劉貝貝， 于 斐， 玉崧成， 劉利娥， 吳擁軍

(1.鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 河南 鄭州 450001； 2.鄭州大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院 河南 鄭州 450001)

DOI: 10.13705/j.issn.1671-6841.2017026

增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析用于伏馬菌素B1的快速檢測

劉貝貝1,2， 于 斐1， 玉崧成1， 劉利娥1， 吳擁軍1,2

(1.鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 河南 鄭州 450001； 2.鄭州大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院 河南 鄭州 450001)

以抗原-抗體的免疫反應(yīng)及化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)，以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記伏馬菌素B1(FB1)為半抗原、魯米諾-H2O2為發(fā)光底物，對羥基聯(lián)苯為化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑，建立了一種新型的FB1快速檢測方法——增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法，相關(guān)系數(shù)R為0.991 6，線性范圍為200～1 400 μg/L，檢測限為91.3 μg/L.在不同的加標(biāo)水平下，回收率為85.9%～115.4%，與之相對應(yīng)的板內(nèi)RSD為9.1%～10.2%(n=6)，板間RSD為10.6%～12.4%(n=6)，與其他真菌毒素交叉反應(yīng)率較低.與傳統(tǒng)的檢測方法(酶聯(lián)免疫吸附測定和高效液相色譜法)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，本研究建立的方法靈敏度高、特異性好、操作簡單、檢測快速，能夠用于大批量實(shí)際樣品的快速檢測.

增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析； 伏馬菌素B1； 快速檢測

DOI: 10.13705/j.issn.1671-6841.2017026

0 引言

伏馬菌素作為一種霉菌毒素，是串珠鐮刀菌和再育鐮刀菌代謝產(chǎn)生的水溶性物質(zhì)[1-2].特別是伏馬菌素B1(FB1)毒性較強(qiáng)，對食品及谷物污染的情況在世界范圍內(nèi)普遍存在.FB1不僅降低了農(nóng)產(chǎn)品和飼料的品質(zhì)，使經(jīng)濟(jì)遭受巨大損失，而且還可以通過污染了FB1的肉、乳等動物源性食品進(jìn)入人體，給人們的健康造成威脅[3].研究表明，F(xiàn)B1能引起馬腦質(zhì)軟化癥和神經(jīng)性中毒而呈現(xiàn)運(yùn)動失調(diào)和意識障礙甚至死亡，還能使豬產(chǎn)生肺水腫綜合征，并有肝、腎毒性，可致動物肝癌和食道細(xì)胞增生[4].FB1可能會誘發(fā)人類患食道癌等疾病，已被國際癌癥中心劃為2B類致癌物.另外，據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，現(xiàn)已有6個(gè)國家制訂了玉米中FB1的限量標(biāo)準(zhǔn)，而我國對FB1的毒性研究還較少，尚未制訂食品與飼料中FB1的限量標(biāo)準(zhǔn). 因此，迫切需要測定谷物及其制品中FB1的含量，故建立測定伏馬菌素的快捷、精確、安全的檢測方法意義深遠(yuǎn).

對伏馬菌素的痕量檢測，國內(nèi)外已有薄層色譜(TCL)、高效液相色譜(HPLC)[5]、色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)[6]、金免疫層析(GICA)[7]及酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)[8]等方法.雖然HPLC或LC-MS等儀器檢測方法準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性好，但樣品前處理過程復(fù)雜，損耗量大，儀器昂貴，限制了其在大批量實(shí)際樣品檢測中的廣泛應(yīng)用；而ELISA免疫法的靈敏度偏低.因此，亟須建立一種快速簡便、特異性好、靈敏度高的檢測方法.

