沈國俊, 江小云, 黃 潔, 曾小冬, 毛龍火, 付喜花
(1 九江市第三人民醫(yī)院 肝病中心, 江西 九江 332000; 2 番禺區(qū)中心醫(yī)院 感染科, 廣州 511400)
利用半肝切除再生模型研究單個肝細胞核內耐藥鴨乙型肝炎病毒DNA的動態(tài)變化
沈國俊1, 江小云1, 黃 潔1, 曾小冬1, 毛龍火1, 付喜花2
(1 九江市第三人民醫(yī)院 肝病中心, 江西 九江 332000; 2 番禺區(qū)中心醫(yī)院 感染科, 廣州 511400)
目的利用半肝切除再生模型研究單個肝細胞核內耐藥鴨乙型肝炎病毒(DHBV)DNA的動態(tài)變化規(guī)律。方法45日齡慢性DHBV感染鴨半肝切除后接種突變株轉染上清,持續(xù)飼喂拉米夫定,定期采血及取肝組織標本,檢測外周血病毒DNA水平及病毒株,流式細胞儀分選單個肝細胞核及增殖細胞核抗原(PCNA)陽性與陰性細胞核,巢式PCR擴增核內DHBV YMDD區(qū),直接測序法檢測是否存在突變。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗和Fisher精確概率法。半肝切除前后PCNA的比較使用方差分析Welch法。結果半肝切除前單個核內病毒DNA及血清中克隆均為野生株;接種突變株轉染上清后,在半肝切除術后1周時突變株感染的肝細胞核比率高于術后12周時的水平 (χ2=7.225,P<0.01);術前PCNA陽性肝細胞核比率為(0.84±0.36)%,術后1周時顯著升至(42.26±6.48)%,術后12周時為(11.83±3.97)%,各時間點比較差異有統(tǒng)計學意義(F=190.832,P<0.001);術后1周時突變株感染的PCNA陽性細胞核比率高于術后12周時的水平,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.063,P<0.01), 而術后PCNA陰性的細胞核突變株感染的比率極低。結論半肝切除可為耐藥病毒提供復制空間,但耐藥病毒在外周血及肝內未能形成優(yōu)勢毒株。
肝炎病毒, 乙型, 鴨; 抗藥性, 病毒; 半肝切除; 肝再生
由于慢性鴨乙型肝炎病毒(DHBV)感染時肝內傳播空間(DHBV未感染的肝細胞數(shù)量)的限制,耐藥 DHBV 感染的肝細胞數(shù)量極低以致核內耐藥的病毒DNA檢測不到[1];但半肝切除后肝細胞快速再生可給耐藥病毒提供傳播空間[2]。本研究擬用鴨乙型肝炎慢性感染動物模型,先給予拉米夫定抑制體內的野生株病毒復制,并行半肝切除術觀察肝細胞是否再生活躍;術后接種DHBV耐藥株,檢測血清與單個肝細胞核內病毒株的變化,了解游離耐藥突變株能否感染新生肝細胞,能否在肝內快速傳播成為優(yōu)勢株。
1.1 實驗動物、主要試劑與儀器 45日齡慢性DHBV感染鴨(廣州市白云區(qū)龍歸鎮(zhèn)孵化場)[3],血清DNA提取試劑盒(德國QIAGEN),固定破膜劑(美國invitrogen公司),鼠抗人PCNA單克隆抗體(美國eBioscience公司),流式PCNA二抗(羊抗鼠IgG,美國BD公司),PE標記(美國invitrogen公司)。羅氏Lightcycler?480實時熒光定量PCR儀,美國BECTON DICKINSON公司FACSAriaTM流式細胞分選系統(tǒng)。
1.2 實驗動物分組、半肝切除術和病毒接種 將8只45日齡慢性DHBV感染鴨分為2組:治療組5只,每只動物持續(xù)飼喂拉米夫定(20 mg·kg-1·d-1),每周采血1次;當血清DHBV DNA連續(xù)2次低于real-time PCR檢測下限(3 log10拷貝/ml)時,行肝右葉半肝切除術;在維持抗病毒治療下,分別于肝切后48 h和72 h靜脈接種DHBV突變株轉染上清各1 ml[4](real-time PCR定量DHBV DNA為8.16×107拷貝);術后繼續(xù)給藥12周,術后1周肝活組織檢查及采血,術后4周及8周采血,術后12周采血處死所有動物,取出肝組織。未治療組3只,行半肝切除并接種突變株轉染上清,標本采集流程同治療組。
1.3 血清DHBV DNA定量及病毒株的檢測 血清DHBV DNA的提取詳見試劑盒說明書,熒光定量 PCR的檢測具體方法詳見參考文獻[3]。巢式PCR擴增血清DHBV DNA YMDD區(qū)段,引物由上海英駿生物公司合成(表1);巢式PCR擴增第1輪反應體系為20 μl (ddH2O 4.5 μl, 2×Buffer 10 μl, dNTPs 2 μl, PS1 0.2 μl, PS2 0.2 μl, KOD酶0.3 μl, 模板3 μl),反應條件:94 ℃預變性5 min,30 s后進入循環(huán),94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,35個循環(huán)后72 ℃再延伸5 min。巢式PCR擴增第2輪反應體系為50 μl (ddH2O 37 μl, 10×Buffer 5 μl, dNTPs 4 μl, DMF2 0.5 μl, DMR2 0.5 μl, Blend-taq 0.5 μl, 模板3 μl),反應條件:94 ℃預變性7 min, 30 s后進入循環(huán),94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,38個循環(huán)后72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳后凝膠回收;將擴增回收目的片段連接T載體,進行TA克隆的構建;再進行轉化、鋪板,挑取并PCR篩選陽性克隆;1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物陽性菌液送華大基因公司測序。
