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(浙江工業(yè)大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014)

釀酒酵母不同培養(yǎng)方式和生長階段的代謝組差異分析

孫杰，于欣君，王微，朱有貴，姜杰，汪釗

(浙江工業(yè)大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014)

與液態(tài)發(fā)酵相比，對固態(tài)發(fā)酵過程中酵母生長期轉(zhuǎn)換前后的生理狀態(tài)研究較少.細胞內(nèi)的代謝物組成變化與生理狀態(tài)密切相關.研究了釀酒酵母固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵狀態(tài)下，指數(shù)生長期和二次生長期菌體的胞內(nèi)代謝組差異.結(jié)果表明生長階段的轉(zhuǎn)換伴隨著中心代謝的復雜變化.液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵過程中，分別檢測到了131種和117種不同生長階段的差異代謝物.兩個生長階段的主要代謝差異均反映在蛋白質(zhì)合成、氨基酸代謝和三羧酸循環(huán)等代謝途徑上，與培養(yǎng)方式無關.本研究為進一步闡明不同發(fā)酵方式下酵母的代謝調(diào)控機制奠定了基礎.

釀酒酵母；代謝組分析；固態(tài)發(fā)酵；指數(shù)生長；二次生長

釀酒酵母是研究微生物生理代謝的模式生物[1]，并且廣泛應用于釀酒、面包烘焙和飼料工業(yè)[2]等領域.在生物催化領域也有廣泛的應用[3].在酵母發(fā)酵的初始階段，利用糖作為碳源，細胞迅速生長和分裂，生物質(zhì)得到指數(shù)生長，該階段稱為指數(shù)生長階段.當培養(yǎng)基中碳源為限制因素時，細胞生長速率下降，從發(fā)酵代謝轉(zhuǎn)變?yōu)楹粑x，生長階段轉(zhuǎn)變至二次生長階段，此時細胞開始利用培養(yǎng)基中產(chǎn)生的乙醇作為新的碳源.最終，當營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，細胞進入靜止期，生長停滯，生物量保持恒定[4].固態(tài)發(fā)酵(Solid-state fermentation，SSF)是在無水或接近無水狀態(tài)下的固態(tài)基質(zhì)上進行的發(fā)酵過程[5].固態(tài)發(fā)酵經(jīng)常用于發(fā)酵食品[6]、生產(chǎn)酶[7]以及抗生素、真菌毒素等次生代謝產(chǎn)物[8].與液態(tài)發(fā)酵(Submerged fermentation，SmF)相比，固態(tài)發(fā)酵過程中細胞移動、胞內(nèi)代謝產(chǎn)物和營養(yǎng)物質(zhì)的擴散均受到限制.另外，固態(tài)發(fā)酵期間微生物的生長、基因表達和代謝情況均不同于液態(tài)發(fā)酵[9-10]，這使得兩種發(fā)酵過程中微生物胞內(nèi)營養(yǎng)狀態(tài)截然不同.

與液態(tài)培養(yǎng)相比，對固態(tài)發(fā)酵過程中酵母生長期轉(zhuǎn)換前后的生理狀態(tài)研究較少.細胞內(nèi)的代謝物組成變化與生理狀態(tài)密切相關.筆者觀察了釀酒酵母固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵狀態(tài)下，指數(shù)生長期和二次生長期菌體內(nèi)代謝組差異，為進一步深入闡明固態(tài)發(fā)酵的代謝調(diào)控機制奠定了基礎.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

SaccharomycescerevisiaeWZS017，為本實驗室分離得到的二倍體野生型酵母.YPD液體培養(yǎng)基組成為2%葡萄糖，1%酵母提取物，2%蛋白胨.

1.1.2 主要儀器

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LECO Corporation, St Joseph, MI, USA)、冷凍離心機(德國SIGMA 2-16PK)、負壓烘箱(上海博迅實業(yè)有限公司).

1.1.3 主要試劑

甲氧胺鹽酸鹽、吡啶、2-氯苯丙氨酸、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)和三甲基一氯硅烷(TMCS)均購自Sigma；甲醇和正己烷為國產(chǎn)色譜純.

