劉琳琳+鄭夢琳+鄒秉杰+宋沁馨+周國華

]摘 要 通過檢測母體外周血中胎兒游離DNA（cffDNA）的SRY基因，確定胎兒性別，可評估胎兒性連鎖遺傳病的發(fā)病風(fēng)險，降低病兒出生率。本研究建立了高靈敏、高特異、閉管檢測不易污染的實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)方法用于SRY基因的檢測。通過優(yōu)化反應(yīng)體系中的檢測探針濃度、FEN1酶用量、Taq酶用量及預(yù)擴(kuò)增退火溫度，確定了最佳的反應(yīng)條件，即檢測探針濃度為250 nmol/L、FEN1酶用量為7.5 U、Taq酶用量為0.5 U、預(yù)擴(kuò)增退火溫度為67℃。在最佳反應(yīng)條件下， 實現(xiàn)對含量低至4‰ （4 copies/μL）的模擬樣本的檢測，并成功檢測兩例孕期分別為9周和10周的臨床實際樣本。結(jié)果表明， 所建立的方法可用于母體外周血cffDNA的SRY基因檢測，為臨床開展基于SRY基因的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷提供了新方法。

1 引 言

我國是人口大國，約4%的新生兒受到一種或多種先天性疾病的影響，而在所有的先天性疾病中，大約35%為遺傳性疾病[1]。產(chǎn)前診斷可在胎兒出生前了解胎兒的發(fā)育狀態(tài)，及時進(jìn)行干預(yù)治療。傳統(tǒng)的產(chǎn)期診斷方法有羊膜腔穿刺、絨毛活檢等，它們是目前臨床產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，雖然可以給出大多數(shù)染色體疾病的明確結(jié)果，但伴隨著宮內(nèi)感染和約0.2%～0.5%的胎兒流產(chǎn)風(fēng)險[2， 3]。無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷（Noninvasive prenatal diagnosis， NIPD）是指利用母體外周血中胎兒成分或是胎兒特異性標(biāo)志物進(jìn)行的遺傳學(xué)分析或診斷[4]，這些胎兒成分或特異性標(biāo)志物包括胎兒有核紅細(xì)胞、胎兒游離DNA（Cellfree fetal DNA， cffDNA）等。1989年，Lo等[5]發(fā)現(xiàn)孕婦外周血中存在胎兒有核紅細(xì)胞，但Price等[6]估計母體外周血中胎兒有核紅細(xì)胞含量很低，富集獲取困難，并且在產(chǎn)后幾年內(nèi)長期存在于母血中，使其臨床應(yīng)用受到限制。1997年，Lo等[7]首次報道了母體外周血中存在cffDNA； 隨后，又通過實時熒光PCR方法測得孕婦血漿中cffDNA占血漿總DNA的3.4%～6.2%，含量遠(yuǎn)高于孕婦外周血中胎兒細(xì)胞DNA[8]。接著，從血漿中提取cffDNA的有效性和穩(wěn)定性得到證實[9]。此外，cffDNA具有諸多適合產(chǎn)前診斷的特點，如半衰期短、清除快； 不受母體之前妊娠干擾[10]； 可進(jìn)行實時動態(tài)監(jiān)測； 可從長度上與母體游離DNA進(jìn)行區(qū)分。cffDNA作為理想的產(chǎn)前診斷胎兒成分，已成為NIPD領(lǐng)域的研究熱點。

SRY基因是位于Y染色體短臂上的男性性別決定基因，人的SRY基因只含有1個外顯子，沒有內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄單位長度約1.1 kb，編碼一個含有204個氨基酸的蛋白質(zhì)[11]。以SRY基因為檢測靶標(biāo)，通過對cffDNA的SRY基因檢測確定胎兒性別，可評估如甲型血友病[12]、杜式肌營養(yǎng)不良等性連鎖遺傳病的發(fā)病風(fēng)險，降低病兒的出生率[13]。

常見的SRY基因檢測方法有普通PCR[7]，靈敏度低、容易污染； 巢式PCR[14]，雖然靈敏度和特異性有所提高，但仍需開管電泳分析； 最普遍使用的方法是實時熒光PCR[8， 15]，靈敏度高、不易污染但需較貴的Taqman探針。為此，本研究建立一種基于實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)的SRY基因檢測方法，將基于PCR的模板擴(kuò)增與基于核酸侵入反應(yīng)的信號放大技術(shù)相結(jié)合，具有高靈敏、高特異、低成本、閉管檢測不易污染等優(yōu)點。最終實現(xiàn)對含量低至4‰ （4 copies/μL）的模擬樣本的檢測，并成功檢測兩例孕期分別為9周和10周的臨床實際樣本。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

