徐敏，宋錫帥，黃鵬，唐其，唐昭山，劉薇，3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心，湖南 長沙 410128)

·中藥農(nóng)業(yè)·

不同產(chǎn)地博落回離體培養(yǎng)與植株再生研究△

徐敏1，宋錫帥1，黃鵬1，唐其1，唐昭山2，劉薇1，3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心，湖南 長沙 410128)

目的探索不同產(chǎn)地的博落回離體培養(yǎng)效果差異，為篩選最適博落回植株再生材料提供研究基礎(chǔ)。方法采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對博落回葉片組織進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)及胚狀體分化，并對結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果安徽祁門、湖南炎陵和湖南高坊產(chǎn)地分別在不同培養(yǎng)階段與其他產(chǎn)地比誘導(dǎo)率和分化率最高。結(jié)論湖南高坊和安徽祁門的愈傷組織和胚狀體的誘導(dǎo)及分化能力優(yōu)于其他產(chǎn)地的樣本。因此，不同產(chǎn)地葉片離體培養(yǎng)效果差異顯著。

博落回，體細(xì)胞胚胎發(fā)生，離體培養(yǎng)，植株再生

血根堿(sanguinarine，SAN)屬于芐基異喹啉類生物堿(BIAs)，主要分布于罌粟科等植物中[1]。SAN具有調(diào)節(jié)畜禽類腸道菌群和抗炎促生長的作用，已作為飼用抗生素的替代品在歐洲等地區(qū)廣泛銷售[2]。目前血根堿只能從植物中提取，主要來源于博落回Macleayacordata(Willd.) R.Br.。該植物屬于罌粟科博落回屬植物，主要分布于中國、東亞、北美洲和歐洲[3]。隨著2006年歐盟全面禁止在飼料中添加抗生素使得市場對血根堿的需求逐年增長，而博落回作為血根堿的主要來源植物因野生資源連年大規(guī)模的人工采集后嚴(yán)重影響到了野生資源可采收量。因此，我們找到一種新的血根堿來源的資源獲取途徑是一個值得關(guān)注的技術(shù)。

植物組織培養(yǎng)是以細(xì)胞的全能性以及植物的再生作用為理論基礎(chǔ)建立的一種離體培養(yǎng)技術(shù)。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生是植物組織或細(xì)胞在離體條件下，通過培養(yǎng)條件誘導(dǎo)不斷產(chǎn)生非合子胚，并萌發(fā)成完整植物體的形態(tài)發(fā)生過[4]。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)已經(jīng)被用于多種藥用植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)，如西洋參、刺五加、半夏、鐵皮石斛等[5-7]。通過該方法能夠獲得遺傳相對穩(wěn)定的再生植株并且能夠為遺傳轉(zhuǎn)化和人工種子制作提供理想的實驗體系。

本實驗室前期通過對8個不同產(chǎn)地的博落回花藥進(jìn)行組織培養(yǎng)并對誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體植株的因素進(jìn)行研究，建立了穩(wěn)定高效的博落回花藥離體培養(yǎng)以及植株再生體系[8]。同時，我們在對博落回全基因組測序植株進(jìn)行離體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地來源的博落回葉片的愈傷誘導(dǎo)率具有明顯差異，而這一現(xiàn)象在其他植物中也有報道[9]。為了深入研究該現(xiàn)象，我們以8個不同產(chǎn)地的博落回葉片作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，并對其葉片誘導(dǎo)成愈傷組織、愈傷組織分化成胚狀體以及胚狀體分化成苗的現(xiàn)象進(jìn)行分析，為完善博落回體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及培養(yǎng)基配方

供試材料為不同產(chǎn)地的博落回葉片及對應(yīng)編號見表1，均采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家中藥材生產(chǎn)(湖南)技術(shù)中心的博落回種質(zhì)資源圃。由來自8個不同產(chǎn)地的野生博落回葉片經(jīng)組織培養(yǎng)后而產(chǎn)生的博落回再生植株。不同類型培養(yǎng)基配方見表2。

