蒲 洋, 李文軍, 王 凱, 趙彥宏, 秦 松

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煙臺市區(qū)河流入?？谖⑸锶郝涞姆治?/p>

蒲 洋1, 李文軍2, 王 凱3, 趙彥宏1, 秦 松2

(1. 魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 山東煙臺 264025; 2. 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所, 山東煙臺 264003; 3. 上海海洋大學(xué), 上海 200090)

2015年4月在煙臺市區(qū)4條主要河流(辛安河、逛蕩河、魚鳥河和夾河)入?？谔幉杉?2個樣品, 利用PCR-DGGE方法分析了此區(qū)域的細(xì)菌群落組成和優(yōu)勢菌群。通過統(tǒng)計學(xué)手段對DGGE圖譜進(jìn)行分析, 結(jié)果表明4條河流入?？诩?xì)菌群落豐富度都較高, 12個取樣點擴增的DGGE條帶數(shù)都在30以上, 樣品的Shannon指數(shù)均高于3.3, 個別甚至可達(dá)3.61。其中, 辛安河和逛蕩河的Shannon指數(shù)平均值均高于魚鳥河和夾河, 夾河多樣性最低; 而且UPGMA聚類分析結(jié)果顯示地理位置越接近, 其細(xì)菌組成的相似度越高。在DGGE電泳條帶中選取14條主要條帶進(jìn)行擴增和序列測定, 所得到的序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)4條河流入?？诘膬?yōu)勢菌群主要為變形桿菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。這與近年來關(guān)于山東近岸海域細(xì)菌多樣性的研究結(jié)果相符合, 為研究和保護(hù)煙臺市區(qū)河口處環(huán)境提供科學(xué)依據(jù)。

煙臺; 河流入?？? PCR-DGGE; 微生物多樣性分析

海洋浮游細(xì)菌對海洋生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定有著十分重要的作用[1], 其活動規(guī)律也受到近岸海域和海洋環(huán)境的影響, 通過調(diào)查研究近岸河口細(xì)菌的基本生態(tài)狀況, 可以初步反映環(huán)境變化及海洋健康狀態(tài), 對于進(jìn)一步評價河道水質(zhì)恢復(fù)狀況非常必要[2]。

變性梯度凝膠電泳(Denatured Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)由Lerman等發(fā)明, 剛開始主要被用來檢測DNA片段中的點突變, 1993 年開始, Muyzer等[3]、Earing等[4]和Zhang等[5]將DGGE應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究中。利用針對16S rRNA的PCR-DGGE方法, 對各種環(huán)境內(nèi)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分子生態(tài)學(xué)研究。相比于傳統(tǒng)先培養(yǎng)再分析鑒定的方法, 它擁有快速、簡便、突變檢出率高等優(yōu)點, 并且對不可培養(yǎng)的微生物也可起到分離鑒定的效果, 不但改變了繁瑣的基于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的程序, 而且大大加深和擴展了對種群時空變化情況的理解和認(rèn)識[6-9]。隨著這種技術(shù)的發(fā)展和優(yōu)化, 其被廣泛用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個領(lǐng)域, 包括細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、古菌群落的生物多樣性, 目前已經(jīng)發(fā)展成為研究細(xì)菌特定環(huán)境群落結(jié)構(gòu)主要分子生物學(xué)方法之一[10-11]。

之前的相關(guān)報道對山東近岸海域、黃海北部、黃海西北部和黃海冷水團(tuán)的水體和沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性有過相關(guān)調(diào)查研究, 確定了山東半島沿岸相關(guān)海域中的優(yōu)勢群落的優(yōu)勢菌群主要為變形桿菌門(Proteobacteoriate)、擬桿菌門(Bacteroidetescidal)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)和浮霉菌門(Planctomycetes)等[2, 12-15]。但是對于地處山東半島東北部的黃海沿岸河流入?？谶@一受人類活動影響極大的區(qū)域相關(guān)的研究還未涉及到。煙臺, 地處山東半島東北部, 是山東省重要的海濱旅游城市。煙臺4個市轄區(qū)(芝罘區(qū)、萊山區(qū)、福山區(qū)、牟平區(qū))是煙臺經(jīng)濟(jì)發(fā)展的中心區(qū)域, 人口密集,生產(chǎn)活動頻繁, 故而生態(tài)環(huán)境所面臨的壓力也較大。本次研究選取2015年4月的辛安河、逛蕩河、魚鳥河和夾河的河流入海口為研究區(qū)域。這4條河均位于4個市轄區(qū)內(nèi), 流入黃海。其中, 辛安河及魚鳥河位于牟平區(qū)和萊山區(qū)之間, 逛蕩河位于萊山區(qū), 源于鳳凰山水庫, 夾河位于福山區(qū), 流域面積較大。選取這4條河的河流入?？谒驑悠纷鳛檠芯繉ο? 利用PCR-DGGE檢測技術(shù), 可以在較大的深度和廣度上對煙臺近岸河流入海口海域春季的細(xì)菌群落組成進(jìn)行全面分析, 同時能夠初步了解其河道生態(tài)系統(tǒng)的概況[16], 同時可以與近岸相關(guān)研究進(jìn)行比較, 因此進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究具有重要意義, 能夠為進(jìn)一步積累和豐富特定近岸海域的生態(tài)資料, 研究和保護(hù)煙臺市區(qū)河口處的近岸環(huán)境資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料獲取及處理

