安 皓, 徐世宏, 豐程程, 王彥豐, 劉清華, 李 軍

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大菱鲆精子運(yùn)動(dòng)特征與精液pH的相關(guān)性研究

安 皓1, 2, 3, 徐世宏1, 3, 豐程程1, 2, 3, 王彥豐1, 3, 劉清華1, 3, 李 軍1, 3

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266237)

為探究大菱鲆()精液質(zhì)量與pH的關(guān)系及甘油對(duì)大菱鲆精子激活的影響, 本研究通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)分析檢測(cè)了威海和煙臺(tái)4家大菱鲆育苗場(chǎng)(A、B、C、D)的精子質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn), 不同育苗場(chǎng)的大菱鲆精子活力存在顯著的差異, A2>A1>D>C>B, 精子預(yù)測(cè)壽命分別為11.7、7.1、6.8、4.6、3.3 min, 所取精子的質(zhì)量的存在顯著差異。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 大菱鲆精子運(yùn)動(dòng)特性與精子活化率相關(guān)性顯著, 其中精子活化率與平均曲線運(yùn)動(dòng)速度、平均直線運(yùn)動(dòng)速度、平均路徑速度、精子頭側(cè)擺幅度、精子平均鞭打頻率呈顯著正相關(guān)(<0.05), 與運(yùn)動(dòng)直線性、運(yùn)動(dòng)擺動(dòng)性、運(yùn)動(dòng)前向性等參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性; 大菱鲆精子運(yùn)動(dòng)特性受pH影響顯著, 精液pH與平均曲線運(yùn)動(dòng)速度、平均直線運(yùn)動(dòng)速度、平均路徑速度、精子頭側(cè)擺幅度、精子平均鞭打頻率呈顯著正相關(guān)(<0.05), 而與運(yùn)動(dòng)直線性、運(yùn)動(dòng)擺動(dòng)性、運(yùn)動(dòng)前向性等參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性。同時(shí)還發(fā)現(xiàn), 精子活化率高、壽命長(zhǎng)的大菱鲆精液pH偏弱堿性(pH=8.0), 即大菱鲆精子適宜在弱堿性環(huán)境中活動(dòng)。除此之外, 向激活海水中加入梯度甘油(0.1、1、10、100、500、1 000 mmol/L), 發(fā)現(xiàn)可以顯著提高大菱鲆精子壽命, 其中甘油濃度為100 mmol/L時(shí), 精子壽命延長(zhǎng)至15.17 min±0.29 min, 推測(cè)甘油在精子激活后可能被精子吸收并氧化分解提供能量。

大菱鲆(); 精子; 運(yùn)動(dòng)特征; pH

魚(yú)類精子質(zhì)量由于該魚(yú)種養(yǎng)殖模式、個(gè)體、環(huán)境等因素的不同, 存在較大的個(gè)體差異[1-4]。精子質(zhì)量對(duì)魚(yú)類的人工繁育至關(guān)重要, 優(yōu)質(zhì)的精子可以顯著提高受精率和孵化率, 從而提高養(yǎng)殖生產(chǎn)效益。在其他研究領(lǐng)域, 對(duì)精子質(zhì)量的鑒定也十分重要, 如精子冷凍、品系選育、重金屬污染評(píng)價(jià)等[5]。魚(yú)類精子質(zhì)量的評(píng)價(jià)方法有很多, 如精子活化率、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、精子密度、受精率和生理功能等[5]。計(jì)算機(jī)輔助精子分析(computer-assisted sperm analysis, CASA)技術(shù)能對(duì)精子的動(dòng)靜態(tài)圖像全面量化分析[6], 與常規(guī)精液分析方法(Sperm routine analysis, SRA)相比測(cè)定指標(biāo)更多樣、客觀、準(zhǔn)確。

甘油作為精子冷凍保存的添加劑, 在精子冷凍保存中的作用已經(jīng)比較清楚, 但在精子激活后活力維持中是否有作用及其作用機(jī)制尚不清楚。在精子活力維持方面, 糖類(如葡萄糖、果糖)等外源物質(zhì)能夠促進(jìn)精子的活力[7-8]。有研究表明, 精子細(xì)胞中的甘油能夠進(jìn)入糖酵解途徑, 參與有氧代謝, 提供能量, 促進(jìn)精子活力的維持[9-11]。

