(zhì)和有益細菌數(shù)量增加,加速土壤細菌群落演替的速度和土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定,這對于指導土壤復墾具有重要的理論指導意義.

表4 土壤樣本優(yōu)勢菌序列數(shù)的貼近度(%)

土壤酶活性與微生物數(shù)量之間有密切的關(guān)系,采煤塌陷與復墾工程改變了脫氫酶活性的垂直分布特征,土壤脫氫酶含量在垂直分布上總體呈現(xiàn)出隨土層深度的增加而遞減的規(guī)律.這與相關(guān)文獻的研究結(jié)果相一致,李智蘭等[31]認為這是土壤酶活性的表聚性.這可能是因為0~20cm土層中植物根系發(fā)達,植物殘體以及土壤微生物數(shù)量較多,使得土壤養(yǎng)分含量高,脫氫酶作用的底物多.脫氫酶活性隨復墾年限變化呈現(xiàn)不同的分布特征,且與土壤細菌群落的主要菌種有顯著相關(guān)關(guān)系.脫氫酶活性與厚壁菌門下的多種細菌的數(shù)量呈顯著負相關(guān),與放線菌門的數(shù)量呈顯著正相關(guān),與-變形菌綱的數(shù)量呈極顯著正相關(guān).可能是因為復墾土壤與正常農(nóng)田土壤有不同的養(yǎng)分結(jié)構(gòu),致使土壤細菌群落有不同的響應(yīng),生物體內(nèi)的酶活性隨之發(fā)生變化.酶活性越強,生物化學反應(yīng)越強烈,則生化反應(yīng)產(chǎn)物越多,對于體內(nèi)含有較多脫氫酶的細菌來說,其數(shù)量越多;體內(nèi)含有較多脫氫酶的細菌的數(shù)量越多,則土壤中脫氫酶的活性越高,因此這種細菌的數(shù)量與脫氫酶活性是相互促進發(fā)展的協(xié)同關(guān)系,能共同反映土壤細菌群落的結(jié)構(gòu)及變化趨勢,故可作為評價復墾土壤肥力的指標,為改良復墾土壤質(zhì)量提供理論依據(jù)[36-37].諸如孟會生等[8]研究認為,復墾土壤主要的變形菌門與Olsen-P、堿性磷酸酶有很高的相關(guān)性,將細菌群與酶活性建立聯(lián)系,細菌可作為土壤磷有效性的靈敏性指標.土壤微生物和土壤環(huán)境是相互作用相互影響,揭示土壤微生物群落和土壤理化性質(zhì)的關(guān)系,建立土壤質(zhì)量和土壤微生物的監(jiān)測指標,更有助于提高礦區(qū)土壤質(zhì)量.

4 結(jié)論

4.1 與未受采煤塌陷影響的正常農(nóng)田土壤相比,復墾土壤在各個分類水平的細菌種類數(shù)量減少,群落多樣性降低,脫氫酶活性降低.復墾土壤和對照土壤的優(yōu)勢菌群種類一致,但是優(yōu)勢菌群的序列隨著復墾年限不同發(fā)生變化.

4.2 厚壁菌門、變形菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、腸球菌科、鏈球菌科、芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬-JH7、屎腸球菌、乳球菌屬-piscium是研究區(qū)煤矸石充填復墾土壤中的優(yōu)勢菌.

4.3 采煤塌陷改變了脫氫酶活性的垂直分布特征,并且隨復墾年限變化呈現(xiàn)不同的分布特征.土壤中脫氫酶活性可以間接反應(yīng)某種細菌的數(shù)量特征,脫氫酶活性與厚壁菌門下的多種細菌的數(shù)量呈顯著負相關(guān),與放線菌門的數(shù)量呈顯著正相關(guān),與-變形菌綱的數(shù)量呈極顯著正相關(guān).

4.4 復墾過程中,細菌作為生態(tài)演替過程中的先鋒種群,對于復墾土壤質(zhì)量恢復具有重要作用.例如厚壁菌門、芽孢桿菌、類芽孢桿菌、Bacillus sp. JH7等是有益于改良土壤環(huán)境的功能菌,能抵抗惡劣生存環(huán)境的有益菌,因而在復墾土壤中占有較大的數(shù)量優(yōu)勢,可以采用增加微生物菌的數(shù)量來改善養(yǎng)分貧瘠的復墾土壤.

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致謝：感謝上海BIOZERON有限公司在土壤樣品基因測序和分析方面的幫助,感謝蔡延江副教授對本論文英文潤色的幫助.

Variation of bacterial community structure and enzyme activities in reclaimed soil filled with coal gangues along a relamation chronosequence.

HOU Hu-ping, WANG Chen, LI Jin-rong, DING Zhong-yi, ZHANG Shao-liang*, HUANG Lei, DONG Jian, MA Jing, YANG Yong-jun

(School of Environment Science & Spatial Informatics, China University of Mining and Technology, Xuzhou 221116, China)., 2017,37(11)：4230~4240

In this study, soil samples from the reclaimed land filled with coal gangue (SS) with different reclamation years (2015, 2010, and 2001 years) in Xuzhou mining area and from normal farmlands which were not affected by coal mining subsidence (SSC) were collected. The sequence numbers of bacterial community were determined by the Illumina PE250sequencing method, and the vertical structure and time structure were analyzed. The results showed that: (1) Reclamation decreased the number of bacteria species and the community diversity, but the goodness between SS and SSC increased with the age of reclamation. (2)anddominated in SS at the phylum level, the number ofincreased after reclamation andalso likely transferred from 20~40cm to 0~20cm soil layer. (3)predominantly existed in soils at the class level, the number ofin 0~20cm soil layer was higher in SS than in SSC samples, and the number in 20~40cm soil layers of SS samples decreased with the increase of the reclamation years. (4)anddominated in SS at the order level.played an important role in the remediation of heavy metal pollution and its number in 0~20cm soil layer of SS was 74.81~99.59% less than that in SSC samples. (5) In SS samples,,andwere the dominant family, while,andwere the dominant genus, andJH7,andwere the dominant species. All of these in SS samples were less in number than SSC samples especially in 0~20cm soil layer, while the number in 20~40cm soil layer of SS decreased with the increase of the reclamation years. (6)activity was negatively correlated with the number of, but was positively correlated with the number ofand the number of.Also, the type of dominant soil bacteria did not change, but their quantitative structure varied over time. Owing toare suitable for growth in the absence of water and extreme environments, butis conducive to soil nitrogen and energy cycling. Therefore, the soil quality was improved by adjusting soil bacterial community structure and shorten the recovery period.

land reclamation filled with coal gangue；soil microbial community；bacterial community structure；reclamation term；Xuzhou coal-mining areas

X171

A

1000-6923(2017)11-4230-11

侯湖平(1975-),女,山西孝義人,副教授,博士,主要從事煤礦區(qū)土地生態(tài)修復研究.發(fā)表論文80余篇.

2017-04-14

國家自然基金資助項目(51474217);中國礦業(yè)大學大學生創(chuàng)新訓練項目(201610290044)

* 責任作者, 教授, slzhang@cumt.edu.cn