研究材料為2015年4月份所采集的煙臺4條河流入海口區(qū)域水樣, 取樣地點分別為辛安河(121°32′15″E, 37°26′30″N)、逛蕩河(121°28′2″E, 37°28′14″N)、夾河(121°17′52″E, 37°34′36″N)、魚鳥河(121°34′25″E, 37°26′25″N)的河流入?？趨^(qū)域。每條河流入?？谠O(shè)3個取樣點, 均在表層30 cm處取樣, 所采水樣于冰盒中密封。所取水樣用25 μm篩絹過濾, 再用0.22 μm的濾膜抽濾, 保留抽濾后的濾膜進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品細(xì)菌宏DNA獲取

采用FastDNATMSPIN Kit試劑盒, 按操作說明提取樣品基因組DNA。

1.2.2 細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴增

以樣品基因組DNA為模板, 采用細(xì)菌通用引物GC-338F和518R擴增樣品16S rDNA高變區(qū)序列(表1)。

表1 PCR所用引物序列

PCR擴增體系(50 μL)為: 10× PCR buffer 5 μL; dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3.2 μL;(5 U/μL)0.4 μL; 上游引物GC-338F(20 μmol/L)1 μL; 下游引物518R(20 μmol/L)1 μL; 模板DNA 1μL; 補ddH2O至50 μL。PCR擴增程序為: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性1 min, 55℃復(fù)性45 s, 72℃延伸1 min, 30個循環(huán); 最終72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的DGGE分析

取10 μL 純化回收產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。使用變性梯度為35%~55%、含量為7%的聚丙烯酰胺凝膠在1×TAE緩沖液中150 V, 60℃下電泳5 h, 完畢后, 采用銀染法進(jìn)行染色。

1.2.4 DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶的回收與測序

選取具有代表性的DGGE條帶(14條), 切下并回收目的條帶。以2 μL回收產(chǎn)物作為模板, 338F/518R作為引物再次進(jìn)行PCR擴增。將新擴增的DNA片段回收并純化后, 連接到Pmd18-T載體上, 并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中, 篩選陽性克隆, 每個回收條帶選取3個克隆進(jìn)行序列測定。然后登錄NCBI (http: www.ncbi.nlm.nih.gov blast), 在GeneBank數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行檢索和同源性比對[17-19]。

1.2.5 圖譜統(tǒng)計分析

DGGE圖譜采用Quantity one軟件對每個樣品的電泳條帶數(shù)目、條帶密度進(jìn)行數(shù)字化分析, 香農(nóng)指數(shù)()、豐度()和均衡指數(shù)()等指標(biāo)被用來比較不同樣品的多樣性情況[19-20]。其算法如下:

= –∑PlnP= –∑(N/) ln (N/)

/max/ln

其中,P為樣品中單一條帶的強度在該樣品所有條帶總強度中所占的比率,為DGGE圖譜單一泳道上所有條帶的豐度,N為第條帶的豐度;是某樣品中所有條帶數(shù)目總和。

測序結(jié)果采用DNAstar和Cluster軟件進(jìn)行序列分析, 根據(jù)序列比對結(jié)果, 下載最相似的菌株序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列。然后采用MEGA5.0軟件中的鄰接法(N-J法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴增