表1 博落回產(chǎn)地來源編號

表2 培養(yǎng)基配方

注：+代表已添加該試劑，-代表未添加該試劑。

1.2 外植體培養(yǎng)的過程

從健康博落回植株上采集葉片，放入自封袋并置于采樣盒內(nèi)，然后置于4 ℃的冰箱中冷藏3 d。取出用無菌水浸泡30 min，75%酒精浸泡10 s，再用無菌水沖洗3次，然后用0.1%的HgCl2(升汞)浸泡7 min，最后用無菌水沖洗5次。在超凈工作臺下將葉片剪成約0.5×0.5 cm2見方，然后將其接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每皿接種9個葉片，每個產(chǎn)地接種30皿，放在光照強(qiáng)度2000 lx、光照時間16 h·d-1、恒溫25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過40 d的誘導(dǎo)培養(yǎng)后，統(tǒng)計其愈傷誘導(dǎo)率，然后將形態(tài)健康的愈傷組織接種在增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖，每隔10 d繼代一次，繼代2次后將初步形成的愈傷組織分別接種在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基上，每皿接種6塊愈傷組織，每個產(chǎn)地接種30皿，放在光照強(qiáng)度2000 lx、光照時間16 h·d-1、恒溫25℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，接種在培養(yǎng)基上20 d后統(tǒng)計其出胚率及分化率，每個產(chǎn)地均重復(fù)三次。

1.3 實驗觀察及記錄

在相應(yīng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一定時間后，統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)率、胚狀體發(fā)生率、分化率。相應(yīng)的計算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法

對不同產(chǎn)地的愈傷誘導(dǎo)率、胚狀體發(fā)生率以及分化率數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件分別進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用3次重復(fù)實驗數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差并對結(jié)果用Duncan’s multiple range test(鄧肯多個范圍測試)方法進(jìn)行分析，同一列不同字母表示顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同產(chǎn)地葉片愈傷誘導(dǎo)率差異分析

博落回葉片經(jīng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)后產(chǎn)生愈傷組織(圖1)。表3為8個不同產(chǎn)地葉片的愈傷誘導(dǎo)率。結(jié)果顯示，在所有8個產(chǎn)地中，安徽祁門(MCQ)的愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了約44.9%；湖南高坊(MCG)其次，其愈傷誘導(dǎo)率約為39.4%；貴州凱里(MCL)的愈傷誘導(dǎo)率最低，只達(dá)到了約9.6%；另外，編號為福建光澤(MCZ)和貴州松桃(MCS)的葉片未能誘導(dǎo)出愈傷組織。

表3 不同產(chǎn)地來源的博落回葉片愈傷誘導(dǎo)率比較

注：采用3次重復(fù)實驗數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差并對結(jié)果用Duncan’s multiple range test 方法進(jìn)行分析，同一列不同字母表示顯著性差異(P<0.05，n=3)小寫字母代表是在0.05水平下比較，差異顯著。

圖1 葉片誘導(dǎo)成愈傷組織

2.2 不同產(chǎn)地來源對胚狀體誘導(dǎo)的影響

博落回愈傷組織經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)成胚狀體(圖2)。編號為浙江開化(MCK)、湖南高坊(MCG)、貴州凱里(MCL)、安徽祁門(MCQ)、湖南炎陵(MCY)、重慶秀山(MCX)的愈傷組織經(jīng)過一段時間培養(yǎng)均有胚狀體產(chǎn)生(表4)。其中胚狀體發(fā)生率最高的是湖南炎陵(MCY)，達(dá)到了約39.4%，重慶秀山(MCX)的胚狀體發(fā)生率最低，僅約為15.4%。

表4 不同產(chǎn)地來源的博落回胚狀體發(fā)生率比較

注：采用3次重復(fù)實驗數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差并對結(jié)果用Duncan’s multiple range test 方法進(jìn)行分析，同一列不同字母表示顯著性差異(P<0.05，n=3)小寫字母代表是在0.05水平下比較，差異顯著。

圖2 愈傷組織培養(yǎng)成胚狀體

2.3不同產(chǎn)地來源愈傷組織分化成不定芽的影響

博落回愈傷組織分化成不定芽(圖3)。6份供試材料中所形成的愈傷組織經(jīng)過分化培養(yǎng)基的培育，均發(fā)現(xiàn)了不同程度的不定芽產(chǎn)生，但是總體而言其分化成不定芽的幾率都小于通過胚狀體途徑進(jìn)行分化。通過表5可以知道，不同產(chǎn)地來源的博落回的愈傷組織分化成苗的能力是不相同的。其中分化率最高的是湖南高坊(MCG)，約為21.5%，分化率最低為重慶秀山(MCX)，僅約為3.6%。

表5 不同產(chǎn)地來源的博落回愈傷組織分化率比較

注：采用3次重復(fù)實驗數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差并對結(jié)果用Duncan’s multiple range test 方法進(jìn)行分析，同一列不同字母表示顯著性差異(P<0.05，n=3)小寫字母代表是在0.05水平下比較，差異顯著。

