劉琳琳+鄭夢琳+鄒秉杰+宋沁馨+周國華

]摘 要 通過檢測母體外周血中胎兒游離DNA（cffDNA）的SRY基因，確定胎兒性別，可評估胎兒性連鎖遺傳病的發(fā)病風險，降低病兒出生率。本研究建立了高靈敏、高特異、閉管檢測不易污染的實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應方法用于SRY基因的檢測。通過優(yōu)化反應體系中的檢測探針濃度、FEN1酶用量、Taq酶用量及預擴增退火溫度，確定了最佳的反應條件，即檢測探針濃度為250 nmol/L、FEN1酶用量為7.5 U、Taq酶用量為0.5 U、預擴增退火溫度為67℃。在最佳反應條件下， 實現對含量低至4‰ （4 copies/μL）的模擬樣本的檢測，并成功檢測兩例孕期分別為9周和10周的臨床實際樣本。結果表明， 所建立的方法可用于母體外周血cffDNA的SRY基因檢測，為臨床開展基于SRY基因的無創(chuàng)產前診斷提供了新方法。

1 引 言

我國是人口大國，約4%的新生兒受到一種或多種先天性疾病的影響，而在所有的先天性疾病中，大約35%為遺傳性疾病[1]。產前診斷可在胎兒出生前了解胎兒的發(fā)育狀態(tài)，及時進行干預治療。傳統(tǒng)的產期診斷方法有羊膜腔穿刺、絨毛活檢等，它們是目前臨床產前診斷的“金標準”，雖然可以給出大多數染色體疾病的明確結果，但伴隨著宮內感染和約0.2%～0.5%的胎兒流產風險[2， 3]。無創(chuàng)性產前診斷（Noninvasive prenatal diagnosis， NIPD）是指利用母體外周血中胎兒成分或是胎兒特異性標志物進行的遺傳學分析或診斷[4]，這些胎兒成分或特異性標志物包括胎兒有核紅細胞、胎兒游離DNA（Cellfree fetal DNA， cffDNA）等。1989年，Lo等[5]發(fā)現孕婦外周血中存在胎兒有核紅細胞，但Price等[6]估計母體外周血中胎兒有核紅細胞含量很低，富集獲取困難，并且在產后幾年內長期存在于母血中，使其臨床應用受到限制。1997年，Lo等[7]首次報道了母體外周血中存在cffDNA； 隨后，又通過實時熒光PCR方法測得孕婦血漿中cffDNA占血漿總DNA的3.4%～6.2%，含量遠高于孕婦外周血中胎兒細胞DNA[8]。接著，從血漿中提取cffDNA的有效性和穩(wěn)定性得到證實[9]。此外，cffDNA具有諸多適合產前診斷的特點，如半衰期短、清除快； 不受母體之前妊娠干擾[10]； 可進行實時動態(tài)監(jiān)測； 可從長度上與母體游離DNA進行區(qū)分。cffDNA作為理想的產前診斷胎兒成分，已成為NIPD領域的研究熱點。

SRY基因是位于Y染色體短臂上的男性性別決定基因，人的SRY基因只含有1個外顯子，沒有內含子，轉錄單位長度約1.1 kb，編碼一個含有204個氨基酸的蛋白質[11]。以SRY基因為檢測靶標，通過對cffDNA的SRY基因檢測確定胎兒性別，可評估如甲型血友病[12]、杜式肌營養(yǎng)不良等性連鎖遺傳病的發(fā)病風險，降低病兒的出生率[13]。

常見的SRY基因檢測方法有普通PCR[7]，靈敏度低、容易污染； 巢式PCR[14]，雖然靈敏度和特異性有所提高，但仍需開管電泳分析； 最普遍使用的方法是實時熒光PCR[8， 15]，靈敏度高、不易污染但需較貴的Taqman探針。為此，本研究建立一種基于實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應的SRY基因檢測方法，將基于PCR的模板擴增與基于核酸侵入反應的信號放大技術相結合，具有高靈敏、高特異、低成本、閉管檢測不易污染等優(yōu)點。最終實現對含量低至4‰ （4 copies/μL）的模擬樣本的檢測，并成功檢測兩例孕期分別為9周和10周的臨床實際樣本。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