以提取的過濾膜總DNA為模板, 以GC-338F和518R為引物擴增16S rDNA序列, 得到目的DNA片段。其中, 1、2、3為辛安河入海口水樣, 4、5、6為逛蕩河入?？谒畼? 7、8、9為魚鳥河入?？谒畼? 10、11、12為夾河入?？谒畼印?/p>

如圖1所示, 目的片段大小為180 bp, 擴增特異性很好, 獲得的目的條帶可進(jìn)一步用于DGGE分析。

圖1 12個樣品的16S rDNA基因PCR電泳圖譜

2.2 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)圖譜及相似度分析

各采樣點細(xì)菌組成的DGGE圖譜如圖2, 可以看出在本次所研究的4個地點的12個樣品中, 共擴增出64條電泳條帶, 每條泳道的條帶數(shù)目較多(圖2A), 均在30以上, 表明所調(diào)查地點的細(xì)菌多樣性很高。同時, 個別條帶(如#5, #29, #32等)在12個泳道中均有出現(xiàn), 說明#5、#29和#32所代表的種群在所有樣品中是普遍存在的, 而條帶的亮度代表了該種群在環(huán)境中的數(shù)量, 亮度越高, 數(shù)量越多, 意味著#29和#32應(yīng)該是所有樣品的優(yōu)勢種群。而有些條帶(如#16、#36、#63、#64)只出現(xiàn)在夾河入?？跇悠?10、11、12)中, 說明該條帶所代表的種群可能是該取樣點的特有種群。

圖2 12個樣品的DGGE圖譜及聚類分析

香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)的高低反映了一個環(huán)境中物種多樣性的高低, Shannon指數(shù)越高, 表明該環(huán)境中物種越豐富。由表2看出, 本次實驗12個樣品的Shannon指數(shù)均高于3.3, 甚至個別可達(dá)3.61, 表明樣品整體的多樣性較高。其中, 辛安河樣品(1~3)和逛蕩河樣品(4~6)的香濃指數(shù)平均值相同, 而且均高于魚鳥河樣品(7~9)和夾河樣品(10~12), 夾河多樣性最低。

通過UPGMA聚類分析圖(圖2B)和主成分分析圖(PCA, 圖3)可以清楚地看出, 同一河流入?？诘?個樣品間的微生物組成相似度很高; PCA分析圖顯示了PC1的貢獻(xiàn)度為33.7%, PC2的貢獻(xiàn)度為24%, 并且沒有樣品能夠聚集在一起, 說明了取樣點之間的細(xì)菌組成具有一定的差異。并且, 辛安河(樣品1~3)、逛蕩河(樣品4~6)及魚鳥河(樣品7~9)由于地理位置相距較近, 所以細(xì)菌組成相似度較高; 辛安河(樣品1~3)和魚鳥河(樣品7~9)相距更近, 因此微生物組成相似度更高一些, 而夾河入海口(樣品10~12)位于煙臺西北方, 故而微生物組成與其他3處相差較大。

共對14條代表性的DGGE凝膠條帶進(jìn)行切割回收, 這14條條帶包括: 4個地點共有條帶(#29, #40), 辛安河、逛蕩河及魚鳥河共有條帶(#46), 夾河獨有條帶(#16, #36, #63), 魚鳥河獨有條帶(#25), 辛安河獨有條帶(#23), 逛蕩河獨有條帶(#38)以及其他亮度明顯的條帶。代表性條帶按照上述相同程序再次進(jìn)行PCR擴增并進(jìn)行序列測定, 測序結(jié)果的比對分析見表3。采用MEGA5軟件, Neighbor-joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

表2 12個樣品之間的香農(nóng)指數(shù)

圖3 12個不同樣品間的主成分分析圖

表3 DGGE代表性條帶的比對結(jié)果

圖4 4條河流入海口細(xì)菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育圖譜

主要代表性條帶進(jìn)行序列鑒定并通過GeneBank 數(shù)據(jù)庫比對分析表明: 全部測序序列的16S rDNA與數(shù)據(jù)庫中序列的相似性在95%~100%之間, 相似性較高可以認(rèn)為條帶代表菌株與GeneBank中的菌株為同種菌株[21]。可看出, 4個河流入?？诘墓餐瑑?yōu)勢菌群為變形菌門(Proteobaceria)的玫瑰變色菌屬()和擬桿菌門(Bacteroidetes)的擬桿菌屬(); 此外, 辛安河、逛蕩河及魚鳥河3個河流入?？诘膬?yōu)勢菌群還有變形菌門的居冰菌屬(); 夾河入海口優(yōu)勢種群還包括變形菌門的假單胞菌屬()、弓形菌屬()以及氣單胞菌屬(); 魚鳥河入海口的優(yōu)勢種群還包括擬桿菌門的極地桿菌屬(), 辛安河入?？诘膬?yōu)勢種還包括變形菌門的海單胞菌屬(); 逛蕩河入?？诘膬?yōu)勢種群包括擬桿菌門的黃桿菌屬()。