鲆鰈魚(yú)類是中國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類, 其中大菱鲆()養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)占鲆鰈類產(chǎn)量和規(guī)模的80%。本實(shí)驗(yàn)擬以大菱鲆精子為研究對(duì)象, 采集了4個(gè)不同魚(yú)苗場(chǎng)的大菱鲆精子, 通過(guò)對(duì)這些大菱鲆精子活力的檢測(cè)和評(píng)價(jià), 探究精液質(zhì)量與pH的關(guān)系, 及甘油對(duì)大菱鲆精子激活的影響, 為提高大菱鲆人工繁殖的受精率提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 親魚(yú)來(lái)源

實(shí)驗(yàn)用大菱鲆親魚(yú)采集于威海和煙臺(tái)4家公司的繁殖用魚(yú), 采集時(shí)間2016年9月、10月, 其中于A公司先后采集了2次, 選取尾數(shù)分別為25(A1, 12條; A2, 13條)、8、8、8條。

1.2 藥品及儀器

實(shí)驗(yàn)所用甘油購(gòu)自青島恒飛生物科技有限公司(分析純), 不同濃度梯度的甘油激活劑設(shè)置為0.1、1、10、100、1 000 mmol/L, 用海水稀釋, 顯微鏡型號(hào)Nikon-eclipse-E200, 計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)(CASA)。

1.3 采集方法

隨機(jī)取繁殖用魚(yú), 采用人工擠壓腹部的方法采集精液, 操作過(guò)程中盡量避免海水、糞便、尿液等的污染。采集到的精液裝入1.5 mL離心管內(nèi), 置于裝有冰袋(毛巾包裹)的泡沫箱中暫存。精液采集為逐條采集, 隨后立即檢測(cè)精子質(zhì)量, 1個(gè)個(gè)體為1個(gè)樣本。

1.4 精子質(zhì)量檢測(cè)

精子的活力檢測(cè)通過(guò)自然海水進(jìn)行稀釋激活精子, 在10倍顯微鏡下觀察精子的運(yùn)動(dòng)情況并通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件采集相關(guān)數(shù)據(jù)并統(tǒng)計(jì)。活化率檢測(cè): 激活后30s時(shí)對(duì)精子的活化率進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 每個(gè)樣本計(jì)數(shù)的精子數(shù)大于200個(gè), 以快速和中速運(yùn)動(dòng)精子個(gè)數(shù)之和與總計(jì)數(shù)精子個(gè)數(shù)的比值作為精子的活化率指標(biāo)(速率指標(biāo): 快速>100mm/s、中速45~100mm/s、慢速10~45mm/s, 不動(dòng)<10mm/s)[12-13]。壽命檢測(cè): 精子自激活開(kāi)始到約 95%停止原處顫動(dòng), 即認(rèn)為壽命終止。運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)檢測(cè): 激活后30 s時(shí)記錄精子運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)。pH檢測(cè): 采用pH試紙檢測(cè)每個(gè)樣本pH值。梯度甘油激活劑激活精子, 檢測(cè)不同濃度的甘油激活精子后精子的壽命。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 16軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SD表示, 平均數(shù)的比較采用 One- Way ANOVA 分析法和Kruskal-Wallis檢驗(yàn),<0.05為差異顯著,<0.01為差異極顯著, 相關(guān)性分析采用Pearson法。

2 結(jié)果與分析

2.1 大菱鲆精子活化率與運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)

實(shí)驗(yàn)以自然海水激活精子, 測(cè)得激活后30 s時(shí)的8個(gè)運(yùn)動(dòng)特征參數(shù): 平均曲線運(yùn)動(dòng)速度(curvilinear velocity, VCL)、平均直線運(yùn)動(dòng)速度(straight line velocity, VSL)、平均路徑速度(average path velocity, VAP)、精子頭側(cè)擺幅度(amplitude of lateral head displacement, ALH)、運(yùn)動(dòng)的直線性(linearity, LIN)、運(yùn)動(dòng)的擺動(dòng)性(wobble, WOB)、運(yùn)動(dòng)的前向性(straightness, STR)、精子平均鞭打頻率(beat cross frequency, BCF), 活化率與運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)關(guān)系如圖1所示。

大菱鲆精子激活后活化率與運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)VCL(=0.845,<0.01,=49)、 VSL(=0.664,<0.01,=47)、VAP(=0.763,<0.01,=49)、ALH(=0.695,<0.01,=43)、BCF(=0.871,<0.01,=43)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系, 與LIN、WOB、STR相關(guān)性不顯著。

2.2 大菱鲆精液pH與精子運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)

