趙兵潔+趙金寶+齊小花+鄒明強+陳艷+張帆+楊屹

摘 要 采用微波輔助合成的熒光稀土二氧化硅納米顆粒（BHHCTEu3+@SiO2）為標記物，建立了快速定量檢測卡那霉素（Kana）殘留的熒光免疫層析方法。實驗結(jié)果表明，微波輔助合成的BHHCTEu3+@SiO2納米顆粒呈球形，粒徑約36 nm，具有良好的熒光發(fā)射性能，最大吸收波長和最大發(fā)射波長分別為343和615 nm。將BHHCTEu3+@SiO2與卡那霉素抗體（Kanaab）通過醛基化葡聚糖交聯(lián)，合成了熒光標記抗體Eu3+Kanaab，結(jié)合定量側(cè)向?qū)游鲎x數(shù)儀，建立了牛奶中Kana殘留的快速定量檢測方法，對Kana的檢出限（IC10）為0.85 ng/mL，半數(shù)抑制濃度（IC50）為12.76 ng/mL，檢測范圍（IC20-IC80）為3.0～76.0 ng/mL，牛奶中的Kana的加標回收率范圍為93.7%～97.4%，RSD為3.1%～4.6%，與Kana類似物的交叉反應(yīng)均<1%。牛奶中Kana殘留的測定結(jié)果與ELISA方法相關(guān)性良好。

1 引 言

卡那霉素（Kanamycin， Kana）屬于氨基糖苷類抗生素，對大腸桿菌等革蘭氏陰性菌有很強的抑制和殺菌作用[1，2]，由于價格低廉且抗菌譜廣，已廣泛用于動物養(yǎng)殖中。然而，卡那霉素在動物源性食品中的過量殘留會對人體產(chǎn)生嚴重的副作用，歐盟和日本等國家和地區(qū)規(guī)定牛奶中卡那霉素最大殘留限量為150 μg/L[3]。

目前，用于Kana檢測的方法包括酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）[4]、高效液相色譜法[5]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[6]和微生物檢測法[7]等。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測靈敏性高，但檢測費用較高。微生物檢測法測定時間長，且結(jié)果誤差較大。ELISA利用抗原抗體特異性結(jié)合，具有高選擇性，但不適合現(xiàn)場檢測。因此，建立成本低、靈敏度高、選擇性高且可用于食品安全現(xiàn)場快速檢測的卡那霉素檢測技術(shù)十分必要。目前，常用的現(xiàn)場快速檢測方法為膠體金免疫試紙條法[8～10]，該方法簡便快捷、費用低，但在定量檢測和靈敏度方面存在不足。近年來，以稀土熒光二氧化硅納米顆粒等熒光材料作為標記探針的熒光免疫層析技術(shù)（Lateral flow immunoassay， LFIA）[11～13]得到廣泛發(fā)展，該方法能有效消除檢測背景強度，提高檢測靈敏度，可實現(xiàn)定量及多元檢測。Zhang等[11]以熒光稀土二氧化硅納米顆粒作為熒光標記探針，建立了熒光免疫層析分析方法，用于玉米細菌性枯萎病菌的檢測分析，檢出限比膠體金試紙條低100倍。Bian等[12]建立了一種可檢測抗生素殘留的熒光免疫層析方法，并與ELISA和UPLCMS/MS方法進行對比，結(jié)果表明，該方法檢測結(jié)果可靠。稀土熒光二氧化硅納米顆粒可采用摻雜[14～16]和共價交聯(lián)[17，18]兩種方法制備。摻雜型納米顆粒是將稀土配合物與SiO2物理摻雜制備而成，在應(yīng)用過程中存在熒光泄露的問題。通過共價交聯(lián)將稀土配合物化學(xué)鍵合在SiO2表面形成的共價型納米顆粒避免了熒光泄漏問題，但其制備時間較長。微波輔助合成技術(shù)具有反應(yīng)效率高、反應(yīng)時間短的優(yōu)點，目前已用于多種納米材料的制備[19]。