1.2 方 法

1.2.1 酵母培養(yǎng)條件

釀酒酵母30 ℃過夜預培養(yǎng)于YPD液體培養(yǎng)基中.將預培養(yǎng)液600 nm吸光度調(diào)至0.25.在液態(tài)培養(yǎng)中，1 mL酵母預培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至30 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min進行培養(yǎng).在固態(tài)培養(yǎng)中，使用直徑2～3 mm的發(fā)泡聚苯乙烯顆粒作為惰性固態(tài)載體，121 ℃滅菌15 min，顆粒會縮小約2/3(Brydson，1982).將3.2 g滅菌的發(fā)泡聚苯乙烯顆粒置于100 mL三角瓶中，接種1 mLOD600調(diào)至0.25的酵母預培養(yǎng)物，再加入1.8 mL YPD液體培養(yǎng)基，接種后沒有觀察到游離水存在，30 ℃靜置培養(yǎng).

1.2.2 生長曲線繪制

通過測量600 nm的光密度進行酵母細胞的生長曲線測定.固態(tài)發(fā)酵過程中酵母生長曲線的測定是將培養(yǎng)物中液體加至30 mL，劇烈振蕩10 min后，進行測定.生長速率計算公式為

μ=(lnX2-lnX1)/(t2-t1)

式中：X1，X2分別為培養(yǎng)物在培養(yǎng)時間t1和t2的OD600吸光度.實驗重復3次.

1.2.3 胞內(nèi)代謝物提取

1.2.4 GC-MS測定

取1 μL衍生化后的樣品注入GC-TOF/MS系統(tǒng)進行測定.柱子為非極性DB-5毛細管柱(30 m×250 μm I.D., J&W Scientific, Folsom, CA)，氦氣作為載氣，流速1.0 mL/min.GC溫度程序為15 ℃/min從50 ℃升到125 ℃, 然后5 ℃/min升到210 ℃,10 ℃/min升到270 ℃，15 ℃/min升至305 ℃，305 ℃保持6 min.離子源溫度230 ℃.質(zhì)譜設置為全掃描模式，掃描范圍為m/z=50～600.通過ChromaTOF軟件使用標準質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫和Feinh數(shù)據(jù)庫進行代謝產(chǎn)物鑒定.相似度大于70%被認定為參考標準代謝物.

1.2.5 實驗數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

液態(tài)發(fā)酵21 h的樣本個數(shù)為5個，其余每組樣品個數(shù)為6個.每個樣品平行測定兩次.每個樣品各個代謝物的峰面積除以該樣品所有代謝物峰面積之和，得到該代謝物的細胞內(nèi)相對量.使用SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行t檢驗.p<0.05代表差異顯著，p<0.01代表差異極顯著.

使用SIMCA軟件(Umetrics，Umea，Sweden)進行非監(jiān)督的主成分分析(PCA)區(qū)分不同培養(yǎng)方式下不同生長階段的酵母樣本.使用PLS-DA根據(jù)代謝物輪廓差異對樣品進行分組，并指出差異代謝物.使用R2和Q2評估所構(gòu)建的PCA和PLS-DA模型的質(zhì)量.通過PLS-DA模型，選擇VIP>1的代謝物作為指數(shù)生長和二次生長階段的候選差異代謝物.將候選差異代謝物的相對量進行t檢驗.只有p<0.05的代謝物定義為差異代謝物.為進一步闡明差異代謝物的生物學意義，使用MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca)的Enrichment Analysis模塊，將差異代謝物富集在代謝途徑上，使用超幾何分布法計算富集p值.

