魯紅　吳+濤　姚志剛　謝文軍　劉俊華　段代祥　張孝霖

摘 要：為獲得鹽生植物內(nèi)生解烴細(xì)菌，該研究以黃河三角洲石油污染地區(qū)健康生長的鹽生植物白茅、蘆葦、蒙古鴉蔥為材料，通過柴油平板培養(yǎng)實驗分離得到22株內(nèi)生解烴細(xì)菌。經(jīng)16S rRNA同源序列分析，對菌株進(jìn)行了鑒定。通過液體培養(yǎng)實驗，研究了菌株對不同烴類物質(zhì)利用能力。結(jié)果表明，22株內(nèi)生細(xì)菌主要為原小單胞菌屬、短小桿菌屬、微桿菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬、考克氏菌屬、不動桿菌屬、紅小梨形菌屬和節(jié)細(xì)菌屬，其中假單胞菌屬和芽孢桿菌屬菌株最多。分離出22株內(nèi)生解烴細(xì)菌能降解直鏈烷烴的最多，能降解多環(huán)芳烴種類最少，其中部分內(nèi)生解烴細(xì)菌既可以利用烷烴又可以利用芳香烴。

關(guān)鍵詞：石油污染；鹽漬化土壤；鹽生植物；內(nèi)生細(xì)菌；解烴

中圖分類號 Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）16-0018-04

Isolation and Characteristics of Hydrocarbon-degrading Endophytic Bacteria from Halophytic Vegetation

Lu Hong1，2 et al.

（1Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta，School of Bioengineering，Binzhou University，Binzhou 256600，China；2Shandong Provincial Key Laboratory of Eco-Environmental Science for Yellow River Delta，Binzhou University，Binzhou 256600，China）

Abstract：To obtain efficient hydrocarbon-degrading endophytic bacteria from halophytic vegetation，22 endophytic bacteria strains which can grow in mineral liquid media amended with diesel oil as the sole carbon sources were isolated from Imperata cylindrica （L.） Beauv.，Phragmites australias Trin.，and Scorzonera mongolica Maxim.growing in a heavily saline and alkali，crude oil-contaminated environment in the Yellow River Delta，an important base of petroleum production in China.According to its 16S rRNA sequence analysis，these strains were identified.Moreover，liquid incubation experiment was conducted to clarify its characteristics of degrading efficiency for various hydrocarbons.Sequence analysis revealed that 22 strains were members of 10 genera （Promicromonospora，Curtobacterium，Microbacterium，Pseudomonas，Bacillus，Serratia，Kocuria，Acinetobacter，Rhodopirellula，Arthrobacter），and the dominant genera were Pseudomonas and Bacillus.Most of endophytic bacteria strains can degrade straight-chain alkanes，polycyclic aromatic hydrocarbons degradation species were the least.Some endophytic bacteria strains can utilize both alkanes and aromatic hydrocarbons.

Key words：Petroleum contamination；Saline soil；Halophytic vegetation；Endophytic bacteria；Hydrocarbon degradation

石油污染鹽漬化土壤治理是目前面臨的一項重要任務(wù)[1]。植物修復(fù)具有不破壞土壤環(huán)境、修復(fù)成本低、無二次污染等優(yōu)點，被視為最有前景的土壤修復(fù)方法。植物修復(fù)污染土壤的效率主要取決于植物所協(xié)同的功能微生物，特別是內(nèi)生細(xì)菌的種類和數(shù)量[2]。利用具有降解石油烴功能內(nèi)生細(xì)菌協(xié)同宿主植物修復(fù)污染土壤是最具發(fā)展?jié)摿Φ男屡d修復(fù)技術(shù)[3]。研究表明，部分鹽生植物與非鹽生植物相比，更能適應(yīng)石油污染鹽漬化土壤環(huán)境，種植鹽生植物能顯著提高石油污染鹽漬化土壤中石油烴類污染物的降解率[4]。目前，關(guān)于鹽生植物內(nèi)生解烴細(xì)菌報道較少。本研究以黃河三角洲石油污染重鹽堿地區(qū)健康生長的鹽生植物白茅、蘆葦、蒙古鴉蔥為材料，分離鹽生植物內(nèi)生解烴細(xì)菌，初步研究菌株特性，以期為鹽生植物修復(fù)石油污染鹽漬化土壤提供優(yōu)質(zhì)內(nèi)生細(xì)菌菌種資源。endprint