表1 DHBV DNA YMDD區(qū)段巢式PCR引物序列
1.4 肝細胞核的分離 稱取10 mg凍存肝組織置入高壓滅菌后的2 ml柱形玻璃研磨器中,加入1 ml勻漿液[終濃度為:10 mmol Tris HCl (pH 7.5), 3 mmol MgCl2, 0.25 mol Sucrose, 0.05%Triton X-100]。通過勻漿研磨處理,直至組織完全溶解 (研磨約10~15次),將研磨后的組織勻漿液轉移至1.5 ml離心管中;低速離心收集細胞核 (2000 r/min,5 min),棄上清;加入1 ml勻漿液重懸細胞核沉淀團低速離心 (2000 r/min,5 min),棄上清;再次加入1 ml勻漿液重懸細胞核沉淀團低速離心 (2000 r/min,5 min)[5]。
1.5 肝細胞核PCNA的標記及流式分選 每份肝細胞核懸液準備2個5 ml流式管,分別加入PBS稀釋100 ml(細胞核數(shù)約1×106),1管為同型對照、1管為PCNA標記。每個流式管中加入100 μl破膜A液,避光15 min后加入2 ml PBS洗滌2次,再加入100 μl破膜B液,另標記管中加入2 ml鼠抗人PCNA一抗,避光20 min;每管再加入2 ml PBS洗滌2次,然后加入100 μl PBS,其中標記管加入PE標記兔抗鼠IgG二抗5 μl,同型對照管加入6 μl PE標記的同型抗體,避光20 min;所有管均加入2 ml PBS洗滌后再加入300 μl PBS均勻混合。通過設定對應的PE熒光標志,先載入同型對照管,再放入標記檢測管,調整閾值,在PE散點圖中,對PCNA陽性及陰性肝細胞核2個亞群細胞依次設門,應用全自動細胞分選系統(tǒng)設置分選參數(shù),分選無標記、PCNA標記陽性及PCNA標記陰性3類單個肝細胞核至每孔加有12 μl消化液[終濃度為:10 mmol Tris HCl (pH 7.5),0.1%Triton X-100,200 μg/ml蛋白酶K]的96孔板中。顯微鏡下確認每個孔內僅有1個細胞核[5]。
1.6 單個肝細胞核內DHBV DNA的YMDD區(qū)擴增和測序 分選后的96孔板于50 ℃溫浴60 min,使蛋白酶K充分消化核膜,DNA從單個細胞核內釋放出來,再經(jīng)75 ℃、15 min滅活蛋白酶K;每孔再加入5個單位的EcoR Ⅰ,37 ℃酶切4~5 h,使cccDNA酶切成雙鏈線性DNA,便于PCR擴增[5]。將處理后樣品進行巢式PCR擴增單個核內DHBV YMDD區(qū),反應體系及條件同上述。將第2輪PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳,根據(jù)結果選取陽性樣品送華大基因公司測序。
1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0軟件進行處理。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗,不滿足χ2檢驗條件者采用Fisher精確概率法。半肝切除前后PCNA表達的比較采用方差分析Welch法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 外周血DHBV DNA水平的變化 慢性DHBV感染鴨外周血DHBV DNA平均水平為(7.17±0.53)log10拷貝/ml。治療組持續(xù)口服拉米夫定16~22周,血清DHBV DNA水平低于3 log10拷貝/ml(檢測下限);行半肝切除并接種突變株轉染上清,術后1周時所有動物外周血病毒水平升高至(4.43±0.68)log10拷貝/ml,而在術后4、8和12周逐漸下降,并在第12周達最低水平,出現(xiàn)術后一過性反彈。而未治療組動物整體維持高病毒血癥狀態(tài)(圖1)。
圖1半肝切除后接種突變株病毒外周血DHBV DNA水平的變化
2.2 血清中耐藥突變株的比例變化 篩選2只治療組動物(3號和23號)不同時間點血清中的陽性病毒株克隆各15個,直接測序法檢測YMDD區(qū)段。結果顯示半肝切除前血清中克隆均為野生株,接種突變株轉染上清后,在術后1、4、8、12周,3號動物分別檢測到6(40%)、3(20%)、1(6.7%)、1(6.7%)個突變株,23號動物分別檢測到7(46.7%)、4(26.7%)、2(13.3%)、0個突變株(圖2)。結果提示野生株始終為DHBV準種中的優(yōu)勢株,隨接種時間的延長,突變株在血清中的比例降低,并未成為優(yōu)勢準種。
圖2 半肝切除后血清中耐藥突變株的比例變化 a:3號動物;b:23號動物
2.3 突變株感染的肝細胞核比例變化 流式分選各時間點肝組織標本的單個細胞核,巢氏PCR擴增單個核內DHBV DNA的YMDD區(qū)?;€時(肝右葉半肝切除術時)每只動物分別獲取30個,術后1周及12周每只動物各獲取90個陽性PCR產(chǎn)物直接測序。結果顯示治療組在接種突變株轉染上清前所有動物單個核內DHBV均為野生株;術后1周時所有動物均有少量的肝細胞核感染了突變株(1.1%~7.8%),高于術后12周時感染突變株的比率(0~4.4%),兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.225,P<0.01)(表2)。未治療組動物3個時間點均未發(fā)現(xiàn)突變株。