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵的生長曲線

為了確定酵母指數(shù)生長和二次生長階段代謝物提取的時間點，首先繪制了固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵的生長速率曲線.在接種量相同的條件下，固態(tài)發(fā)酵過程中酵母細胞的生物量遠低于液態(tài)發(fā)酵(圖1a).如圖1(b)所示，釀酒酵母的生長期分為指數(shù)期和二次生長期，不同的生長階段，生長速率差異較大.在本實驗條件下，固態(tài)發(fā)酵酵母細胞在15 h結(jié)束指數(shù)生長，之后的二次生長階段在29 h結(jié)束.而液態(tài)發(fā)酵的這兩個時間點分別是17 h和33 h.兩種培養(yǎng)方式下酵母的生長速率均在接種后7 h達到最高，在指數(shù)生長階段，固態(tài)發(fā)酵細胞的生長速率低于液態(tài)發(fā)酵，然而到了二次生長階段，兩種培養(yǎng)方式的生長速率則相差不大.在兩種發(fā)酵培養(yǎng)方式中，11 h和21 h均分別位于指數(shù)生長期和二次生長期，將這兩個時間點確定為兩個生長階段的取樣時間點.

圖1 酵母液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵的生長曲線和生長速率曲線Fig.1 Growth curve and growth rate of yeast in with solid-state and submerged fermentation

2.2 酵母液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵的胞內(nèi)代謝物輪廓

酵母細胞兩種發(fā)酵方式下的樣品進行代謝物提取和GC-MS測定后，PCA分析表明各個樣品可以根據(jù)重新組合后的變量進行正確分組(R2X=0.678,Q2=0.561)，由于發(fā)酵方式和生長階段的不同導致了67.8%的樣品數(shù)據(jù)差異見圖2(a).

為了確定差異代謝物，進一步使用PLS-DA模型進行樣品分類見圖2(b，c).建立PLS-DA模型，成對比較不同培養(yǎng)方式下的兩個生長階段的差異代謝物.對于液態(tài)發(fā)酵的指數(shù)生長(SmF11 h)和二次生長階段(SmF21 h)的樣品組PLS-DA模型，R2X=0.656，R2Y=0.998，Q2=0.982；對于固態(tài)發(fā)酵的指數(shù)生長(SSF11 h)和二次生長階段(SSF21 h)的樣品組PLS-DA模型，R2X=0.545，R2Y=0.991，Q2=0.934.說明PLS-DA模型成功構(gòu)建，具有很高的擬合度和預測能力.不同的生長階段的代謝物具有很大的差異，可以根據(jù)變量重新組合后的主成分進行分辨.

VIP>1的代謝物的相對量差異使得不同樣品在PLS-DA模型中成功分組[12].將VIP>1且p<0.05的代謝物作為指數(shù)生長和二次生長階段的差異代謝物.基于PLS-DA的結(jié)果，液態(tài)發(fā)酵的指數(shù)生長(SmF11 h)和二次生長階段(SmF21 h)的差異代謝物共有131種，固態(tài)發(fā)酵的指數(shù)生長(SSF11 h)和二次生長階段(SSF21 h)的差異代謝物共有117種.

圖2 酵母液態(tài)和固態(tài)培養(yǎng)條件下酵母胞內(nèi)代謝物的主成分分析Fig.2 Scores plots for yeast metabolites of SmF and SSF

2.3 同一培養(yǎng)方式不同生長階段的代謝物變化

SmF11 h與SmF21 h和SSF11 h與SSF21 h具有共同的93種差異代謝物，表1列出了其中的一些.代謝物的途徑富集分析表明，這些共同差異代謝物主要涉及蛋白質(zhì)合成和氨基酸代謝等與細胞生長密切相關的代謝途徑(圖3)，因此無論是液態(tài)培養(yǎng)還是固態(tài)培養(yǎng)，蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝差異是指數(shù)生長階段和二次生長階段的主要代謝差異.

表1 SmF11 h與SmF21 h和SSF11 h與SSF21 h的一些共同差異代謝物細胞內(nèi)相對量1)Table 1 The relative content of some differential metabolites shared by SmF11 h versus SmF21 h and SSF11h versus SSF21 h

注：1) *表示同一培養(yǎng)方式下指數(shù)增長期與二次生長期差異顯著(p< 0.05)；**表示差異極顯著(p< 0.01).同表2，3.