實(shí)驗(yàn)以自然海水激活精子, 用pH試紙測(cè)得從各育苗場(chǎng)取得的精液未激活時(shí)的pH, 同時(shí)測(cè)得激活后30 s時(shí)的8個(gè)運(yùn)動(dòng)特征參數(shù): 平均曲線運(yùn)動(dòng)速度、平均直線運(yùn)動(dòng)速度、平均路徑速度、精子頭側(cè)擺幅度、運(yùn)動(dòng)的直線性、運(yùn)動(dòng)的擺動(dòng)性、運(yùn)動(dòng)的前向性、精子平均鞭打頻率, pH與運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)關(guān)系如圖2所示。

大菱鲆未激活精液的pH與大菱鲆精子激活后的運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)VCL(=0.300,<0.05,=40)、 VSL(=0.546,<0.01,=29)、VAP(=0.494,<0.01,=38)、ALH(=0.603,<0.01,=42)、BCF(=0.476,<0.01,=33)呈正相關(guān)關(guān)系, 與LIN、WOB、STR相關(guān)性不顯著。ALH在各pH組之間差異顯著(6.5a、7.0a、7.5b、8.0c,<0.05), VCL、VSL、VAP、BCF僅在pH 7.5和8.0兩組中存在顯著差異(<0.05), LIN、STR、WOB在各pH組之間無(wú)顯著差異。大菱鲆精液pH越高VCL、VSL、VAP、ALH、BCF等參數(shù)的數(shù)值也越高, 精子活力也越好。

2.3 大菱鲆精液pH與精子活化率

將各個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)取得的精液用pH試紙測(cè)得未激活精液的pH(=37), 以激活后30 s時(shí)測(cè)得的快速(>100mm/s)和中速(45~100mm/s)運(yùn)動(dòng)精子占所有精子的比例作為精子活化率, pH與活化率關(guān)系如圖3所示。

大菱鲆精液pH與精子活化率呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(=0.466,<0.01), 活化率在各pH組之間分別為6.5ab、7ab、7.5a、8b(<0.05)。大菱鲆精液pH越高活化率越高, 精子活力也越好。好的大菱鲆精液pH呈弱堿性, 在8.0左右。

圖1 大菱鲆精子活化率與運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)

2.4 精子壽命

將各養(yǎng)殖場(chǎng)采集到的精子樣品取5~8個(gè)測(cè)精子壽命。將精子以自然海水激活, 30 s時(shí)測(cè)活化率, 之后每隔30 s測(cè)1次活化率, 各養(yǎng)殖場(chǎng)的樣品測(cè)得的數(shù)據(jù)分別取平均后, 測(cè)得不同養(yǎng)殖場(chǎng)精子激活后時(shí)間與精子活化率關(guān)系如圖4所示。

隨著激活后時(shí)間的持續(xù), 精子活化率明顯下降, 各養(yǎng)殖場(chǎng)精液質(zhì)量也存在明顯差異(<0.01)。精液質(zhì)量情況: A2>A1> D> C> B。根據(jù)圖1中的擬合曲線方程得到不同養(yǎng)殖場(chǎng)精子壽命如表1所示。

2.5 大菱鲆精液pH與精子壽命

將各個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)取得的精液用pH試紙測(cè)得未激活精液的pH(=40), 然后將養(yǎng)殖場(chǎng)采集到的精子樣品以自然海水激活, 測(cè)得精液pH與精子壽命關(guān)系如圖5所示。

大菱鲆精液pH與精子壽命呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(=0.576,<0.01), 各pH組精子壽命分別為6.5a、7b、7.5bc、8c(<0.05)。大菱鲆精液pH越高壽命越長(zhǎng)。

圖2 大菱鲆精液pH與精子運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)

2.6 甘油對(duì)精子激活后精子壽命的影響

用海水稀釋甘油獲得不同濃度梯度的甘油激活劑, 各梯度甘油激活劑分別激活精子, 測(cè)3個(gè)活力相近的精液樣本后取平均值, 測(cè)得不同梯度甘油激活劑激活下的精子壽命如圖6所示。

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異(<0.05), 不同濃度實(shí)驗(yàn)組之間也有顯著差異(<0.05), 說(shuō)明加入甘油后可以延長(zhǎng)精子壽命, 其中甘油濃度在100 mmol/L的時(shí)候效果最好, 濃度過(guò)高會(huì)降低精子壽命。