RotorGene Q實時熒光定量PCR儀（德國Qiagen公司）； Allegra X30冷凍離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）； Wizard Genomic DNA Purification Kit（美國Promega公司）； QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（德國Qiagen公司）； FEN1核酸內(nèi)切酶（實驗室自表達(dá)[16，17]）； Taq 酶（美國Promega公司）； 3（N嗎啉基）丙磺酸（MOPS， 美國Amresco公司）； MgCl2（美國NEB公司）； dNTP（上海賽百盛公司）； 其它試劑均為分析純； 實驗用水均為滅菌雙蒸水。

2.2 樣本收集與處理

孕婦EDTA抗凝血樣本由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院提供，取4 mL新鮮外周血以7400 r/min離心10 min， 小心吸取上層血漿置于干凈離心管中， 13000 r/min再離心10 min得到血漿樣本，按照QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit的操作說明提取血漿游離DNA，置于 30℃保存待用。

2.3 實驗方法

2.3.1 實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)與體系優(yōu)化 （1）反應(yīng)初始體系 1×反應(yīng)緩沖液（10 mmol/L MOPS、7.5 mmol/L MgCl2，pH 7.5），dNTPs各250 μmol/L，上下游引物各500 nmol/L，侵入探針50 nmol/L， 檢測探針250 nmol/L，熒光發(fā)夾探針250 nmol/L，Taq酶0.5 U，F(xiàn)EN1酶7.5 U，基因組DNA 1 μL， 用H2O補(bǔ)充到20 μL。（2）反應(yīng)程序 預(yù)變性（95℃，3 min）； 10個循環(huán)預(yù)擴(kuò)增（95℃，20 s； 67℃，30 s； 70℃，30 s）； 35個循環(huán)擴(kuò)增（95℃，20 s； 63℃，60 s，讀取熒光信號； 70℃，30 s）。在進(jìn)行反應(yīng)體系優(yōu)化時，分別改變Taq酶用量（0.5 U、1 U、2 U、4 U）、FEN1酶用量（1.5 U、3 U、7.5 U）、檢測探針濃度（250、500、1000和2000 nmol/L）及預(yù)擴(kuò)增退火溫度（67℃、70℃、72℃），比較各條件下SRY基因擴(kuò)增的Ct值及熒光信號曲線強(qiáng)度和斜率，選擇最優(yōu)的反應(yīng)條件。endprint

2.3.2 方法學(xué)的靈敏度、特異性和重復(fù)性考察 在優(yōu)化后的反應(yīng)體系中加入10倍梯度稀釋的男性基因組DNA模板，終濃度為105～100拷貝/20 μL反應(yīng)液，考察方法的靈敏度； 在優(yōu)化后的反應(yīng)體系中加入未孕女性基因組DNA，考察方法的特異性； 在優(yōu)化后的反應(yīng)體系中加入高中低3個濃度的男性基因組DNA，終濃度分別為105、103和101拷貝/20 μL反應(yīng)液，每個濃度重復(fù)檢測3次考察方法的重復(fù)性。

2.3.3 樣本分析 將男性基因組DNA和未孕女性基因組DNA按比例混合，得到不同SRY基因含量的模擬樣本。此外，還收集了2例孕期分別為9周和10周的母體外周血樣本。每次實驗包含待測樣本DNA、陽性對照（男性基因組DNA）、陰性對照（未孕女性基因組DNA）、空白對照。

3 結(jié)果與討論

3.1 實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)方法原理

實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)的原理如圖1所示，根據(jù)待測靶標(biāo)序列設(shè)計上下游引物、侵入探針、檢測探針和熒光發(fā)卡探針。反應(yīng)包括兩個階段，第一個階段是只進(jìn)行PCR反應(yīng)的模板預(yù)擴(kuò)增，第二階段發(fā)生PCR偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)，在63℃的PCR擴(kuò)增循環(huán)退火階段同時發(fā)生核酸侵入反應(yīng)，此時侵入探針及檢測探針與靶標(biāo)雜交形成三堿基重疊結(jié)構(gòu)，F(xiàn)EN1酶特異性識別這種結(jié)構(gòu)并切割檢測探針，產(chǎn)生Flap片段，F(xiàn)lap片段可與一條修飾了熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的熒光發(fā)夾探針退火，再次形成三堿基重疊結(jié)構(gòu)而被FEN1酶識別并將熒光基團(tuán)切割下來，熒光發(fā)卡探針的熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離產(chǎn)生熒光信號。因此，在每個擴(kuò)增循環(huán)中采集熒光信號，即可得到實時熒光擴(kuò)增曲線。