1 材料與方法

1.1 材料 鹽生植物白茅（Imperata cylindrica（L.） Beauv.）、蘆葦（Phragmites australias Trin.）、蒙古鴉蔥（Scorzoneramongolica Maxim.），均采自黃河三角洲石油污染重鹽堿地區(qū)。

1.2 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基：Na2HPO4 1.79g，KH2PO4 0.68g，NH4NO3 1.0g，MgSO4 0.35g，微量元素混合液 1.0mL，蒸餾水1000mL，pH7.4。其中微量元素混合液：CoCl2·6H2O 4g、CuCl2·2H2O 1g、CaCl2 40g、ZnCl2 2g、H3BO3 0.5g、FeCl3·7H2O 40g、NaMoO4·2H2O 2g、MnCl2·4H2O 8g、AlCl3·6H2O 1g，蒸餾水1000mL。柴油平板培養(yǎng)基：在985mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂，凝固后滴加柴油，使固體平板表面形成油膜。

1.3 內(nèi)生解烴細(xì)菌的分離 取整株白茅、蘆葦和蒙古鴉蔥，自來水沖洗植物30min，然后蒸餾水沖洗3次，每次3min，用吸水紙將植物表面的水分吸干。用無菌剪刀將每種植物地上部和地下部分開，分別用70%的酒精浸泡2min，用磷酸緩沖液沖洗3次，再用3% NaClO浸泡2次，每次1min，用磷酸緩沖液沖洗3次，每次2min。將最后一次沖洗植物部位的磷酸緩沖液涂布于LB培養(yǎng)基，檢驗植物表面滅菌是否完全。取植株各部分約2g，分別放入無菌研缽中，加入10倍體積的磷酸緩沖液，研磨成勻漿，吸取1mL上清懸液，加入柴油平板培養(yǎng)基上，用玻璃棒涂布均勻，3個重復(fù)。于30℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)4d。用接種環(huán)挑取單菌落，在LB平板上劃線分離純化單菌落3次，純化后菌株保存于LB固體培養(yǎng)基。

1.4 菌株分子鑒定 菌株分子鑒定參照文獻(xiàn)[5]所述方法。特異性條帶擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工測序，所測序列與Genbank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行同源性對比。

1.5 菌株對各種烴類物質(zhì)的利用實驗 分別選取代表直鏈烷烴的正辛烷、正十六烷，代表支鏈烷烴的異辛烷，代表簡單芳香烴的二甲苯和代表多環(huán)芳烴的菲、萘為碳源，以無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，按照5%接種量接入供試菌株。以不加菌培養(yǎng)基為對照，設(shè)置3個重復(fù)。培養(yǎng)基初始pH值調(diào)整為7.4，在30℃搖床180r·min-1培養(yǎng)4d，在600nm處測定吸光度，以表示菌株利用各種烴類物質(zhì)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽生植物內(nèi)生解烴細(xì)菌的分離 從鹽生植物白茅、蘆葦、蒙古鴉蔥地上部和地下部共分離得到能利用柴油的植物內(nèi)生細(xì)菌22株，其中從白茅地下部分離出6株（編號為B01～B06），地上部分離出2株（編號為B07、B08）。從蘆葦?shù)叵虏糠蛛x出9株（編號為L09～L17），地上部分離出3株（編號為L18～L20）。從蒙古鴉蔥地下部分離出2株（編號為M21，M22），地上部未分離出菌株。可以看出，從禾本科植物蘆葦中分離出降解石油烴菌株最多，白茅次之，菊科植物蒙古鴉蔥分離出降解石油烴內(nèi)生細(xì)菌最少。已有研究表明，禾本科植物具有更大的根比表面積，能夠附著大量的微生物，為微生物提供更多的生存空間，在修復(fù)石油污染土壤中更占有優(yōu)勢[6]。3種植物地下部分離出內(nèi)生解烴細(xì)菌數(shù)量高于地上部，一般認(rèn)為植物內(nèi)生細(xì)菌主要來源于土壤，植物根部內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量高于莖和葉部位[7]。

