劉金鳳，黃鵬，唐昭山，曾建國(guó)*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410005)

·綜述·

博落回中芐基異喹啉類生物堿生物合成與代謝工程研究概況△

劉金鳳1，黃鵬1，唐昭山2，曾建國(guó)1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410005)

植物生長(zhǎng)產(chǎn)生多種多樣的次生代謝產(chǎn)物，其中許多還有非常重要的藥用價(jià)值。但是植物中具有藥用價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物含量較低，而利用微生物代謝工程技術(shù)可以為次生代謝產(chǎn)物提供新的藥源途徑。本文對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物特別是博落回屬植物中芐基異喹啉類生物堿的生物合成以及國(guó)內(nèi)外研究中利用微生物代謝工程技術(shù)在酵母中異源表達(dá)生產(chǎn)芐基異喹啉類生物堿的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，同時(shí)結(jié)合博落回研究進(jìn)展對(duì)未來博落回資源的綜合利用進(jìn)行展望。

芐基異喹啉類生物堿；博落回；生物合成；微生物代謝工程

1 植物次生代謝產(chǎn)物

植物在次生代謝(Secondary metablism)過程中通常以一個(gè)特定的方式合成、運(yùn)輸和儲(chǔ)存多種不同類型的次生代謝產(chǎn)物(Secondary metabolites)，這些次生代謝產(chǎn)物不參與植物的初級(jí)代謝或能量代謝，是植物生長(zhǎng)非必需的小分子有機(jī)化合物。在植物的生物進(jìn)化過程中，它們可以作為一種保護(hù)自己的內(nèi)生物質(zhì)用于防御病蟲害以及細(xì)菌、真菌、病毒等的侵襲[1-4]。

根據(jù)已經(jīng)被鑒定出的次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，可以將其分為含氮和不含氮兩種類型。在含氮的次生代謝產(chǎn)物中，生物堿結(jié)構(gòu)類型超過了20 000種[5]。已經(jīng)被分離鑒定和具有重要藥用價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物包括具有抗腫瘤作用的長(zhǎng)春花堿、紫杉醇、喜樹堿等，具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)咳作用的罌粟堿、可待因、嗎啡等，具有鎮(zhèn)咳作用的二甲基嗎啡、諾司卡品等，具有鎮(zhèn)靜作用的東莨菪堿、利血平等，具有抗菌作用的小檗堿、血根堿等，具有抗瘧作用的金雞納堿、青蒿素等，可作為男性保健品的育亨賓堿等[6-8]。在無氮的次生代謝產(chǎn)物中，也有很多的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被鑒定，其中最大的一類是萜類，其中的半萜、倍半萜、二萜和三萜都有很重要的生物活性[6-7，9]；另外一類具有生物活性的無氮次生代謝產(chǎn)物是多酚類，其特點(diǎn)是存在多個(gè)酚羥基，這些酚羥基在生理?xiàng)l件下可離解為氧負(fù)離子，從而發(fā)揮良好的生物活性[2]。此外，含有酚羥基的化合物還有木脂素類、香豆素類、糖類和醌類等化合物[3-4]。

2 博落回中芐基異喹啉類生物堿的生物合成

芐基異喹啉類生物堿是博落回中的重要活性成分。比如血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿等。在其他物種中芐基異喹啉類生物堿的生物合成屢見報(bào)道[10-15]，包括四氫異喹啉類、嗎啡烷、原小檗堿、苯并菲啶和阿樸菲生物堿等的生物合成，其中四氫異喹啉類、嗎啡烷和原小檗堿的生物合成途徑幾乎已完全被闡明，大部分的相關(guān)基因被成功克隆和表達(dá)[16-23]。芐基異喹啉生物堿由苯丙氨酸和酪氨酸衍生而來，并在復(fù)雜的生化網(wǎng)絡(luò)中經(jīng)由分子內(nèi)耦合、還原、甲基化、羥基化等反應(yīng)生成多種結(jié)構(gòu)[10]。目前芐基異喹啉生物堿生物合成基因的主要來源植物是罌粟Papaversomniferum、花菱草Eschscholziacalifornica、墨西哥薊罌粟Argemonemexicana、日本黃連Coptisjaponica、草甸蕓香Thalictrumflavum、伏牛Berberiswilsoniae[24]以及博落回屬植物[25]。見圖1。