圖3 為愈傷組織分化成不定芽

2.4 不同產(chǎn)地來源對胚狀體分化成不定芽的影響

博落回胚狀體分化成不定芽(圖4)。通過表6可知，通過胚狀體發(fā)生的途徑得到不定芽的幾率都比較高，即便是分化率最低的貴州凱里(MCL)其分化率都達(dá)到了約54.4%，湖南高坊(MCG)的胚狀體的分化率甚至高達(dá)約91.4%，其他產(chǎn)地來源的博落回組培產(chǎn)生的胚狀體的分化率基本上都達(dá)到了50%以上。

表6 不同產(chǎn)地來源的博落回胚狀體分化率比較

注：采用3次重復(fù)實驗數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差并對結(jié)果用Duncan’s multiple range test 方法進(jìn)行分析，同一列不同字母表示顯著性差異(P<0.05，n=3)小寫字母代表是在0.05水平下比較，差異顯著。

圖4 為胚狀體分化成不定芽

3 討論

博落回具有較好的藥用價值和廣闊的市場前景，利用植物組織培養(yǎng)等技術(shù)對博落回資源的可持續(xù)開發(fā)及研究具有重要的意義。本課題組在前期研究中已實現(xiàn)博落回植株再生、快繁以及花藥離體培養(yǎng)并初步建立了博落回遺傳轉(zhuǎn)化體系[8，10]，為下一步的博落回單倍體育種及分子育種提供了前期基礎(chǔ)。本研究在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步對不同產(chǎn)地的博落回葉片離體培養(yǎng)效果差異進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地葉片在不同階段的離體培養(yǎng)效果差異顯著。其中MCQ產(chǎn)地在第一階段(葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷)中誘導(dǎo)率最高；MCY在第二階段(愈傷到胚狀體階段的胚狀體)中胚狀體發(fā)生率最高；而MCG在另外兩個階段(愈傷組織分化成不定芽和胚狀體分化成不定芽階段)中分化率最高。這種差異現(xiàn)象的發(fā)生可能是由于不同產(chǎn)地的博落回基因型不同導(dǎo)致的。在其他物種中，研究人員發(fā)現(xiàn)[11-14]在不同基因型的草莓離體葉片中不定芽誘導(dǎo)再生率差異顯著。除了草莓以外，不同基因型對于辣椒的花藥離體培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率具有決定性的影響[15]。雖然本實驗對不同產(chǎn)地博落回葉片的離體培養(yǎng)效果進(jìn)行了初步探索但是并未關(guān)注每個階段的增殖率，所以下一步將對不同產(chǎn)地的博落回組培的愈傷組織及胚狀體的增殖率進(jìn)行研究。同時，本實驗僅對博落回葉片組織進(jìn)行離體培養(yǎng)，而未對莖段，葉柄，根等部位進(jìn)行離體培養(yǎng)，因此下一步將對這些部位的離體培養(yǎng)效果進(jìn)行探討。另外，對于造成不同產(chǎn)地博落回離體培養(yǎng)效果差異的原因及其機(jī)制將在下一步的實驗中進(jìn)行探討。

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StudyonVitroCultureandPlantRegenerationofMacleayacordata

XU Min1，SONG Xishuai1，HUANG Peng1，TANG Qi1，TANG Zhaoshan2，LIU Wei1，3*

(1.NationalandLocalUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalMedicineResourcesandInitiative，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；2.MicolltaBioresourceInc，Changsha410128，China；3.CenterOfAnalyticServiceHunanAgricultureUniversity，Changsha410128，China)

Objective：To explore the differenle of different regions vitro culture ofMacleayacordataand provide data for screening the optimal plant regeneration materials.MethodsThe leaves ofM.cordatawere isolated to callus induction and differentiation of leaves into embryos by using plant cell culture technology and the results differentiation was analyzed.ResultsThe samples from Qimen of Anhui，Yanling of Hunan and Gaofang of Hunan had the highest induction and differentiation rate compared with others in different periods.ConclusionThe induction and the differentiation ability of callus and embryos bodies from Gaofang of Hunan and Qimen of Anhui were superior to those from other regions.Therefore，the vitro culture effect of leaves from different regions was significant difference.

Macleayacordata，somatic embryo genesis，vitro culture，plant regeneration

湖南省科技重點計劃(2016SK3002)；湖南省教育廳科學(xué)研究項目(16C0769)；博落回血根堿/白屈菜紅堿生物合成關(guān)鍵酶-P6H的功能研究(2016JJ4040)

*

劉薇，實驗師，研究方向：化學(xué)成分分析與檢測；Tel：(0731)84673824 E-mail：37892293@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.014

2017-02-20)