圖3 SmF11 h與SmF21 h和SSF11 h與SSF21 h的共同差異代謝物代謝途徑富集Fig.3 Pathway enrichment of differential metabolites shared by SmF11 h versus SmF21 h and SSF11 h versus SSF21 h

上述富集到蛋白質(zhì)合成過程中的氨基酸包括酪氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸和纈氨酸.與指數(shù)生長期相比，二次生長階段菌體細胞更低的生長速率和更少的蛋白質(zhì)合成量，使得氨基酸在細胞中得到積累.研究表明：上述氨基酸除半胱氨酸以外，在兩種培養(yǎng)方式下，二次生長期和指數(shù)期的濃度之比變化不大.鳥氨酸、環(huán)亮氨酸和半胱氨酰甘氨酸等非蛋白質(zhì)氨基酸或氨基酸衍生物也有類似的規(guī)律.在液態(tài)培養(yǎng)過程中，二次生長階段胞內(nèi)谷氨酸和半胱氨酸相對量分別為指數(shù)生長期的168.3和15.4倍，而在固態(tài)培養(yǎng)條件下，二次生長階段的這兩種氨基酸的量為指數(shù)生長期的25.7和7.0倍.因此，谷氨酸和半胱氨酸可能在兩種不同發(fā)酵方式下的細胞代謝網(wǎng)絡中扮演重要角色.富馬酸、蘋果酸和琥珀酸等三羧酸循環(huán)的中間代謝物也在二次生長階段大量積累，這與細胞在此階段生長速率降低、能量代謝減少和有氧呼吸受到抑制有關.這與Frick等[13]的報道一致.另外，作為細胞膜成分的飽和脂肪酸棕櫚酸在液態(tài)培養(yǎng)時，二次生長階段細胞內(nèi)相對量顯著低于指數(shù)期，而在固態(tài)培養(yǎng)時，則在兩階段相差不大.

除上述93種共同的差異代謝物外，SmF11 h與SmF21 h之間特有的差異代謝物的數(shù)目為38種，SSF11 h與SSF21 h之間特有的差異代謝物為24種.這些差異代謝物分別決定了液態(tài)和固態(tài)培養(yǎng)方式中，不同生長階段轉(zhuǎn)化前后的代謝網(wǎng)絡差異.

如表2所示，在檢測到的SmF11 h與SmF21 h之間特有的差異代謝物中，不飽和脂肪酸油酸相對量在二次生長階段顯著降低.油酸是微生物細胞膜的組成部分，其顯著降低的細胞內(nèi)相對量或與酵母細胞在二次生長階段的細胞生長速率顯著降低、細胞膜流動性下降有關.天冬氨酸、異亮氨酸及高絲氨酸、正亮氨酸和同型半胱氨酸等一些氨基酸衍生物在二次生長階段胞內(nèi)大量積累.4-羥基丁酸一些小分子羧酸等次生代謝產(chǎn)物在二次生長階段開始合成或積累.

表2SmF11 h與SmF21 h的一些差異代謝物細胞內(nèi)相對量

Table2TherelativecontentofsomedifferentialmetabolitesbetweenSmF11handSmF21h

代謝物細胞內(nèi)相對量SmF11hSmF21holeicacid1435．8±531．0442．8±41．2??L?homoserine0．6±0．24．0±0．7??norleucine24．6±10．055．7±13．4??homocystine—18．1±5．0??asparticacid112．2±46．31108．2±115．7??isoleucine324．1±112．7810．9±128．4??4?hydroxybutyricacid—4．7±1．2??adipicacid1．7±0．93．6±0．2??gluconicacid20．9±7．8304．7±173．5??

SSF11 h與SSF21 h之間獨有的24種差異代謝物，也在生長階段轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用.表3列出了該過程中一些重要的差異代謝物.在液態(tài)培養(yǎng)過程中，這些代謝物對指數(shù)和二次生長的差異貢獻率較低.而在固態(tài)培養(yǎng)過程中差異較大，可能與細胞內(nèi)部水分含量較低，導致的生長狀態(tài)改變有關.在固態(tài)發(fā)酵二次生長階段，細胞內(nèi)積累了更高量的葡萄糖和赤蘚糖，表明該階段的碳源利用效率與液態(tài)發(fā)酵存在較大差異.固態(tài)發(fā)酵條件下，代謝產(chǎn)物無法擴散出細胞，檸檬酸大量積累，是液態(tài)發(fā)酵相同培養(yǎng)階段的126.4倍，或許與使用固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸有著相似的代謝調(diào)控機[14].上述現(xiàn)象表明：在固態(tài)發(fā)酵二次生長階段，葡萄糖的有氧代謝受到了更明顯的抑制.鳥嘌呤核苷、賴氨酸和琥珀酸半醛等差異代謝產(chǎn)物在固態(tài)發(fā)酵中所受到的調(diào)控機制現(xiàn)在還不清楚.