本研究基于熒光稀土二氧化硅納米顆粒建立了快速定量檢測卡那霉素殘留的熒光免疫層析方法。以4，4′二（1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″七氟4″，6″己二酮6″基）氯磺酰鄰三聯(lián)苯（BHHCT）為配體，利用微波輔助合成法制備了BHHCTEu3+@SiO2熒光稀土二氧化硅納米顆粒，以BHHCTEu3+@SiO2作為熒光標記探針，以醛基葡聚糖作為交聯(lián)劑，對卡那霉素抗體進行熒光標記，用于牛奶中卡那霉素殘留的檢測。利用微波輔助合成技術(shù)不但縮短了熒光納米顆粒的制備時間，而且減少了試劑消耗。實驗結(jié)果表明，制備的熒光免疫試紙條可以滿足牛奶中卡那霉素殘留現(xiàn)場快速檢測的要求。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

XH100A型微波催化合成/萃取儀（北京祥鵠科技有限公司）； F4500熒光分光光度計（日本日立公司）； XYZ3050點膜儀、CM4000切條機（美國Bio Dot公司）； IS4000 PRO高靈敏多模式分子成像系統(tǒng)（美國柯達公司）； ESE Quant定量側(cè)向?qū)游鲎x數(shù)儀（北京天根生化公司）； Sunrise酶標分析儀（奧地利Tecan公司）。

Triton X100、Tween 20、3氨丙基三甲氧基硅氧烷（APTS）、EuCl3、硼氫化鈉、4，4′二（1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″七氟4″，6″己二酮6″基）氯磺酰鄰三聯(lián)苯（BHHCT）和N（3二甲氨基丙基）N'乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）均購自SigmaAldrich公司； 卡那霉素單克隆抗體（Kanaab）由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院提供； 牛血清白蛋白（BSA）和Na2Fe（CN）5NO（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）； 硝酸纖維素膜（NC膜）（M135，美國Millipore公司； PV90，美國PALL Vivid公司； AE99，英國Whatman公司）； 葡聚糖Dextran（Mw 500000， 美國AcrosOrganics公司）； 羊抗鼠二抗IgG（中國武漢博士德生物工程有限公司）； 卡那霉素（百靈威公司）； 丙酮（美國J.T.Baker公司）； 三羥甲基氨基甲烷（Tris， 美國NOVON公司）； 其它試劑均為分析純； 實驗用水為超純水。

2.2 BHHCTEu3+@SiO2的制備

首先用微乳液法合成SiO2納米微乳液[20]，再加入3 μL APTS，采用微波催化合成/萃取儀加熱，微波功率700 W，溫度70℃，反應(yīng)時間20 min，得到表面氨基化的SiO2納米顆粒。將BHHCTEu3+稀土熒光配合物（由2.5 mg BHHCT與4.84 μL 0.64 mol/L EuCl3避光反應(yīng)3 h制得）加入到上述微乳體系中，采用微波催化合成/萃取儀加熱，微波功率700 W，溫度59℃，反應(yīng)時間20 min（圖1A）。利用水浴加熱（NonMicrowave）方法取代微波輔助合成技術(shù)，合成BHHCTEu3+@SiO2，考察熒光強度，計算量子產(chǎn)率。endprint

2.3 包被抗原KanaBSA的制備

將3 mL 10 mg/mL BSA與1.5 mL 90 mg/mL Kana 混合，以1 d/3 s速度滴入3 mL 300 mg/mL EDC，攪拌反應(yīng)2 h，4℃避光反應(yīng)過夜，用10 mmol/L PBS （pH 7.4）溶液透析。

2.4 熒光標記卡那霉素抗體（Eu3+Kanaab）的制備

以醛基化葡聚糖作為交聯(lián)試劑，以BHHCTEu3+@SiO2作為熒光標記探針，對Kanaab進行熒光標記[11] （圖1B）。將葡聚糖用30 mol/L高碘酸鈉氧化為醛基化葡聚糖，與懸浮于25 mmol/L碳酸鹽緩沖液（CBS， pH 9.6）中的4 mg BHHCTEu3+@SiO2熒光納米顆粒避光反應(yīng)7 h，醛基化葡聚糖中的醛基可與BHHCTEu3+@SiO2表面氨基生成希夫堿。用25 mmol/L CBS （pH 9.6）洗滌3次，重懸于200 μL CBS中。再加入200 μL Kanaab，4℃反應(yīng)過夜，隨后加入NaBH4，終濃度為5 mmol/L，4℃反應(yīng)4 h，再加入50 mmol/L TrisHCl（含 2% BSA，4% 蔗糖， pH 7.8）封閉液封閉12h。最后用50 mmol/L TrisHCl （pH 7.8）洗滌Eu3+Kanaab顆粒3次，重懸于100 μL 50 mmol/L TrisHCl（0.9% NaCl，0.2% BSA，0.05% Tween 20，0.1% NaN3， pH 7.8）。