化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析(chemiluminescence enzyme-linked immunoassay，CLEIA)的靈敏度高，線性范圍寬，無須復(fù)雜的樣品前處理，操作簡便，分析速度快，可實(shí)現(xiàn)自動化.基于魯米諾-H2O2-HRP的經(jīng)典化學(xué)發(fā)光體系，發(fā)光信號會衰減，限制了其廣泛應(yīng)用.研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入一些酚類物質(zhì)，背景值會被抑制，發(fā)光信號不同程度地被增強(qiáng)，且發(fā)光時(shí)間有所延長.本實(shí)驗(yàn)選取的增強(qiáng)劑為對羥基聯(lián)苯(PPP)，與其他酚類增強(qiáng)劑對比，其增強(qiáng)效果更為顯著.據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)建立了一種FB1的快速CLEIA檢測方法——增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析(enhanced chemiluminescence enzyme-linked immunoassay，ECLEIA)，并對實(shí)際樣品進(jìn)行了檢測.

1 材料與方法

1.1 主要儀器

化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(Centro XS3 LB960，BERTHOLD公司)；紫外可見分光光譜儀(UV-1601，日本島津公司)；紅外光譜儀(PE-1710，西德PE公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHG-9146A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司).

1.2 主要試劑及溶液

FB1單抗(Santa Cruz Biotechnology)、FB1標(biāo)準(zhǔn)抗原(Sigma)、魯米諾(Sigma)、過氧化氫(昊天化學(xué)有限公司)、辣根過氧化物酶(Sanland)、對羥基聯(lián)苯(阿拉丁)、牛血清白蛋白(Sigma)；所用試劑均為分析純，水為MillQ純水.

包被液：Tris-HCl緩沖液(pH 9.6)；封閉液：1%OVA的PBS緩沖液；洗滌液：0.05 mol/L的PBS緩沖液(含0.05%的TRITON-X100)；樣品稀釋液：0.05 mol/L的PBS緩沖液(pH 7.4).顯色液A：魯米諾+對羥基聯(lián)苯；顯色液B：新鮮配制的過氧化氫(H2O2)溶液.

1.3 樣品的前處理

分別將正常小麥、霉變小麥和霉變玉米粉碎、研磨，過分子篩，然后進(jìn)行四分法縮分.取5 g樣品放入100 mL具塞試管中，加入75%的甲醇-水溶液50 mL，振蕩30 min，離心15 min，濾紙過濾，4 ℃保存?zhèn)溆?，并用PBS緩沖液做適量稀釋后進(jìn)行檢測.

1.4FB1酶標(biāo)記物的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[9]，采用酶聯(lián)免疫吸附方法，在線性范圍內(nèi)將不同方法制備的偶聯(lián)物用于FB1標(biāo)準(zhǔn)品的測定.結(jié)果顯示，一步戊二醛法有較大的響應(yīng)值，靈敏度最高，故選擇一步戊二醛法制備FB1-HRP偶聯(lián)物并對其進(jìn)行鑒定.

1.5 ECLEIA方法的建立

化學(xué)發(fā)光底物濃度的大小直接影響相對光單位(RLU)的大小，從而影響測定方法的靈敏度.故對魯米諾濃度、H2O2濃度、增強(qiáng)劑濃度、體系的pH值進(jìn)行優(yōu)化.經(jīng)過優(yōu)化，用包被液稀釋FB1單克隆抗體至所需濃度，移取100 μL到96孔微孔板(滅菌處理)上，37 ℃溫育2 h，洗滌3次，拍干.每孔加入200 μL封閉液，37 ℃溫育2 h，洗滌5次，拍干.每孔加入不同濃度的FB1標(biāo)準(zhǔn)溶液、FB1-HRP偶聯(lián)物各100 μL，每行的前兩孔為空白對照孔(0.01 mol/L、pH 7.4的PBS緩沖液)，37 ℃溫育1 h，洗滌5次，拍干.每孔依次各加入等量的顯色液A和B，于化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上測定各孔的RLU.