3 討論與結(jié)論

本文采用PCR-DGGE方法對煙臺河流入?？谶M(jìn)行微生物群落的分析鑒定, 實驗結(jié)果表明煙臺市4大河流(辛安河、逛蕩河、魚鳥河及夾河)入?？谖⑸镓S富度及多樣性都很高, 這可能是由于春天氣溫回暖, 水體中微生物繁殖速度加快, 再加上地處入?？谶@樣的咸淡水交匯區(qū), 營養(yǎng)物質(zhì)較為豐富, 所以微生物多樣性較高。還有更重要的原因就是, 本次實驗所選的地點都處于人類活動較為頻繁的區(qū)域, 這也可能會造成水中微生物的大量繁殖。

另外, 序列分析表明, 4個河流入?？诘募?xì)菌類群分布表現(xiàn)出了明顯的地理空間分布上的相關(guān)性, 優(yōu)勢菌群主要為變形菌門(Proteobcteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes), 此結(jié)論與近年來國內(nèi)有關(guān)黃海海域微生物多樣性的研究結(jié)果部分一致[2, 14-15, 22-23]。變形菌門(Proteobacteria)的主要類群為γ-Proteobacteria變形菌綱, 此外還包含α-Proteobacteria變形菌綱、ε-Proteobacteria變形菌綱。魚鳥河入?？诘膬?yōu)勢種群還包括擬桿菌門的極地桿菌屬(), 逛蕩河入?？诘膬?yōu)勢種群也有擬桿菌門的黃桿菌屬()。γ-Proteobacteria變形菌綱適應(yīng)性強, 分布范圍廣, 在4個河流入海口均有發(fā)現(xiàn)。α-Proteobacteria變形菌綱在陸地土壤環(huán)境中占優(yōu)勢, 有可能是河流將泥沙帶入入海口造成的[21]。其中夾河入?？趦?yōu)勢種群變形菌門的氣單胞菌屬()和逛蕩河入海口的優(yōu)勢種群擬桿菌門的黃桿菌屬()為兼性厭氧菌, 常見于低氧水體[2]?？赡苡捎诖藘商幒恿骱胸S富且組成更為復(fù)雜的有機質(zhì), 微生物的分解導(dǎo)致水體含氧量下降[14]。

各水域的細(xì)菌種群多樣性不同, 與所處的生態(tài)環(huán)境息息相關(guān), 如果生態(tài)環(huán)境改變, 細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)也會發(fā)生變化[22, 24]。進(jìn)一步考察季節(jié)等因素如何影響入?？谔幖?xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化, 對進(jìn)一步了解煙臺市區(qū)河流入海口環(huán)境狀況, 改善河口海域水體質(zhì)量, 維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性及開發(fā)利用此生態(tài)環(huán)境的微生物資源具有重要意義。

[1] 臧紅梅, 樊景鳳, 王斌, 等. 海洋微生物多樣性的研究進(jìn)展[J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 2006, 25(3): 96-100.Zang Hongmei, Fan Jingfeng, Wang Bin, et al. Research progress on marine microbial diversity[J]. Marine Environmental Science, 2006, 25(3): 96-100.

[2] 劉敏, 朱開玲, 李洪波, 等. 應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)分析黃海冷水團(tuán)海域的細(xì)菌群落組成[J]. 環(huán)境科學(xué), 2008, 29(4): 1082-1091. Liu Min, Zhu Kailing, Li Hongbo, et al. Bacterial com-m-unity composition of the Yellow Sea cold water mass studied by PCR-denaturing gradient gel electrop-horesis[J]. Environmental Science, 2008, 29(4): 1082- 1091.

[3] Muyzer G, De waal E C, Uitterlinden A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction- amplified genes coding for 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(3): 695-700.

[4] Earing J E, Durig A C, Gellin G L, et al. Bacterial colonization of the equine gut; Comparison of mare and foal pairs by PCR-DGGE[J]. Advances in Microbiology, 2012, 2(2): 79-86.