表2 半肝切除后突變株感染的單個肝細胞核比例的變化[例(%)]
2.4 PCNA表達陽性肝細胞核比例變化 PCNA染色單個肝細胞核懸液后,經(jīng)流式分選儀分選,結果顯示基線時PCNA陽性肝細胞比率極低(0.84±0.36)%,提示正常肝細胞穩(wěn)定很少再生;術后1周時比率顯著升高(42.26±6.48)%,有近一半的肝細胞增殖;但在術后12周時比率顯著降低(11.83±3.97)%。各時間點PCNA表達陽性肝細胞比率差異有統(tǒng)計學意義(F=190.832,P<0.001)(表3)。
表3 半肝切除后PCNA陽性的肝細胞核比例變化(%)
2.5 突變株感染的不同標記的肝細胞核比例變化 采用巢氏PCR擴增治療組動物術后PCNA標記陽性及陰性的單個核內DHBV DNA的YMDD區(qū),每只動物各時間點分別獲取30個陽性PCR產(chǎn)物直接測序。結果顯示所有動物在術后1周時有少量PCNA陽性肝細核能檢測到突變株(6.7%~16.7%),而術后12周時有3只動物極少部分PCNA陽性細胞核感染了突變株(0~6.7%),兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.063,P<0.01);在PCNA陰性的細胞核中,術后2個時間點各1只動物僅有1個細胞核檢測到突變株(表4)。
表4 突變株感染的PCNA陽性及陰性單個肝細胞核比例的變化[例(%)]
核苷類藥耐藥突變是逆轉錄過程中隨機發(fā)生的結果。在藥物治療與宿主免疫反應的選擇壓力下,耐藥突變株在肝臟內大量復制并逐漸轉為優(yōu)勢株[6]。cccDNA庫中野毒株轉為耐藥突變株的效率與肝細胞再生速度密切相關[7]。目前有關cccDNA的檢測仍存有爭議,但研究證實核內病毒 DNA主要是以cccDNA的形式存在,能較直接反映cccDNA水平及狀態(tài)[3]。
本研究發(fā)現(xiàn),鴨半肝切除后,流式標記法檢測肝組織PCNA的表達均較術前顯著增多。PCNA是一種與細胞周期相關的增殖細胞核抗原,存在并合成于核內,其含量和表達強弱的變化與DNA合成及DNA復制的活躍程度一致,多用于反映細胞增殖程度和評價細胞增殖的狀態(tài)[8]。鴨半肝切除后,肝細胞呈現(xiàn)出較強的再生能力,有大量新生肝細胞生成以恢復肝細胞數(shù)量和肝臟結構。本研究報道與兔和大鼠的肝再生模型[9]結論一致,下一步將采取免疫組化法進一步證實本結論。
基線時血清及單個核內病毒DNA均為野生株。半肝切除后,在肝細胞增殖活躍期接種耐藥株病毒上清,血清中與單個肝細胞核內均檢測到少量DHBV M512V突變株的存在,但未能成為優(yōu)勢株。以往研究證實慢性感染狀態(tài)下,幾乎每個肝細胞都感染了HBV,由于cccDNA半衰期與被感染肝細胞壽命較長,未感染的肝細胞數(shù)量較少。此外由于HBV感染肝細胞時存在重復感染排除現(xiàn)象,認為耐藥突變株無法再感染野生株已感染的肝細胞,導致耐藥病毒再感染肝細胞的機會很低[1]。這種重復感染排除現(xiàn)象使肝細胞核內DHBV毒株只有1種,而核內病毒形式主要為cccDNA和少量的rcDNA,因此可以推測本實驗中肝細胞核內存在DHBV耐藥株cccDNA。HBV耐藥株是缺陷病毒,其復制活性低于HBV野生株,在同野生株的競爭中處于劣勢,藥物的選擇壓力是耐藥產(chǎn)生的必要條件[10]。用野生株感染鴨中耐藥M512V突變株不能自發(fā)產(chǎn)生,需要2年以上抗病毒治療才會出現(xiàn)[1],并逐漸替代野生株成為優(yōu)勢株,因此可推測在半肝切術后1、12周時肝細胞核內檢測的突變株為接種的游離DHBV突變株感染引起。本研究結果表明,核內耐藥DHBV DNA感染肝細胞核數(shù)量并未隨著拉米夫定治療時間的延長而增加,而是逐漸減少,即觀察時間內耐藥毒株在肝內未能成為優(yōu)勢株。
本研究還發(fā)現(xiàn)耐藥突變株主要感染新生的肝細胞。對于慢性DHBV感染鴨,即使野生型DHBV的復制已被核苷類似物充分抑制,但親代肝細胞仍然存在DHBV cccDNA[11],因此半肝切除能否為耐藥DHBV肝臟內傳播提供足夠的空間還取決于cccDNA從親代肝細胞分配到子代肝細胞的幾率。由于新生未感染的肝細胞較少,肝內病毒感染主要以野生株為主,突變株難以快速大量感染肝細胞,形成優(yōu)勢準種。
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引證本文:SHEN GJ, JIANG XY, HUANG J, et al. Dynamic changes in drug-resistant duck hepatitis B virus DNA in single hepatocyte nucleus after hemihepatectomy using a liver regeneration model[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(11): 2127-2131. (in Chinese)
沈國俊, 江小云, 黃潔, 等. 利用半肝切除再生模型研究單個肝細胞核內耐藥鴨乙型肝炎病毒DNA的動態(tài)變化[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(11): 2127-2131.
(本文編輯:劉曉紅)
Dynamicchangesindrug-resistantduckhepatitisBvirusDNAinsinglehepatocytenucleusafterhemihepatectomyusingaliverregenerationmodel