圖3 大菱鲆精液活化率與pH

圖4 大菱鲆精子活化率與激活時(shí)間

表1 不同育苗場(chǎng)場(chǎng)大菱鲆精子壽命

圖5 大菱鲆精液pH與精子壽命

圖6 大菱鲆精子活力與甘油濃度

圖中字母代為多重比較結(jié)果

The letters represent the results of multiple comparison

3 討論

魚(yú)類精子活力的評(píng)價(jià)指標(biāo)有多種, 如精子活化率、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、密度、形態(tài)、受精率和生理功能等。本實(shí)驗(yàn)選取其中最傳統(tǒng)的評(píng)價(jià)方法——精子活力, 其測(cè)定方便, 能較準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)精子質(zhì)量。計(jì)算機(jī)輔助精子分析與常規(guī)精液分析方法相比, 前者能客觀準(zhǔn)確地量化精子運(yùn)動(dòng)狀況, 通過(guò)對(duì)精子運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)的捕獲, 使人們對(duì)精子運(yùn)動(dòng)有了更深層次的了解, 并已被越來(lái)越多地用于精子質(zhì)量的評(píng)估。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了精子8個(gè)運(yùn)動(dòng)特征參數(shù), 其中VCL、VSL、VAP、ALH、BCF與精液pH或活化率成正相關(guān)關(guān)系, LIN、STR 、WOB與精液pH或活化率相關(guān)性不顯著, 這與LIN、STR、WOB是比值的定義有關(guān)。比較各運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)在不同pH組之間的差異性發(fā)現(xiàn), 多數(shù)運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)在高pH組之間差異顯著, 低pH組之間、高pH與低pH組之間差異不顯著, 這可能與低pH值組有效數(shù)據(jù)太少有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)共測(cè)得49尾魚(yú)的pH, 其中pH在7.0以上的占78%。作者發(fā)現(xiàn), 活化率高、精子壽命長(zhǎng)的大菱鲆精液pH偏弱堿性, 即大菱鲆精子適宜在弱堿性環(huán)境中活動(dòng)。唐天德等[14]認(rèn)為, 魚(yú)類精子均適于在中性和偏堿性環(huán)境中活動(dòng), 酸性環(huán)境會(huì)破壞精子細(xì)胞, 抑制精子活力。據(jù)報(bào)道, 草魚(yú)()、鯉()和烏鱧()等淡水魚(yú)類精子活力最強(qiáng)時(shí)的適宜pH值均在7.5~9.0, 即在弱堿性范圍內(nèi)[15], 眼斑擬石首魚(yú)()、點(diǎn)帶石斑魚(yú)()等海水魚(yú)類精子活力最適pH范圍分別是6.5~8.5、6.5~8.0, 也在弱堿性范圍內(nèi)[16-17]。在本試驗(yàn)中大菱鲆精子活力最強(qiáng)時(shí)的pH為8.0, 這一結(jié)果與其他魚(yú)類一致。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)激活30s時(shí), 在較低pH組的樣品中也有運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)值較高的樣品, 且這些精子的各運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)均處于較高水平, 但是與高pH下同等活力的樣品相比, 它們的壽命卻明顯縮短, 即低pH的精子激活后雖然在短期內(nèi)活力較高但持久性較差。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)采集精液時(shí)尿液摻入會(huì)顯著降低pH和精子活力甚至殺死精子, 因此生產(chǎn)中采集精液時(shí)應(yīng)避免尿液的摻入。

將精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間和活化率綜合考慮能更好地反映精子的運(yùn)動(dòng)能力。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 隨著激活后時(shí)間的推移, 精子活化率明顯下降, 4家公司精液質(zhì)量的差異可能是由于飼養(yǎng)條件不同所導(dǎo)致的。值得一提的是, 作者發(fā)現(xiàn)同一地點(diǎn)2次取樣精子質(zhì)量差異較大, 第二次明顯好于第一次, 兩次取樣時(shí)間分別是大菱鲆產(chǎn)精初期和中期, 間隔1個(gè)月左右, 說(shuō)明大菱鲆繁殖期中期精液質(zhì)量高于初期, 這與韓明明等[18]研究結(jié)果相一致。