[5] Zhang Yi, Wang Gaochan, Wu Yupeng, et al. PCR-DGGE analysis of earth-worm gut bacteria diversity in stress of0157: H7[J]. Advances in Bioscience and Biotechnolog, 2013, 4(3): 437-441.

[6] Yu Zhongtang, Morrison M. Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in finger-printing of microbial communities by PCR-Denaturing gradient gel electrophoresis[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(8): 4800-4806.

[7] 邢德峰, 任南琪. 應(yīng)用DGGE研究微生物群落時的常見問題分析[J]. 微生物學(xué)報, 2006, 46(2): 331-335. Xing Defeng, Ren Nanqi. Common problems in the analyses of microbial community by denaturing gradient gel Electrophoresis (DGGE)[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2006, 46(2): 331-335.

[8] Muyzer G, Smalla K. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient ge-le-lectrophoresis (TGGE) in microbial ecology[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 1998, 73(1): 127-141.

[9] Watanabe T, Asakawa S, Nakamura A, et al. DGGE method for analyzing 16S rDNA of methanogenic archaeal community in paddy field soil[J]. FEMS Microbiology Letters, 2004, 232(2): 153-163.

[10] 馬悅欣, Holmstrm C, Webb J, 等. 變性梯度凝膠電泳(DGGE)在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用[J]. 生態(tài)學(xué)報, 2003, 23(8): 1561-1569. Ma Yuexin, Holmstrm C, Webb J, et al. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in microbial ecology[J]. Acta Ecologica Sinica, 2003, 23: 1561-1569.

[11] 周琳, 張杰. 群落分析中的16S rRNA及其基因16S rDNA優(yōu)化擴增[J]. 微生物學(xué)報, 2010, 50(1): 7-14. Zhou Lin, Zhang Jie. 16S rRNA gene in community structure analysis and the optimized amplification[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2010, 50(1): 7-14.

[12] 肖慧, 張喆, 張艷, 等. 春秋季山東南部近岸浮游細(xì)菌生態(tài)分布[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報, 2009, 39(4): 652- 656. Xiao Hui, Zhang Zhe, Zhang Yan, et al. Distribution characteristics of bacterioplankton in spring and autumnin costal waters of South Shandong[J]. Periodical of Ocean University of China, 2009, 39(4): 652-656.

[13] 白潔, 李海艷, 趙陽國.黃海北部不同站位海洋細(xì)菌群落分布特征[J]. 微生物學(xué)報, 2009, 49(3): 343-350.Bai Jie, Li Haiyan, Zhao Yangguo. Bacterial distribution at different stations in the Northern Yellow Sea[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2009, 49(3): 343-350.

[14] 張健, 趙陽國, 李海艷, 等. 黃海西北近岸沉積物中細(xì)菌群落空間分布特征[J]. 海洋學(xué)報, 2010, 32(2): 118-127. Zhang Jian, Zhao Yangguo, Li Haiyan, et al. Temporal and spatial distribution characterization of bacterial community in sediments from the inshore of the northwest Huanghai Sea[J]. Acta Oceanologica Sinica, 2010, 32(2): 118-127.

[15] 李海艷. 黃海西北部真細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2009. Li Haiyan. Study of the eubacterial community structure and diversity in the northwest of Yellow sea[D]. Qing Dao: Ocean University of China, 2009.

[16] 周燕飛, 彭三妹, 王博林, 等.不同污水中細(xì)菌多樣性DGGE檢測[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2015, 31(8): 1075-1079. ZhouYanfei, Peng Sanmei, Wang Bolin, et al. Detection of bacterial diversity in clean and contaminated surface water with DGGE[J]. Chinese Journal of Public Health, 2015, 31(8): 1075-1079.

[17] 王雅蘋, 史曉翀, 于少蘭, 等. 青島潮間帶沉積物可培養(yǎng)厭氧細(xì)菌多樣性的研究[J]. 海洋科學(xué). 2015, 39(3): 92-99. Wang Yaping, Shi Xiaochong, Yu Shaolan, et al. Diversity of culturable anaerobic bacteria isolated from intertidal sediments of Qingdao[J]. Marine Sciences, 2015, 39(3): 92-99.

[18] 王恩輝, 張曉黎, 張瑩, 等. 山東半島北岸不同生境潮間帶浮游細(xì)菌多樣性研究[J]. 海洋科學(xué). 2016, 40(6): 8-16. Wang Enhui, Zhang Xiaoli, Zhang Ying, et al. Bacterioplankton diversity in different littoral habitats along the coast of the northern Shandong peninsula[J]. Marine Sciences, 2016, 40(6): 8-16.