1.6 方法學(xué)評價(jià)

1.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用PBS緩沖液(pH 7.4)配制質(zhì)量濃度分別為200、400、800、1 000、1 200、1 400 μg/L的FB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.5中步驟進(jìn)行ECLEIA，測定不同質(zhì)量濃度下的RLU，根據(jù)FB1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度與RLU的關(guān)系，應(yīng)用不同形式的方程對其進(jìn)行線性擬合.

1.6.2精密度評價(jià) 取一塊聚苯乙烯板，分別配制低、中、高3個(gè)水平質(zhì)量濃度(400、800、1 200 μg/L)樣品，每個(gè)水平平行測定6次，得出板內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差；另取不同的聚苯乙烯板采用直接競爭ECLEIA測定FB1的含量，分別配制400、800、1 200 μg/L 3個(gè)水平質(zhì)量濃度樣品，每個(gè)水平平行測定6次，求出各自的板間標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察該方法的精密度.

1.6.3準(zhǔn)確度評價(jià) 采用加標(biāo)回收率的方法對所建立方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行評價(jià)，在空白樣品中加入質(zhì)量濃度分別為200、600、800 μg/L的FB1標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.5中步驟測定加標(biāo)孔的發(fā)光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出加標(biāo)回收率，考察該方法的準(zhǔn)確度.

1.6.4特異性評價(jià) 選取真菌毒素嘔吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黃曲霉毒素B1(AFB1)，用PBS緩沖液配制各系列不同質(zhì)量濃度樣品，按照ECLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟得到相應(yīng)的抑制率，然后計(jì)算交叉反應(yīng)率，過程如下：以不同質(zhì)量濃度的抗原和結(jié)構(gòu)類似抗原物質(zhì)分別求各自的IC50(當(dāng)發(fā)光衰減至最大相對光單位一半時(shí)該物質(zhì)的質(zhì)量濃度)，按公式S=y/Z×100%(S為交叉反應(yīng)率；y為抗原的IC50；Z為結(jié)構(gòu)類似抗原物質(zhì)的IC50)計(jì)算交叉反應(yīng)率，考察該方法的特異性.

1.6.5方法學(xué)比較 把已建立的ECLEIA法用于小麥樣品中FB1的檢測，分別在不含F(xiàn)B1的小麥樣品中加入已知濃度的FB1標(biāo)準(zhǔn)品制成待測樣本，按照1.5節(jié)中的步驟進(jìn)行操作，檢測小麥樣品中FB1的含量.用FB1的常用檢測方法(HPLC[10]、ELISA[11])對加標(biāo)小麥樣品進(jìn)行檢測，并進(jìn)行方法學(xué)的比較，同時(shí)用ECLEIA與HPLC對霉變小麥、霉變玉米進(jìn)行了測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 ECLEIA的原理

ECLEIA的原理如圖1所示.采用直接競爭法[12]，首先將FB1單克隆抗體包被到固相載體上，孵育后洗滌、封板.然后加入待測抗原和同種酶標(biāo)記抗原的混合溶液，使之與固相抗體發(fā)生競爭性反應(yīng)，對照孔只加酶標(biāo)抗原，孵育后洗滌.結(jié)合的酶標(biāo)抗原量和待測抗原量成反比，加入發(fā)光底液和增強(qiáng)劑，對羥基聯(lián)苯可作為HRP的第二反應(yīng)底物，顯著加快酶的循環(huán)速度，增大魯米諾游離基的濃度，從而增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，產(chǎn)生發(fā)光.

2.2FB1-HRP的表征

FB1、HRP和FB1-HRP的紫外可見光譜見圖2.HRP在405、265、205 nm有最大吸收峰；FB1在200 nm附近有最大吸收峰；而FB1-HRP在405、265、205 nm也有最大吸收峰，初步推斷偶聯(lián)成功.