RotorGene Q實時熒光定量PCR儀（德國Qiagen公司）； Allegra X30冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）； Wizard Genomic DNA Purification Kit（美國Promega公司）； QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（德國Qiagen公司）； FEN1核酸內切酶（實驗室自表達[16，17]）； Taq 酶（美國Promega公司）； 3（N嗎啉基）丙磺酸（MOPS， 美國Amresco公司）； MgCl2（美國NEB公司）； dNTP（上海賽百盛公司）； 其它試劑均為分析純； 實驗用水均為滅菌雙蒸水。

2.2 樣本收集與處理

孕婦EDTA抗凝血樣本由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院提供，取4 mL新鮮外周血以7400 r/min離心10 min， 小心吸取上層血漿置于干凈離心管中， 13000 r/min再離心10 min得到血漿樣本，按照QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit的操作說明提取血漿游離DNA，置于 30℃保存待用。

2.3 實驗方法

2.3.1 實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應與體系優(yōu)化 （1）反應初始體系 1×反應緩沖液（10 mmol/L MOPS、7.5 mmol/L MgCl2，pH 7.5），dNTPs各250 μmol/L，上下游引物各500 nmol/L，侵入探針50 nmol/L， 檢測探針250 nmol/L，熒光發(fā)夾探針250 nmol/L，Taq酶0.5 U，FEN1酶7.5 U，基因組DNA 1 μL， 用H2O補充到20 μL。（2）反應程序 預變性（95℃，3 min）； 10個循環(huán)預擴增（95℃，20 s； 67℃，30 s； 70℃，30 s）； 35個循環(huán)擴增（95℃，20 s； 63℃，60 s，讀取熒光信號； 70℃，30 s）。在進行反應體系優(yōu)化時，分別改變Taq酶用量（0.5 U、1 U、2 U、4 U）、FEN1酶用量（1.5 U、3 U、7.5 U）、檢測探針濃度（250、500、1000和2000 nmol/L）及預擴增退火溫度（67℃、70℃、72℃），比較各條件下SRY基因擴增的Ct值及熒光信號曲線強度和斜率，選擇最優(yōu)的反應條件。endprint

2.3.2 方法學的靈敏度、特異性和重復性考察 在優(yōu)化后的反應體系中加入10倍梯度稀釋的男性基因組DNA模板，終濃度為105～100拷貝/20 μL反應液，考察方法的靈敏度； 在優(yōu)化后的反應體系中加入未孕女性基因組DNA，考察方法的特異性； 在優(yōu)化后的反應體系中加入高中低3個濃度的男性基因組DNA，終濃度分別為105、103和101拷貝/20 μL反應液，每個濃度重復檢測3次考察方法的重復性。

2.3.3 樣本分析 將男性基因組DNA和未孕女性基因組DNA按比例混合，得到不同SRY基因含量的模擬樣本。此外，還收集了2例孕期分別為9周和10周的母體外周血樣本。每次實驗包含待測樣本DNA、陽性對照（男性基因組DNA）、陰性對照（未孕女性基因組DNA）、空白對照。

3 結果與討論

3.1 實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應方法原理

實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應的原理如圖1所示，根據待測靶標序列設計上下游引物、侵入探針、檢測探針和熒光發(fā)卡探針。反應包括兩個階段，第一個階段是只進行PCR反應的模板預擴增，第二階段發(fā)生PCR偶聯(lián)核酸侵入反應，在63℃的PCR擴增循環(huán)退火階段同時發(fā)生核酸侵入反應，此時侵入探針及檢測探針與靶標雜交形成三堿基重疊結構，FEN1酶特異性識別這種結構并切割檢測探針，產生Flap片段，Flap片段可與一條修飾了熒光基團和淬滅基團的熒光發(fā)夾探針退火，再次形成三堿基重疊結構而被FEN1酶識別并將熒光基團切割下來，熒光發(fā)卡探針的熒光基團與淬滅基團分離產生熒光信號。因此，在每個擴增循環(huán)中采集熒光信號，即可得到實時熒光擴增曲線。