在設(shè)計探針時，使檢測探針3′端特異序列的Tm值和Flap片段的Tm均接近63℃，則在63℃退火階段，檢測探針與模板的退火結(jié)合以及Flap片段與熒光發(fā)卡探針的退火結(jié)合處于一種雜交和解離的動態(tài)過程，且完整的檢測探針與模板，熒光發(fā)卡探針與Flap片段形成下一輪的切割，不斷循環(huán)的核酸侵入反應(yīng)使信號放大106～107倍[18，19]。

3.2 實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)條件的優(yōu)化

為使SRY基因擴(kuò)增得到Ct值最小及熒光信號曲線強(qiáng)度和斜率最佳，分別對影響反應(yīng)的主要因素：檢測探針濃度、FEN1酶用量、Taq酶用量及預(yù)擴(kuò)增退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。隨著Taq酶用量的增加，熒光信號曲線的Ct值增大，可能是Taq酶用量的增加競爭性地抑制了核酸侵入反應(yīng)，因此Taq酶用量確定為0.5 U（圖2A）。隨著FEN1酶用量的減少，熒光信號曲線的Ct值增大，當(dāng)FEN1酶用量為1.5 U時，熒光信號曲線斜率已經(jīng)開始下降，為了縮短反應(yīng)時間，F(xiàn)EN1酶最佳用量確定為7.5 U（圖2B）。隨著檢測探針濃度的增加， 熒光信號曲線的Ct值會減小，但是減小的程度不大，且熒光信號曲線的強(qiáng)度和斜率都沒有減弱的趨勢，從降低成本方面考慮，檢測探針濃度確定為250 nmol/L（圖2C）。隨著預(yù)擴(kuò)增退火溫度的增加，熒光信號曲線的Ct值增加，因而預(yù)擴(kuò)增退火溫度確定為67℃（圖2D）。最終得到反應(yīng)的最佳條件為： 250 nmol/L檢測探針、 7.5 U FEN1酶、0.5 U Taq酶、67℃預(yù)擴(kuò)增退火。

（A） 不同Taq 酶用量的檢測結(jié)果：1、2、3、4分別是Taq酶為0.5 U、1 U、2 U、4 U時的檢測結(jié)果，5、6分別為陰性對照和空白對照； （B） 不同F(xiàn)EN1酶用量的檢測結(jié)果：1、2、3分別是FEN1酶為7.5 U、3 U、1.5 U時的檢測結(jié)果，4、5分別為陰性對照和空白對照； （C） 不同檢測探針濃度的檢測結(jié)果：1、2、3、4分別是檢測探針濃度為2000、1000、500和250 nmol/L時的檢測結(jié)果，5、6分別為陰性對照和空白對照； （D） 不同預(yù)擴(kuò)增退火溫度的檢測結(jié)果：1、2、3分別是預(yù)擴(kuò)增退火溫度為67、70和72℃時的檢測結(jié)果，4為空白對照。

Fig.2 Optimized results of reaction conditions for SRY gene detection

（A） Detection results with different amounts of Taq polymerase： 1， 2， 3 and 4 are detection results with 0.5 U， 1 U， 2 U and 4 U Taq polymerase， 5 and 6 are negative control and blank control； （B） Detection results with different amounts of FEN1 enzyme： 1， 2 and 3 are detection results with 7.5 U， 3 U and 1.5 U FEN1 enzyme， 4 and 5 are negative control and blank control； （C） Detection results with different concentrations of detection probe： 1， 2， 3 and 4 are detection results with 2000， 1000， 500 and 250 nmol/L detection probe； 5 and 6 were negative control and blank control； （D） Detection results with different annealing temperatures in preamplification： 1， 2 and 3 are detection results with annealing temperature of 67℃， 70℃ and 72℃， 4 is blank control.endprint

3.3 實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)檢測的靈敏度、特異性和重復(fù)性

得到最佳反應(yīng)體系后，對SRY基因的擴(kuò)增性能進(jìn)行考察，如圖3所示。在檢測體系中分別加入終濃度為105～100拷貝的男性基因組DNA考察檢測的靈敏度，同時在檢測體系中加入了未孕女性基因組DNA考察檢測特異性。結(jié)果表明，本方法能檢測出10拷貝的男性基因組DNA（圖3A），未孕女性基因組DNA無熒光信號，表明該方法特異性良好（圖3B）。此外，在檢測體系中加入高中低3個濃度的男性基因組DNA（105、103、101拷貝/20 μL反應(yīng)液），每個濃度重復(fù)檢測3次考察方法的重復(fù)性（圖3C），在檢測高濃度樣品時，3條熒光信號曲線的平均Ct=5.9，RSD=1.36%； 中濃度時，平均Ct=11.98，RSD=1.17%； 低濃度時，平均Ct=19.32，RSD=4.7%，說明本方法在檢測高濃度和中濃度時重復(fù)性良好，在檢測下限時重復(fù)性有所下降，但也能滿足檢測要求。