圖1 ECLEIA原理示意圖Fig.1 ECLEIA principle diagram

圖2 FB1、HRP和FB1-HRP的紫外可見光譜Fig.2 UV-Vis spectra of FB1, HRP and FB1-HRP

FB1、HRP和FB1-HRP的紅外吸收光譜見圖3.FB1-HRP在3 410～3 460 cm-1范圍內(nèi)具有較強(qiáng)、較寬的吸收峰，既有FB1分子N—H鍵伸展振動產(chǎn)生的3 410 cm-1吸收峰，也有HRP分子內(nèi)O—H鍵伸展振動產(chǎn)生的3 462 cm-1吸收峰；并且在1 612 cm-1出現(xiàn)FB1的吸收峰，故可判斷偶聯(lián)成功.

2.3 化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

由圖4可知，隨著魯米諾(luminol)濃度的增加，體系發(fā)光強(qiáng)度逐漸增加，當(dāng)魯米諾濃度大于7×10-4mol/L時(shí)，發(fā)光值開始衰減，故選擇魯米諾的濃度為7×10-4mol/L用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).同理，過氧化氫(H2O2)的濃度選擇為4.0×10-3mol/L，對羥基聯(lián)苯(PPP)的濃度選擇為2×10-4mol/L，緩沖體系Tris-HCl 的pH選擇為8.5，此時(shí)RLU最大.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、準(zhǔn)確度及特異性

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)FB1標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與RLU的關(guān)系，應(yīng)用不同形式的方程對其進(jìn)行擬合，并計(jì)算不同回歸方程的相關(guān)系數(shù).選擇實(shí)際走勢和擬合曲線最吻合(即曲線相關(guān)系數(shù)最接近1.0)的方程，作為實(shí)驗(yàn)最終的線性方程.如表1中用不同方法進(jìn)行擬合的相關(guān)系數(shù)R中，B/B0-C與RLU-C數(shù)值接近，考慮到檢測限及回收率的計(jì)算，最終采用B/B0-C為本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，在200～1 400 μg/L范圍內(nèi)，回歸方程為y=-0.000 3x+0.857 4，相關(guān)系數(shù)R=0.991 6，R2=0.983 3.

2.4.2精密度 通過表2中數(shù)據(jù)可知，采用直接競爭ECLEIA方法檢測FB1，在低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的板內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.1%～10.2%(n=6)，板間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.6%～12.4%(n=6).由此可以看出，建立的方法精密度很好，可以用于實(shí)際樣品的檢測.

圖3 FB1、HRP和FB1-HRP的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of FB1, HRP and FB1-HRP

圖4 化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化Fig.4 Optimization of chemical experiment conditions

2.4.3準(zhǔn)確度 由表3數(shù)據(jù)可知，高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的加標(biāo)回收率在85.9%～115.4%范圍內(nèi)，整體而言，方法準(zhǔn)確度良好，可以用于實(shí)際樣品的檢測.

2.4.4特異性 通過對比谷物中常見的3種生物毒素DON、ZEN、AFB1，對方法的特異性進(jìn)行了論證.由表4可知，F(xiàn)B1單抗針對谷物中常見的3種生物毒素的交叉反應(yīng)率(S)均低于2.0%，接近無交叉反應(yīng)，說明伏馬菌素FB1單克隆抗體對其他真菌毒素?zé)o特異性反應(yīng)，從而間接表明了建立的ECLEIA方法測定FB1具有良好的特異性.

表1 擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)的比較

2.4.5方法學(xué)的比較 用FB1的傳統(tǒng)檢測方法(HPLC[10]、ELISA[11])對加標(biāo)小麥樣品進(jìn)行檢測，并進(jìn)行方法學(xué)的比較，評價(jià)3種檢測方法的特點(diǎn).3種方法的檢測限、線性范圍、回收率及精密度結(jié)果如表5所示.并同時(shí)用ECLEIA與HPLC對霉變小麥、霉變玉米進(jìn)行測定，結(jié)果如表6所示.