2.5 免疫層析試紙條檢測方法

如圖1C所示，試紙條包括襯板、NC膜、吸水紙、樣品墊和抗體結(jié)合墊五部分。在NC膜上噴涂羊抗鼠二抗作為質(zhì)控線（C線），噴涂KanaBSA作為檢測線（T線），用10 mmol/L TrisHCl緩沖液（pH 7.8）將Eu3+Kanaab稀釋至一定濃度，將抗體結(jié)合墊浸入其中，取出烘干，組裝試紙條。在試紙條的樣品墊上滴加150 μL待測樣品，在室溫下避光反應(yīng)30 min后，通過熒光讀數(shù)儀測定T線和C線上熒光響應(yīng)值（圖2），以實現(xiàn)定量檢測。陽性結(jié)果呈現(xiàn)兩條亮線（C線和T線），而陰性結(jié)果只見到C線處一條亮線。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 卡那霉素?zé)晒饷庖邔游龇椒ǎ↙FIA） 利用試紙條對不同濃度的Kana（0～400 ng/mL）標準溶液進行檢測，用熒光讀數(shù)儀測定T線熒光信號值（見圖2）。 空白溶液的熒光信號強度值為A0，不同濃度溶液的熒光信號強度值為A，以A/A0為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.6.2 卡那霉素ELISA分析方法[21] 用酶標儀測定不同濃度的Kana（0～100 ng/mL）標準溶液的紫外吸收信號值，以空白溶液測得的信號強度值為A0值，不同濃度標準品的信號強度為A，以A/A0為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.7 樣品分析

將某品牌純牛奶樣品離心脫脂，然后用Na2Fe（CN）5NOZnSO4沉淀蛋白[22]，離心取上清液，用200 mmol/L pH 8.0 TrisHCl展開劑稀釋10倍，用免疫層析試紙條進行測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 透射電鏡表征

透射電鏡（TEM）圖如圖3所示，合成的SiO2和BHHCTEu3+@SiO2粒子呈均勻球形。SiO2粒子表面光滑，粒徑約30 nm（圖3A）； BHHCTEu3+@SiO2（圖3B）表面有成簇的黑色凸起[23，24]，表明BHHCTEu3+已共價結(jié)合在SiO2表面，同時該納米顆粒保持良好的球形形貌，粒徑分布均勻，平均粒徑約36 nm。

3.2 BHHCTEu3+@SiO2的熒光性質(zhì)

在其它合成條件相同的情況下，對比了微波輔助合成法和水浴加熱法合成的BHHCTEu3+@SiO2的熒光性能。由圖4可見，兩種方法合成的熒光納米顆粒的發(fā)射光譜圖并未出現(xiàn)顯著改變。傳統(tǒng)水浴加熱法合成的BHHCTEu3+@SiO2納米顆粒發(fā)射光譜強度為1305，微波輔助合成的納米顆粒發(fā)射光譜強度為1775，后者熒光強度提高了36%。經(jīng)計算[18]， 微波輔助合成的BHHCTEu3+@SiO2的量子產(chǎn)率為64.94%，明顯高于水浴加熱法（47.75%）。與文獻[24]報道的共價型稀土熒光二氧化硅對比，雖然本研究利用微波輔助合成的稀土熒光二氧化硅納米顆粒的熒光強度略低，但仍能滿足作為生物標記物的要求。同時反應(yīng)時間從5 h/5 h縮短至20 min/20 min，且BHHCT與Eu3+用量明顯減少，所獲得的納米顆粒產(chǎn)品的量明顯增多（表1）。上述結(jié)果表明，微波輔助合成技術(shù)可以大大縮短BHHCTEu3+@SiO2熒光納米顆粒的合成時間，提高熒光信號強度。