2.2 菌株鑒定及多樣性分析 經(jīng)過克隆測序獲得22株內(nèi)生解烴細(xì)菌的16S rRNA序列，通過GenBank的BLAST 軟件對22株內(nèi)生解烴細(xì)菌的16S rRNA 測序結(jié)果進(jìn)行相似性比對，鑒定細(xì)菌的種類，結(jié)果見表2。由表2可以看出，22株內(nèi)生解烴細(xì)菌與已知菌種的16S rRNA 序列相似性都大于97%。22株內(nèi)生細(xì)菌歸為10個屬，分別為原小單胞菌屬（Promicromonospora）、短小桿菌屬（Curtobacterium）、微桿菌屬（Microbacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、沙雷氏菌屬（Serratia）、考克氏菌屬（Kocuria）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、紅小梨形菌屬（Rhodopirellula）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）。其中假單胞菌屬和芽孢桿菌屬最多，分別有5株，各占總分離物的22.7%。短小桿菌屬、原小單胞菌屬、考克氏菌屬和不動桿菌屬各有2株。在白茅、蘆葦和蒙古鴉蔥中都分離出假單胞菌屬內(nèi)生解烴細(xì)菌，在白茅和蘆葦中都分離出芽孢桿菌屬內(nèi)生解烴細(xì)菌，表明假單胞菌屬和芽孢桿菌屬內(nèi)生解烴細(xì)菌在鹽生植物中分布種類相對較多。通常認(rèn)為假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬和土壤桿菌屬是植物內(nèi)生細(xì)菌中可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢種群[8]。本研究未分離出腸桿菌屬和土壤桿菌屬植物內(nèi)生解烴細(xì)菌，可能是由于這2個屬中細(xì)菌具有降解石油烴功能種類較少，也可能是由于植物種類、取樣地點、分離及表面滅菌方法，培養(yǎng)基等不同所致[9]。

2.3 菌株利用烴類物質(zhì)特性 22株菌對不同烴類物質(zhì)的利用情況見表3。由表3可以看出，22株鹽生植物內(nèi)生解烴細(xì)菌中能利用正十六烷有20株，能利用正辛烷的有19株，能利用異辛烷的有16株，能利用二甲苯的有15株，能利用菲的8株，能利用萘的有9株。一般認(rèn)為，石油烴類物質(zhì)中飽和烷烴最易被微生物降解，其次是低分子量的芳香烴，高分子量的多環(huán)芳烴則較難降解[10]。在烷烴中，直鏈烷烴比支鏈烷烴容易降解，中等長度的鏈烷烴最易降解，短鏈烷烴對許多微生物有毒，而長鏈烷烴阻滯微生物酶活性，生物可降解性較低[11]。分離出22株內(nèi)生解烴細(xì)菌降解直鏈烷烴最多，能降解多環(huán)芳烴最少，這與土壤中分布的降解石油烴功能微生物趨勢一致[12]。

菌株B03、L11和L13對直鏈烷烴正辛烷和正十六烷、支鏈烷烴異辛烷、簡單芳香烴二甲苯、多環(huán)芳烴菲和萘都能利用，菌株B02、B07、L14、L15、L19、L20、M21只能利用烷烴，菌株B06、B08只能利用芳香烴，菌株B01、B04、B05、L09、L10、L12、L16、L17、L18、M22能利用部分烷烴和部分芳香烴。Foght等[13]研究了從淡水、海水和河口水樣中分離出的138株細(xì)菌降解烷烴和芳香烴能力，結(jié)果表明石油烴降解菌能降解烷烴或芳香烴，但不能同時降解2種烴類物質(zhì)。本研究從鹽生植物分離出部分內(nèi)生解烴細(xì)菌既可以利用烷烴又可以利用芳香烴，表明自然界中石油烴降解菌能同時降解烷烴和芳香烴兩種烴類物質(zhì)。endprint