在設計探針時，使檢測探針3′端特異序列的Tm值和Flap片段的Tm均接近63℃，則在63℃退火階段，檢測探針與模板的退火結合以及Flap片段與熒光發(fā)卡探針的退火結合處于一種雜交和解離的動態(tài)過程，且完整的檢測探針與模板，熒光發(fā)卡探針與Flap片段形成下一輪的切割，不斷循環(huán)的核酸侵入反應使信號放大106～107倍[18，19]。

3.2 實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應條件的優(yōu)化

為使SRY基因擴增得到Ct值最小及熒光信號曲線強度和斜率最佳，分別對影響反應的主要因素：檢測探針濃度、FEN1酶用量、Taq酶用量及預擴增退火溫度進行優(yōu)化，結果如圖2所示。隨著Taq酶用量的增加，熒光信號曲線的Ct值增大，可能是Taq酶用量的增加競爭性地抑制了核酸侵入反應，因此Taq酶用量確定為0.5 U（圖2A）。隨著FEN1酶用量的減少，熒光信號曲線的Ct值增大，當FEN1酶用量為1.5 U時，熒光信號曲線斜率已經開始下降，為了縮短反應時間，FEN1酶最佳用量確定為7.5 U（圖2B）。隨著檢測探針濃度的增加， 熒光信號曲線的Ct值會減小，但是減小的程度不大，且熒光信號曲線的強度和斜率都沒有減弱的趨勢，從降低成本方面考慮，檢測探針濃度確定為250 nmol/L（圖2C）。隨著預擴增退火溫度的增加，熒光信號曲線的Ct值增加，因而預擴增退火溫度確定為67℃（圖2D）。最終得到反應的最佳條件為： 250 nmol/L檢測探針、 7.5 U FEN1酶、0.5 U Taq酶、67℃預擴增退火。

（A） 不同Taq 酶用量的檢測結果：1、2、3、4分別是Taq酶為0.5 U、1 U、2 U、4 U時的檢測結果，5、6分別為陰性對照和空白對照； （B） 不同FEN1酶用量的檢測結果：1、2、3分別是FEN1酶為7.5 U、3 U、1.5 U時的檢測結果，4、5分別為陰性對照和空白對照； （C） 不同檢測探針濃度的檢測結果：1、2、3、4分別是檢測探針濃度為2000、1000、500和250 nmol/L時的檢測結果，5、6分別為陰性對照和空白對照； （D） 不同預擴增退火溫度的檢測結果：1、2、3分別是預擴增退火溫度為67、70和72℃時的檢測結果，4為空白對照。

Fig.2 Optimized results of reaction conditions for SRY gene detection

（A） Detection results with different amounts of Taq polymerase： 1， 2， 3 and 4 are detection results with 0.5 U， 1 U， 2 U and 4 U Taq polymerase， 5 and 6 are negative control and blank control； （B） Detection results with different amounts of FEN1 enzyme： 1， 2 and 3 are detection results with 7.5 U， 3 U and 1.5 U FEN1 enzyme， 4 and 5 are negative control and blank control； （C） Detection results with different concentrations of detection probe： 1， 2， 3 and 4 are detection results with 2000， 1000， 500 and 250 nmol/L detection probe； 5 and 6 were negative control and blank control； （D） Detection results with different annealing temperatures in preamplification： 1， 2 and 3 are detection results with annealing temperature of 67℃， 70℃ and 72℃， 4 is blank control.endprint

3.3 實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應檢測的靈敏度、特異性和重復性

得到最佳反應體系后，對SRY基因的擴增性能進行考察，如圖3所示。在檢測體系中分別加入終濃度為105～100拷貝的男性基因組DNA考察檢測的靈敏度，同時在檢測體系中加入了未孕女性基因組DNA考察檢測特異性。結果表明，本方法能檢測出10拷貝的男性基因組DNA（圖3A），未孕女性基因組DNA無熒光信號，表明該方法特異性良好（圖3B）。此外，在檢測體系中加入高中低3個濃度的男性基因組DNA（105、103、101拷貝/20 μL反應液），每個濃度重復檢測3次考察方法的重復性（圖3C），在檢測高濃度樣品時，3條熒光信號曲線的平均Ct=5.9，RSD=1.36%； 中濃度時，平均Ct=11.98，RSD=1.17%； 低濃度時，平均Ct=19.32，RSD=4.7%，說明本方法在檢測高濃度和中濃度時重復性良好，在檢測下限時重復性有所下降，但也能滿足檢測要求。