SHENGuojun,JIANGXiaoyun,HUANGJie,etal.
(LiverDiseaseCenter,ThirdPeople′sHospitalofJiujiangCity,Jiujiang,Jiangxi332000,China)
ObjectiveTo investigate the dynamic changes in drug-resistant duck hepatitis B virus (DHBV) DNA in single hepatocyte nucleus after hemihepatectomy using a liver regeneration model.MethodsDucks aged 45 days with chronic DHBV infection were inoculated with mutant DHBV after hemihepatectomy and then fed with lamivudine. Blood samples and liver tissue samples were collected at regular intervals. Viral DNA level in peripheral blood and viral strains were measured. Flow cytometry was used to isolate single hepatocyte nuclei and nuclei with or without proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Nested-PCR was used for the multiplication of intranuclear DHBV YMDD region. Direct sequencing was used to determine the absence or presence of mutation. The chi-square test and the Fisher′s exact text were used for comparison of categorical data between groups. The Welch method was used for comparison of PCNA before and after hemihepatectomy.ResultsThere were wild strains in single hepatocyte nuclei and serum before hemihepatectomy. After inoculation with mutant strains, the percentage of hepatocyte nuclei infected with mutant strains decreased significantly from 1 week to 12 weeks after hemihepatectomy (χ2=7.225,P<0.01). The percentage of PCNA-positive hepatocyte nuclei was 0.84%±0.36% before surgery, significantly increased to 42.26%±6.48% at 1 week after surgery, and was 11.83%±3.97% at 12 weeks after surgery, and there was a significant difference between different time points (F=190.832,P<0.001). The percentage of PCNA-positive nuclei infected with mutant strains decreased significantly from 1 week to 12 weeks after surgery (χ2=7.063,P<0.01), while the percentage of PCNA-negative nuclei infected with mutant stains was extremely low after surgery.ConclusionHemihepatectomy may provide a replication space for drug-resistant virus, but drug-resistant virus cannot become dominant strains in the peripheral blood and the liver.
hepatitis B virus, duck; drug resistance, viral; single hepatocyte nuclei; liver regeneration
R512.62
A
1001-5256(2017)11-2127-05
10.3969/j.issn.1001-5256.2017.11.015
2017-05-03;
2017-06-05。
江西省青年科學基金計劃(20142BAB215038)
沈國俊(1983-),男,主治醫(yī)師,博士,主要從事病毒性肝炎基礎與臨床研究。
付喜花,電子信箱:xihuafu2008@126.com。