3.3 Kana殘留檢測熒光試紙條的制備

3.3.1 NC膜的選擇 選擇3種型號（M135，PV90和AE99）硝酸纖維素膜（NC膜）進行了兩次平行實驗。結(jié)果表明，使用AE99的試紙條，在滿足條帶明顯的前提下，背景干擾較少。因此后續(xù)實驗采用AE99的硝酸纖維素膜。

3.3.2 層析展開劑的選擇 以 200 mmol/L TrisHCl（含0.2% BSA，0.9% NaCl，pH 8.0）為母液，加入不同種類的表面活性劑，考察了5種展開劑的層析效果。依據(jù)條線清晰、明亮、無拖尾、無暈染的原則，選擇200 mmol/L TrisHCl（含0.2% BSA，0.9% NaCl，pH 8.0）緩沖液中加入1% Tween20為展開劑。

3.3.3 Eu3+Kanaab濃度的選擇 將Eu3+Kanaab溶液倍比稀釋1∶1000，1∶1500，1∶2000，1∶4000，進行免疫層析分析。凝膠電泳成像圖（圖5A1）顯示，隨著稀釋比的增加，C線和T線亮度逐漸變淺，在熒光試紙條制作過程中，T線與C線熒光強度比接近1為最佳，如圖5A2所示，故選擇Eu3+Kanaab稀釋1500倍為最佳工作濃度。

3.3.4 檢測線KanaBSA噴涂濃度的選擇 將濃度分別為0.50、0.75、1.00和1.57 mg/mL的KanaBSA噴涂于NC膜上，進行檢測。凝膠電泳成像儀圖（圖5B1）顯示，隨著KanaBSA濃度的增加，C線亮度逐漸減弱，同時T線亮度逐漸增強。當(dāng)KanaBSA濃度為0.75 mg/mL時，C線和T線亮度適中，如圖5B2所示，故選擇KanaBSA濃度0.75 mg/mL為最佳工作濃度。

3.3.5 質(zhì)控線羊抗鼠二抗IgG噴涂濃度的選擇 將濃度分別為0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL的羊抗鼠二抗IgG噴涂于NC膜上，進行檢測。凝膠電泳成像圖（圖5C1））顯示，隨著IgG濃度的減少，C線亮度逐漸減弱，當(dāng)IgG濃度為1.0 mg/mL時，C線和T線亮度適中，如圖5C2所示，因此選擇1.0 mg/mL IgG 為最佳工作濃度。

3.4 熒光免疫試紙條檢測Kana殘留

3.4.1 特異性及方法學(xué)考察 分別采用試紙條檢測不同梯度濃度的卡那霉素、慶大霉素（Gent）、安普霉素（Apra）、妥布霉素（Tobr）和阿米卡霉素（Amik），用熒光讀數(shù)儀讀數(shù)，計算半數(shù)抑制濃度（IC50），抑制曲線如圖6所示，根據(jù)公式計算交叉反應(yīng)率（CR）：

CR（%）= （IC50（Kana）/IC50（其它））×100%（1）

實驗和計算結(jié)果表明，其它干擾物的交叉反應(yīng)率均小于1%，表明此試紙條特異性良好。

3.5 牛奶樣品分析

采用牛奶樣品加標回收實驗考察本方法準確度和精密度，由表2可見，Kana在牛奶樣品中的添加回收率為93.7%～97.4%，RSD為3.1%～4.6%，說明本研究建立的LFIA方法可用于實際牛奶樣品中Kana殘留的檢測，實用性良好。

4 結(jié) 論

采用微波輔助合成技術(shù)制備了共價型Eu3+BHHCT@SiO2熒光稀土二氧化硅納米顆粒，制備時間短，顆粒呈均勻球形，熒光強度高。以制備的Eu3+BHHCT@SiO2為熒光標記探針，以醛基葡聚糖為交聯(lián)劑，對Kanaab進行熒光標記，用于熒光免疫層析試紙條檢測分析。結(jié)果表明，本研究建立的LFIA方法可靠，且檢測時間短，操作簡便，可用于牛奶中卡那霉素殘留的現(xiàn)場快速檢測。endprint