注：實(shí)線代表一步反應(yīng)；虛線代表多步反應(yīng)；BBE.小檗堿橋酶；CFS.華紫堇堿合酶；SMT.金黃紫堇堿9-O-甲基轉(zhuǎn)移酶；TDC.四氫小檗堿合酶；SPS.金罌粟堿合酶；TNMT.四氫化原小檗堿cis-N-甲基轉(zhuǎn)移酶；MSH.P450依賴型N-甲基刺罌粟堿14-羥化酶；P6H.原阿片堿6-羥化酶；DBOX.二氫苯并菲啶氧化酶。圖1 博落回中主要生物堿生物合成簡(jiǎn)圖

3 酵母代謝工程生產(chǎn)BIAs

酵母是重建復(fù)雜的植物化合物生物合成途徑的微生物首選，主要原因是酵母有一個(gè)可以利用的全基因組代謝模型，并且許多植物的酶，比如細(xì)胞色素P450、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶和FAD-依賴型氧化還原酶，都需要一個(gè)最佳的表達(dá)活性的真核細(xì)胞環(huán)境。近年來，國(guó)外一些學(xué)者在酵母中構(gòu)建了BIAs的生物合成途徑。如，Martin團(tuán)隊(duì)[26]將罌粟中血根堿生物合成通路上的多個(gè)基因重組到酵母中，實(shí)現(xiàn)了多基因在酵母中的共表達(dá)，并生成高藥用價(jià)值的血根堿。Hawkins等[27]通過基因重組，在酵母中合成了BIAs生物合成通路中的重要中間體(S)-reticuline。D.Smolke團(tuán)隊(duì)[28]通過構(gòu)建不同物種的細(xì)胞色素P450和還原酶基因的重組酵母，并進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，提高了BIAs在酵母中生產(chǎn)的產(chǎn)量，同時(shí)還對(duì)原小檗堿生物堿在酵母中的合成進(jìn)行了優(yōu)化[29]。2015年，SCIENCE報(bào)道了Galanie等在酵母中實(shí)現(xiàn)了嗎啡的全合成[30]，這也是首次實(shí)現(xiàn)嗎啡在酵母中的全合成，該研究為今后實(shí)現(xiàn)其他BIAs的全合成奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4 博落回屬植物中BIAs生物合成進(jìn)展

博落回屬植物包括博落回和小果博落回，其中含有的血根堿、白屈菜紅堿等BIAs具有良好的抑菌、抗炎作用，在歐洲已成為飼用抗生素的良好替代品[25]。從2006年1月開始?xì)W盟全面禁止在飼料中添加任何抗生素，導(dǎo)致血根堿的需求逐年增加。目前血根堿的主要來源是從博落回植株中提取，而博落回作為一種野生資源，這種獲取方式導(dǎo)致其野生資源的存儲(chǔ)量逐年減少。由于還未實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的人工種植，導(dǎo)致了目前只能通過獲取野生資源來提取血根堿。又由于芐基異喹啉類生物堿分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，通過化學(xué)合成血根堿的成本很高，也不利于產(chǎn)品開發(fā)[31]。雖然利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物在一定程度上能緩解藥用植物資源的緊缺，但是由于次生代謝物的細(xì)胞內(nèi)自毒性高，使得許多組培材料中的次生代謝產(chǎn)物不積累或者含量很低，再加上生產(chǎn)成本較高等因素限制了組培技術(shù)的利用。因此，找到一種可替代和可持續(xù)高效生產(chǎn)BIAs的方法是當(dāng)務(wù)之急。雖然國(guó)際上已有一些科研團(tuán)隊(duì)正在進(jìn)行產(chǎn)BIAs的工程菌構(gòu)建工作，但是由于罌粟和花菱草等植物的生物信息數(shù)據(jù)有限以及從這些植物中克隆的功能酶轉(zhuǎn)化效率不高等因素影響了工程菌的產(chǎn)出效率。