通過(guò)作者的研究發(fā)現(xiàn), 甘油的加入延長(zhǎng)了精子激活后的運(yùn)動(dòng)時(shí)間, 最適濃度為100 mmol/L, 濃度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)降低精子壽命。在精子活力維持方面, 已知糖類(如葡萄糖、果糖)等外源物質(zhì)能夠促進(jìn)精子的活力[7-8], Gardiner[19]認(rèn)為, 體外受精魚(yú)類精子具有三羧酸循環(huán)代謝的能力。魚(yú)類可以通過(guò)氧化作用利用細(xì)胞外源性碳水化合物, 尤其是葡萄糖、半乳糖和果糖[20]獲得能量。而精子細(xì)胞內(nèi)的甘油氧化分解產(chǎn)生的中間產(chǎn)物能夠參與糖酵解過(guò)程, 提供能量, 促進(jìn)精子活力的維持[9-11]。因此, 推測(cè)外源甘油能夠在大菱鲆精子激活時(shí)迅速進(jìn)入精子細(xì)胞并被精子細(xì)胞氧化分解, 提供能量, 從而延長(zhǎng)精子激活后的運(yùn)動(dòng)時(shí)間。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了采自4個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)共5批大菱鲆精子8個(gè)運(yùn)動(dòng)特征參數(shù), 其中平均曲線運(yùn)動(dòng)速度、平均直線運(yùn)動(dòng)速度、平均路徑速度、精子頭側(cè)擺幅度、精子平均鞭打頻率與精液pH或活化率成正相關(guān)關(guān)系, 運(yùn)動(dòng)的直線性、運(yùn)動(dòng)的前向性、運(yùn)動(dòng)的擺動(dòng)性與精液pH或活化率相關(guān)性不顯著。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)活化率高、精子壽命長(zhǎng)的大菱鲆精液pH偏弱堿性, 即大菱鲆精子適宜在弱堿性環(huán)境中活動(dòng)。某些低pH的精子激活后雖然在短期內(nèi)活力較高但持久性較差。尿液會(huì)顯著降低精液的pH和精子活力, 甚至殺死精子。大菱鲆繁殖期中期精液質(zhì)量高于初期。

甘油的加入延長(zhǎng)了精子激活后的運(yùn)動(dòng)時(shí)間, 最適濃度為100 mmol/L。作者推測(cè)外源甘油能夠在大菱鲆精子激活時(shí)迅速進(jìn)入精子細(xì)胞并被氧化分解, 提供能量, 從而延長(zhǎng)精子激活后的運(yùn)動(dòng)時(shí)間。

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Analysis of turbot () sperm motion characteristics and relationship with pH

AN Hao1, 2, 3, XU Shi-hong1, 3, FENG Cheng-cheng1, 2, 3, WANG Yan-feng1, 3, LIU Qing-hua1, 3, LI Jun1, 3

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266237, China)

This study investigated the relationship between semen quality and pH of turbot () and the impact of glycerin on turbot sperm activation using turbot sperm from different hatcheries (A, B, C, and D) through the computer-assisted sperm analysis (CASA) system. The results showed that sperm motility rates were different in the four hatcheries, A2> A1> D > C > B. The predicted sperm longevity times were 11.7, 7.1, 6.8, 4.6, and 3.3 min, respectively.

The motility rates of turbot sperm significantly positively correlated with VCL, VSL, VAP, ALH, and BCF (< 0.05), but no significant correlation was observed with LIN, WOB, and STR. We found that the pH of turbot sperm significantly positively correlated with motility, VCL, VSL, VAP, ALH, and BCF(< 0.05), whereas no significant correlation was found with LIN, WOB, and STR. In addition, high-quality sperm exhibited a weak alkalinity with a pH of 8.0.

We also found that an appropriate concentration of glycerol (100 mmol/L) in sea water was useful for maintaining the longevity.

; sperm; motion characteristics; pH

(本文編輯: 譚雪靜)

Q256

A

1000-3096(2017)07-0037-07

10.11759//hykx20170119006

2017-01-19;

2017-03-22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31472264, 31572602); 鰲山科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目 (2015ASKJ02, 2015ASKJ02-03-03); 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-47)

[National Natural Science Foundation of China, No.31472264, 31572602; the Scientific and Technological Innovation Project , No.2015ASKJ02, 2015ASKJ02-03-03; Modern Agro-industry Technology Research System, No.CARS-47]

安皓(1992-), 男, 山東日照人, 碩士研究生, 主要從事魚(yú)類生理學(xué)研究, E-mail: anhao14@mails.ucas.ac.cn; 李軍, 通信作者, 研究員, E-mail: junli@qdio.ac.cn; 劉清華, 通信作者, 副研究員, E-mail: qinghualiu@qdio.ac.cn

Jan. 19, 2017