3.4 樣本檢測結(jié)果

cffDNA占母體外周血中總游離DNA的10%～20%[8]。為了模擬真實樣本，采用1000 copies/μL未孕女性基因組DNA 4倍梯度稀釋1000 copies/μL的男性基因DNA，分別得到男性基因組DNA濃度為1000、250、62.5、15.6 和4 copies/μL的模擬樣本，男性基因組DNA所占比例分別為100%、25%、6.2%、1.6%、4‰（圖4A）。對4‰男性基因組DNA進(jìn)行3次重復(fù)檢測，有兩次出現(xiàn)陽性信號，表明本方法能檢測到67%的含量為4‰（4 copies/μL）的模擬樣本。采用本方法檢測了兩例孕期分別為9周和10周的母體血漿樣本，檢測的兩名胎兒性別分別為一男一女（圖4B），與后續(xù)隨訪結(jié)果一致。

（A） 模擬樣本檢測結(jié)果：17為20 μL反應(yīng)液中男性基因組DNA為10004拷貝的檢測結(jié)果，8、9為陰性對照和空白對照； （B） 臨床實際樣本檢測結(jié)果：3、4分別為陰性對照和空白對照

Fig.4 Detection results of samples

（A） Detection results of simulated samples： 1 to 7 are detection results of 1000 to 4 copies male genomic DNA per 20 μL reaction liquid， 8 and 9 are negative control and blank control； （B） Detection results of clinical samples： 3 and 4 are negative control and blank control.

4 結(jié) 論

早在2003年，英國遺傳學(xué)檢測網(wǎng)絡(luò)就批準(zhǔn)了通過檢測孕婦外周血中cffDNA的SRY基因進(jìn)行無創(chuàng)性胎兒性別診斷，以用于性連鎖遺傳疾病的產(chǎn)前篩查[20]。常見的SRY基因檢測方法有普通PCR[7]，靈敏度低、容易污染； 巢式PCR[14]，雖然靈敏度和特異性都有所提高，但仍需開管電泳分析； 最普遍使用的方法是實時熒光PCR[8，15]，靈敏度高、不易污染但需較貴的Taqman探針。本研究建立的實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)方法具有以下優(yōu)點：（1）高靈敏。本方法將基于PCR的模板擴(kuò)增與基于核酸侵入反應(yīng)的信號放大技術(shù)相結(jié)合，非常適合于孕婦外周血中微量cffDNA的檢測； （2）高特異性。FEN1酶特異識別模板、侵入探針和檢測探針形成的三堿基重疊結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生切割，在沒有形成堿基重疊時，F(xiàn)EN1酶活性很弱； （3）通用性好。熒光發(fā)卡探針為通用探針，無需針對每個檢測位點專門設(shè)計； （4）無污染。檢測過程無需開蓋，減少了交叉污染的可能性； （5）操作簡便，檢測速度快。實驗操作只包含模板制備和體系配制，可在2 h內(nèi)完成檢測； 本課題組之前利用實時熒光PCR偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)檢測單核苷酸多態(tài)性[21]，但是它為單堿基序列差異，檢測通常存在一定的背景信號，而本研究以僅存在于Y染色體上的SRY基因為檢測靶標(biāo)，定性檢測其是否存在，幾乎沒有背景干擾。本方法可檢測含量低至4‰（4 copies/μL）的模擬樣本，并成功檢測兩例臨床實際樣本。文獻(xiàn)[22]報道在5周齡孕婦的血漿cffDNA中可檢測到SRY基因，而本研究樣本量有限，只檢測了兩例實際樣本，且孕期為9周和10周，下一步準(zhǔn)備擴(kuò)大樣本量，探索本方法可進(jìn)行檢測的最小孕婦周齡。cffDNA片段長度為193～313 bp，遠(yuǎn)小于母體游離DNA長度[23]，因此，可以嘗試將基于片段差異的cffDNA富集方法與高靈敏的檢測方法結(jié)合，進(jìn)一步提高檢測準(zhǔn)確性。此外，本方法可與微量血液、毛發(fā)等特殊樣本的提取方法結(jié)合，應(yīng)用于法醫(yī)鑒定領(lǐng)域[24]。endprint