3.4 樣本檢測結果

cffDNA占母體外周血中總游離DNA的10%～20%[8]。為了模擬真實樣本，采用1000 copies/μL未孕女性基因組DNA 4倍梯度稀釋1000 copies/μL的男性基因DNA，分別得到男性基因組DNA濃度為1000、250、62.5、15.6 和4 copies/μL的模擬樣本，男性基因組DNA所占比例分別為100%、25%、6.2%、1.6%、4‰（圖4A）。對4‰男性基因組DNA進行3次重復檢測，有兩次出現陽性信號，表明本方法能檢測到67%的含量為4‰（4 copies/μL）的模擬樣本。采用本方法檢測了兩例孕期分別為9周和10周的母體血漿樣本，檢測的兩名胎兒性別分別為一男一女（圖4B），與后續(xù)隨訪結果一致。

（A） 模擬樣本檢測結果：17為20 μL反應液中男性基因組DNA為10004拷貝的檢測結果，8、9為陰性對照和空白對照； （B） 臨床實際樣本檢測結果：3、4分別為陰性對照和空白對照

Fig.4 Detection results of samples

（A） Detection results of simulated samples： 1 to 7 are detection results of 1000 to 4 copies male genomic DNA per 20 μL reaction liquid， 8 and 9 are negative control and blank control； （B） Detection results of clinical samples： 3 and 4 are negative control and blank control.

4 結 論

早在2003年，英國遺傳學檢測網絡就批準了通過檢測孕婦外周血中cffDNA的SRY基因進行無創(chuàng)性胎兒性別診斷，以用于性連鎖遺傳疾病的產前篩查[20]。常見的SRY基因檢測方法有普通PCR[7]，靈敏度低、容易污染； 巢式PCR[14]，雖然靈敏度和特異性都有所提高，但仍需開管電泳分析； 最普遍使用的方法是實時熒光PCR[8，15]，靈敏度高、不易污染但需較貴的Taqman探針。本研究建立的實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應方法具有以下優(yōu)點：（1）高靈敏。本方法將基于PCR的模板擴增與基于核酸侵入反應的信號放大技術相結合，非常適合于孕婦外周血中微量cffDNA的檢測； （2）高特異性。FEN1酶特異識別模板、侵入探針和檢測探針形成的三堿基重疊結構并產生切割，在沒有形成堿基重疊時，FEN1酶活性很弱； （3）通用性好。熒光發(fā)卡探針為通用探針，無需針對每個檢測位點專門設計； （4）無污染。檢測過程無需開蓋，減少了交叉污染的可能性； （5）操作簡便，檢測速度快。實驗操作只包含模板制備和體系配制，可在2 h內完成檢測； 本課題組之前利用實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應檢測單核苷酸多態(tài)性[21]，但是它為單堿基序列差異，檢測通常存在一定的背景信號，而本研究以僅存在于Y染色體上的SRY基因為檢測靶標，定性檢測其是否存在，幾乎沒有背景干擾。本方法可檢測含量低至4‰（4 copies/μL）的模擬樣本，并成功檢測兩例臨床實際樣本。文獻[22]報道在5周齡孕婦的血漿cffDNA中可檢測到SRY基因，而本研究樣本量有限，只檢測了兩例實際樣本，且孕期為9周和10周，下一步準備擴大樣本量，探索本方法可進行檢測的最小孕婦周齡。cffDNA片段長度為193～313 bp，遠小于母體游離DNA長度[23]，因此，可以嘗試將基于片段差異的cffDNA富集方法與高靈敏的檢測方法結合，進一步提高檢測準確性。此外，本方法可與微量血液、毛發(fā)等特殊樣本的提取方法結合，應用于法醫(yī)鑒定領域[24]。endprint