由表中數(shù)據(jù)分析可知，雖然ECLEIA、ELISA兩種方法具有免疫分析方法所特有的低成本、高通量、預(yù)處理簡單及快速等優(yōu)點(diǎn)，但光吸收是ELISA方法檢測的特點(diǎn)，OD值會受到外源性物質(zhì)的影響；而ECLEIA方法與其他發(fā)光現(xiàn)象的區(qū)別在于發(fā)光來源的不同，它吸收化學(xué)反應(yīng)過程中釋放的能量，避免了外來光源的干擾，提高了信噪比，增強(qiáng)劑和儀器光電倍增管的存在可增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度以及延長發(fā)光時(shí)間，從而提高了體系檢測的靈敏度.

表2 直接競爭ECLEIA方法的板內(nèi)和板間的相對 標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

表3 加標(biāo)回收率測定結(jié)果(n=6)

表4 ECLEIA方法測定FB1的特異性(n=6)

表5 3種方法測定FB1的結(jié)果比較

表6 ECLEIA與HPLC測定霉變小麥、霉變玉米比較

從前處理角度看，ECLEIA和ELISA占據(jù)優(yōu)勢，但ELISA方法的線性范圍窄；從樣品檢測的靈敏度角度看，ECLEIA和HPLC差別不大，都能滿足大多數(shù)樣品中真菌毒素最低限量標(biāo)準(zhǔn)檢測的要求.因此，ECLEIA方法對于真菌毒素的監(jiān)控有很大的應(yīng)用前景.

3 結(jié)論

用以魯米諾-HRP-H2O2-對羥基聯(lián)苯為體系的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法(ECLEIA)對FB1含量進(jìn)行了測定，方法檢測限為91.3 μg/L，線性范圍為200～1 400 μg/L，與其他常用檢測方法(HPLC法和ELISA法)進(jìn)行方法學(xué)比較，得出了ECLEIA法具有高靈敏度和高特異性，檢測快速，樣品前處理簡單，適用于大批量樣本的檢測，能夠?qū)任镏械暮哿空婢舅剡M(jìn)行監(jiān)測，并有望實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測.

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(責(zé)任編輯：孔 薇)

EnhancedChemiluminescenceEnzyme-linkedImmunoassayforRapidDetectionofFumonisinB1

LIU Beibei1,2, YU Fei1, YU Songcheng1, LIU Li′e1, WU Yongjun1,2

(1.CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China; 2.CollegeofChemistryandMolecularEngineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

Based on the immune reaction between antigen and antibody and chemiluminescence, a new method for rapid detection of fumonisin B1was established using luminol-H2O2as luminescent substrates and the hydroxy diphenyl as chemiluminescence enhancer, and named as enhanced chemiluminescence enzyme-linked immunoassay(ECLEIA). On the basis of optimizing the experimental conditions, the limit of detection was 91.3 μg/L, and the linear range of the ECLEIA method for FB1determination was from 200 μg/L to 1 400 μg/L, while the correlation coefficient was 0.991 6. Furthermore, the relative standard deviations of intra-assay and inter-assay were 9.1%～10.2%(n=6) and 10.6%～12.4% (n=6),respectively. The recoveries were 85.9%～115.4%, and the cross-reactivity rates with object analogues were low. Compared with other common detection methods (HPLC and ELISA), ECLEIA method had high sensitivity, high specificity, sample operation and rapid detection, which could be used for the fast testing of large quantities of real samples.

enhanced chemiluminescence enzyme-linked immunoassay; fumonisin B1; rapid detection

2017-02-16

國家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(81402721).

劉貝貝(1991—)，女，河南鹿邑人，主要從事藥物分析研究，E-mail:1198107789@qq.com；通信作者：吳擁軍(1968—)，男，河南駐馬店人，教授，主要從事衛(wèi)生檢驗(yàn)和衛(wèi)生毒理學(xué)研究，E-mail: wuyongjun@zzu.edu.cn.

O657.39

A

1671-6841(2017)04-0076-06