本課題組在前期基于博落回中生物堿質(zhì)譜裂解規(guī)律建立了一套新的方法，鑒定了博落回中異喹啉類生物堿，并為博落回中生物堿的合成規(guī)律預(yù)測(cè)奠定了研究基礎(chǔ)[32]。在研究博落回的生物堿合成規(guī)律研究中，我們通過對(duì)博落回中不同組織部位的生物堿組織化學(xué)定位發(fā)現(xiàn)，根中生物堿出現(xiàn)在中柱鞘外的薄壁細(xì)胞和導(dǎo)管周圍；莖和葉柄中的生物堿主要出現(xiàn)在維管束周圍，偶爾也出現(xiàn)在莖的髓細(xì)胞中。總體上，莖中的生物堿積累量少于根。利用激光顯微切割，結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)技術(shù)測(cè)定了博落回根中6種生物堿(血根堿、原阿片堿、別隱品堿、白屈菜紅堿、二氫白屈菜紅堿和二氫血根堿)，發(fā)現(xiàn)其主要分布在木栓層和木質(zhì)部維管束，并推測(cè)博落回中的生物堿合成部位是根部[33-34]。2012年通過對(duì)博落回和小果博落回轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序[25]，通過10個(gè)在不同時(shí)間、不同組織器官和不同種樣本的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝數(shù)據(jù)對(duì)博落回屬植物的生物堿生源合成的可能機(jī)理進(jìn)行探索。博落回轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝和聚類之后，兩個(gè)種分別得到了69 367和78 255條unigenes。序列分析說明，大約2/3的unigenes與公共數(shù)據(jù)庫中的序列是相似的。因此，在分析中對(duì)于控制生物堿代謝通路中酶的關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)行了多層次比較和分析。同時(shí)，還通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)注釋找到了血根堿合成通路中所有功能基因的同源基因，并對(duì)參與血根堿合成的重要功能基因TYDC、STOX和去甲烏藥堿合成酶基因NCS等進(jìn)行了生物信息預(yù)測(cè)與克隆[35-37]。為了進(jìn)一步解析博落回血根堿與白屈菜堿合成規(guī)律和相關(guān)基因的克隆，本團(tuán)隊(duì)在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基礎(chǔ)上對(duì)博落回進(jìn)行了全基因組測(cè)序(de novo)、組裝及注釋，并結(jié)合同位素示蹤和轉(zhuǎn)錄組代謝組進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析，克隆了參與血根堿合成的14個(gè)基因，并進(jìn)行了酵母異源表達(dá)驗(yàn)證，目前正在進(jìn)行后期的個(gè)性化生物信息分析和文章撰寫，并將于2017年公布基因組數(shù)據(jù)。目前博落回作為罌粟科首個(gè)完成全基因組測(cè)序的物種，其生物信息數(shù)據(jù)可以對(duì)參與BIAs合成的功能基因進(jìn)行更細(xì)致的研究，也有望找到轉(zhuǎn)化效率更高且更有利于構(gòu)建工程菌的功能基因。

5 展望

隨著博落回植物全基因組和轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的公布，以及功能基因的不斷深入研究，以及相關(guān)功能基因的不斷深入研究，綜合利用微生物系統(tǒng)的快速繁殖、培養(yǎng)簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，將基因工程技術(shù)和微生物系統(tǒng)有機(jī)結(jié)合起來，把植物中合成BIAs的功能基因重組到酵母中生產(chǎn)目的BIAs，在未來一定可以為BIAs的生產(chǎn)提供新的藥源途徑。

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OverviewsinBiosynthesisofMacleayacordataSecondaryMetabolitesandMetabolicEngineering

LIU Jinfeng1，HUANG Peng1，TANG Zhaoshan2，ZENG Jianguo1*

(1.NationalandLocalUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalMedicineResourcesandInitiative，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；2.MicolltaBioresourceInc，Changsha410005，China)

Plant growth produces a wide variety of secondary metabolites，many of which have very important medicinal value.However，the content of secondary metabolites with significant medicinal value are low in plants，while the use of microbial metabolic engineering technology can provide a new source of secondary metabolites pathway.In this paper，we reviewed the biosynthesis of plant secondary metabolites，especially the benzylisoquinoline alkaloids ofMacleayaspp.，as well as the research progress of heterologous expression and production of benzylisoquinoline alkaloids in yeast using microbial metabolic engineering technology in China and abroad.At the same time，a prospect of the comprehensive utilization ofMacleayaspp.resources in the further future is discussed.

Benzylisoquinoline alkaloid；Macleayacordata(Willd.) R.Br.；biosynthesis；microbial metabolic engineering

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31200615)；湖南省科技重點(diǎn)計(jì)劃(2016SK3002)

*

曾建國(guó)，教授，研究方向：中藥資源與綜合利用研究；Tel：(0731)84673824，E-mail：zengjianguo@hunau.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.029

2017-02-20)