[19] 趙興青, 楊柳燕, 陳燦, 等. PCR-DGGE技術(shù)用于湖泊沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性研究[J]. 生態(tài)學(xué)報, 2006, 26(11): 3610-3616. Zhao Xingqing, Yang Liuyan, Chen Can, et al. Study on the microbial diversity in lake sediments by the method of PCR-DGGE[J]. Acta Ecologica Sinica, 2006, 26(11): 3610-3616.

[20] Ravenschlag K, Sahm K, Peruthaler J, et al. High bacterial diversity in permanently cold marine sediments[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(9): 3982-3989.

[21] 張喆. 山東近岸海域浮游細(xì)菌、病毒生態(tài)學(xué)調(diào)查及沉積物細(xì)菌多樣性研究[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2008. Zhang Zhe. Distribution characteristics of bacterioplankton and virioplankton and bacterial diversity in sediments in coastal line of Shandong[D]. Qing Dao: Ocean University of China, 2008.

[22] 張艷. 山東近岸海域水體細(xì)菌多樣性研究[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2010. Zhang Yan. Diversity of bacterial communities in coastal areas of Shandong Province[D]. Qing Dao: Ocean University of China, 2010.

[23] 付新華, 劉國寧, 何健龍, 等. 山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)典型海域表層海水微生物群落多樣性分析[J]. 海洋科學(xué), 2017, 41(1): 39-47. Fu Xinhua, Liu Guoning, He Jianlong, et al. Analysis of microbial community diversity in the Bohai Sea marine protected areas of the Shandong Province[J]. Marine Sciences, 2017, 41(1): 39-47.

[24] 姜彩虹, 張美玲, 陶琰潔, 等. 上海市內(nèi)不同水質(zhì)的河道春季浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析[J]. 微生物學(xué)通報, 2009, 36(4): 522-527.Jiang Caihong, Zhang Meiling, Tao Yanjie, et al. Bacterial community structure in four different rivers of Shanghai in Spring[J]. Microbiology, 2009, 36(4): 522-527.

Analysis of microorganism community in river estuaries of Yantai

PU Yang1, LI Wen-jun2, WANG Kai3, ZHAO Yan-hong1, QIN Song2

(1. School of Agriculture, Ludong University, Yantai 264025, China; 2. Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China; 3. Shanghai Ocean University, Shanghai 200090, China)

A total of 12 water samples were collected from four river estuaries of Yantai city (Xin,an River, Guangdang River, Yuniao River, and Jiahe River, respectively) in April 2015. The structure of the bacterial community and the dominant groups were examined by PCR-Denatured Gradient Gel Electrophoresis based on 16S rRNA PCR amplification(PCR-DGGE). Results of the analysis demonstrated the presence of high diversities and enrichment in the four river estuaries. Each of the 12 samples showed more than 30 bands, and the Shannon bacterial diversity index varied from 3.3 to 3.61. The Shannon bacterial diversity index was higher in Xinan River and Guangdang River, lower in Yuniao River, and the lowest in Jiahe River. The cluster analysis, by UPGMA analysis, showed that the closer the geographical position was, the higher was the similarity of the bacteria. A total of 14 major DGGE bands were cloned and sequenced. Phylogenetic analysis of the 14 samples showed that Proteobacteria and Bacteroidetes were dominant in the four river estuaries. These results were highly consistent with those of a previous study on the diversity of bacterial communities in the coastal areas of Shandong province. This study could be useful for protecting the environment in the river estuaries of Yantai.

Yantai; river estuaries; PCR-DGGE; microorganism diversity analysis

(本文編輯: 張培新)

P6040

A

1000-3096(2017)07-0009-07

10.11759/hykx20170112002

2017-01-12;

2017-05-17

魯東大學(xué)科研啟動基金(ly2014041); 山西省煤基重點科技攻關(guān)項目(FT2014-01)

[Ludong University Research Initiation Funds, No.ly2014041; Key Project of Coal-based Science and Technology in Shanxi Province, No. FT2014-01]

蒲洋(1981-), 男, 河北衡水人, 講師, 主要從事分子藻類學(xué)的研究, 電話: 13884664603, E-mail: c5h12o6@sohu.com

Jan.12, 2017