表3SSF11 h與SSF21 h的一些差異代謝物細胞內(nèi)相對量

Table3TherelativecontentofsomedifferentialmetabolitesbetweenSSF11 handSSF21 h

代謝物細胞內(nèi)相對量SSF11hSSF21hcitricacid20．8±15．5354．5±128．8??glucoheptose3．1±1．212．1±7．7?erythrose140．0±37．3274．2±69．6??glucose969．9±361．62845．3±561．4??guanosine—15．8±4．9??lysine177．3±138．0548．7±84．0??succinatesemialdehyde—46．0±23．8??

3 結(jié) 論

本研究檢測到了SmF11 h與SmF21 h之間和SSF11 h與SSF21 h之間具有共同的93種差異代謝物.SmF11 h與SmF21h之間特有的差異代謝物的數(shù)目為38種，SSF11 h與SSF21 h之間的特有差異代謝物為24種.這些差異代謝物分別決定了液態(tài)和固態(tài)培養(yǎng)方式中，不同生長階段轉(zhuǎn)化前后的代謝網(wǎng)絡差異.無論是液態(tài)培養(yǎng)還是固態(tài)培養(yǎng)，蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝差異是指數(shù)生長階段和二次生長階段的主要代謝差異.兩種培養(yǎng)方式下富馬酸、蘋果酸和琥珀酸等三羧酸循環(huán)的中間代謝物也在二次生長階段大量積累，這與細胞在此階段生長速率降低、能量代謝減少和有氧呼吸受到抑制有關.SmF11 h與SmF21 h之間特有的38種差異代謝物中，油酸和棕櫚酸的相對量在二次生長階段顯著降低.SSF11 h與SSF21 h之間特有的差異代謝物表明：在固態(tài)發(fā)酵二次生長階段，細胞內(nèi)積累了更高濃度的葡萄糖和赤蘚糖.固態(tài)發(fā)酵條件下，代謝產(chǎn)物無法擴散出細胞，檸檬酸在胞內(nèi)大量積累.

本文得到了浙江工業(yè)大學自然科學基金(1301105071408)的資助.

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(責任編輯：劉 巖)

MetabolomeanalysisofSaccharomycescerevisiaeindifferentculturepatternsandgrowthphases

SUN Jie, YU Xinjun, WANG Wei, ZHU Yougui, JIANG Jie, WANG Zhao

(College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Compared with submerged fermentation, the physiological status of yeast during the growth swift in solid-state fermentation caught little attention. The change of intracellular metabolite composition is closely related to physiological status. Metabolome analysis ofSaccharomycescerevisiaein exponential growth and post-diauxic growth with solid-state and submerged fermentation was performed. Principal components analysis of metabolite profiles showed that the metabolic shift between different growth phases was accompanied by complex changes of the central metabolism. The amount of the differential metabolites between the two growth stages were 131 and 117 with solid-state and submerged fermentation, respectively. The protein synthesis, amino acid metabolism and Kreb’s cycle are the main difference between the two growth stages in both processes of solid-state and submerged fermentation. This study laid a foundation for further elucidation of the metabolic regulation mechanism of yeast in different fermentation processes.

Saccharomycescerevisiae; metabolome analysis; solid-state fermentation; exponential growth; post-diauxic growth

2017-04-10

浙江省自然科學基金資助項目(LQ14C010002)

孫 杰(1981—)，男，內(nèi)蒙古包頭人，講師，博士，研究方向為微生物代謝，E-mail：jsun@zjut.edu.cn.

Q935

A

1006-4303(2017)06-0654-06