文曉飛，馬慶慶，熊瑋，余樂(lè)蘭，唐淑亞

（貴州航天醫(yī)院感染科，貴州 遵義 563000）

遵義地區(qū)慢性乙型病毒性肝炎少數(shù)民族患者檢測(cè)基因分型與耐藥變異的相關(guān)性和意義

文曉飛，馬慶慶，熊瑋，余樂(lè)蘭，唐淑亞

（貴州航天醫(yī)院感染科，貴州 遵義 563000）

目的研究2015年4月-2017年4月遵義地區(qū)苗族、仡佬族慢性乙型肝炎（HBV）患者63例基因分型和耐藥基因變異相關(guān)性和意義。方法選擇63例HBV DNA陽(yáng)性慢性乙型病毒性肝炎少數(shù)民族患者，以拉米夫定為首選治療藥物，以阿德福韋醋和恩替卡韋為耐藥患者替代治療藥物；所有患者進(jìn)行HBV基因分型，并進(jìn)行耐藥變異測(cè)定，對(duì)其用藥情況進(jìn)行為期2年的追蹤分析。結(jié)果基因分型：本組病例包括B型43例、C型19例、BC混合型1例。在為期2年的追蹤治療中，共發(fā)生耐藥變異12例（19.04%），其中B型變異率11.62%，C型變異率36.84%，各基因型之間差異顯著（P＜0.05）；治療1年、2年的耐藥變異率隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)顯著升高（P＜0.05）；B型基因YVDD變異為主，占80%，其余 1例為YIDD變異占20%，C型基因均為YIDD變異 。結(jié)論慢性乙型病毒性肝炎少數(shù)民族患者HBV基因分型和耐藥變異具有一定的相關(guān)性，建立基因分型、耐藥變異、前C區(qū)突變檢測(cè)技術(shù)可為乙型病毒性肝炎的臨床診治提供指導(dǎo)性策略。

HBV基因分型；耐藥變異；核苷酸類(lèi)似物

慢性乙型病毒性肝炎，作為全球性關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題，嚴(yán)重威脅到人類(lèi)健康。人類(lèi)感染HBV基因型的類(lèi)別有可能與疾病的感染譜、疾病的進(jìn)展、感染途徑有一定的聯(lián)系[1,2]。隨著核苷（酸）類(lèi)藥物在HBV治療的廣泛應(yīng)用，耐藥等問(wèn)題也相繼出現(xiàn)[3]，定期檢測(cè)HBV基因突變對(duì)于合理使用核苷酸藥物具有重要意義[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)HBV基因型與治療乙型肝炎常用藥物的耐藥位點(diǎn)做鑒定分析，為抗病毒治療的療效評(píng)價(jià)和用藥方案的調(diào)整提供依據(jù) 。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選擇2015年4月-2017年4月貴州航天醫(yī)院門(mén)診和住院63例慢性乙型病毒性肝炎少數(shù)民族患者，HBV-DNA陽(yáng)性的血清，成功進(jìn)行基因分型。其中男性52例，女性11例，年齡22歲-65歲，中位值（38.4±11.6）歲。診斷均符合2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的“慢性乙型肝炎防治指南”診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。所有病例均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染及自身免疫性肝病。

1.2 研究方法

1.2.1 治療方法 所有患者給予保肝降酶對(duì)癥支持治療，在此基礎(chǔ)上以拉米夫定（LMV）首選抗病毒藥物，并以阿德福韋（ADV）和恩替卡韋（ETV）為耐藥患者替代治療藥物。

1.2.2 基因測(cè)定方法 HBV基因分型采用PCR和DNA反向點(diǎn)雜交。

1.2.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增 ①DNA提?。翰捎弥苯又蠓蟹?，檢測(cè)HBV-YIDD、YVDD基因突變；②基因擴(kuò)增：HBV-YIDD、YVDD試劑盒為杭州艾康生物技術(shù)公司產(chǎn)品，ABI-7500全自動(dòng)熒光定量PCR系統(tǒng)為美國(guó)Life公司產(chǎn)品。PCR步驟為95oC，180 s，1個(gè)循環(huán)。94oC，15 s；62oC，30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件，計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因分型結(jié)果 慢性乙肝病毒肝炎少數(shù)民族患者B型43例（68.25%）、C型 19例（30.16%）、BC混合型1例（1.59%），未見(jiàn)其他基因分型。

2.2 基因型與耐藥變異檢測(cè) 在為期2年的追蹤治療中，共發(fā)生耐藥變異12例（19.04%），其中B型變異率11.62%，C型變異率36.84%，BC型無(wú)變異，各基因型之間差異顯著（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 基因型與耐藥變異情況

2.3 治療1年、2年的耐藥變異情況 治療1年、2年的耐藥變異率分別為3例（4.7%），9例（14.28%），隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 治療1年、2年的耐藥變異情況

2.4 基因型與慢性乙型肝炎病毒耐藥突變情況 B型基因YVDD變異為主，占80%（4/5），其余1例為YIDD變異占20%（1/5）；C型基因均為YIDD變。其變異類(lèi)型差異顯著（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 慢性乙肝病毒耐藥突變情況

3 討論

慢性乙型肝炎感染者伴有乙肝病毒活動(dòng)性復(fù)制是發(fā)展成為進(jìn)展性肝病，如肝硬化、肝癌的重要相關(guān)因素[6]。HBV基因型及亞型與乙型肝炎的進(jìn)展及抗病毒療效均有一定的相關(guān)性。在慢性乙肝抗病毒治療中，核苷（酸）類(lèi)似物（NUC）作用強(qiáng)效而迅速，不良反應(yīng)輕，口服給藥，患者耐受性好，已被大多數(shù)慢性乙肝患者所接受。但在長(zhǎng)期治療過(guò)程中均可出現(xiàn)耐藥變異YMDD變異，其變異方式與HBV基因型有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：主要以 B、C兩型為主，B型占明顯優(yōu)勢(shì)；2年治療時(shí)間中，隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，變異率逐年升高。其中拉米夫定耐藥以YVDD和YIDD突變?yōu)橹?。研究已發(fā)現(xiàn)YMDD主型區(qū)發(fā)生耐藥的點(diǎn)突變通常有兩種形式。一種為第 741位鳥(niǎo)嘌呤被胸腺嘧啶取代（G→T），其編碼的550位的蛋氨酸變?yōu)轭R氨酸（YMDD→YVDD）。YIDD和YVDD變異所誘導(dǎo)的HBV耐藥的機(jī)理是HBV DNA聚合酶基因發(fā)生突變,導(dǎo)致與拉米夫定的結(jié)合力降低。雖然本次耐藥變異所占的比例較小，未發(fā)現(xiàn)阿德福韋酯和恩替卡韋耐藥，但對(duì)于即將進(jìn)行抗病毒治療或者治療后無(wú)作用的患者，有必要檢測(cè)HBV耐藥變異情況，并及時(shí)調(diào)整治療方案實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。

綜上所述，乙肝病毒肝炎患者基因分型和耐藥變異具有一定的相關(guān)性，值得進(jìn)一步研究其他核苷（酸）類(lèi)似物的耐藥突變情況，為臨床提供更加有效的治療案。

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