3 結(jié)論

從黃河三角洲石油污染重鹽堿地生長的白茅、蘆葦和蒙古鴉蔥中分離出22株能利用柴油的石油烴降解菌，其中蘆葦中分離出降解石油烴菌株最多，白茅次之，蒙古鴉蔥分離出降解石油烴內(nèi)生細(xì)菌最少。經(jīng)16S rRNA同源序列分析，22株內(nèi)生細(xì)菌分別為原小單胞菌屬、短小桿菌屬、微桿菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬、考克氏菌屬、不動桿菌屬、紅小梨形菌屬和節(jié)細(xì)菌屬，其中假單胞菌屬和芽孢桿菌屬最多。22株內(nèi)生解烴細(xì)菌中能利用正十六烷有20株，能利用正辛烷的有19株，能利用異辛烷的有16株，能利用二甲苯有15株，能利用菲的8株，能利用萘的有9株。分離出22株內(nèi)生解烴細(xì)菌降解直鏈烷烴最多，支鏈烷烴次之，能降解多環(huán)芳烴最少，其中部分內(nèi)生解烴細(xì)菌既可以利用烷烴又可以利用芳香烴。

參考文獻(xiàn)

[1]吳濤，謝文軍，依艷麗，等.耐鹽石油烴降解菌的篩選鑒定及其特性研究[J].環(huán)境科學(xué)，2012，33（11）：3949-3955.

[2]Hardoim P.R.，van Overbeek L.S.，Elsas J.D..Properties of bacterial endophytes and their proposed role in plant growth[J].Trends Microbiol.，2008，10 （16）：463-471.

[3]Kukla M.，P?ociniczak T.，Piotrowska-Seget Z..Diversity of endophytic bacteria in Lolium perenne and their potential to degrade petroleum hydrocarbons and promote plant growth[J].Chemosphere，2014，17 （1）：40-46.

[4]Wang Z.Y.，Xu Y.，Zhao J.，et al.Remediation of petroleum contaminated soils through composting and rhizosphere degradation[J].J.Hazard.Mater.，2011，190（1-3）：677-685.

[5]Sambrook J.，Russell D.W..Molecular cloning：A laboratory manual（3rd Edition）[M].Beijing：Science Press，2002：597-627.

[6]Merkl N.，Schultze-kraft R.，Infante C..Phytoremediation in the tropics-influence of heavy crude oil on root morphological characteristics of graminoids[J].Environ.Pollut.，2005，138（1）：86-91.

[7]Khan S.，Afzal M.，Iqbal S.，et al.Plant-bacteria partnerships for the remediation of hydrocarbon contaminated soils[J].Chemosphere，2013，90（4）：1317-1332.

[8]胡萌.植物內(nèi)生細(xì)菌研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，39（1）：148-151.

[9]路國兵，冀憲領(lǐng)，張瑤，等.桑樹內(nèi)生細(xì)菌的分離及生防益菌的篩選[J].蠶業(yè)科學(xué)，2007，33（3）：350-354.

[10]Bossert I.，Bartha R..The fate of petroleum in soil ecosystems.In：Atlas RM，eds.Petroleum Microbiology[M].NewYork：Macmillan Publishing Corporation，1984：89-98.

[11]Setti L.，Lanzarini G.，Pifferi P.G.，et al.Further research into aerobic degradation of n-alkanes in a heavy oil by a pure culture of a Pseudomonas spp[J].Chemosphere，1993，26（6）：1151-1157.

[12]Siciliano S.，Germida J.J.，Banks K.，et al.Changes in microbial community composition and function during a polyaromatic hydrocarbon phytoremediation ?eld trial[J].Appl.Environ.Microbiol.，2003，69（1）：483-489.

[13]Foght，J.M.，F(xiàn)edorak，P.M.，Westlake，W.S..Mineralization of [14C]hexadecane and [14C]phenanthrene in crude oil：specificity among bacterial isolates[J].Canadian J.Microbiol.，1990，36（3）：169-175. （責(zé)編：張宏民）endprint