馮云 章域震 楊衛(wèi)紅 潘虹 張云智 袁慶虹 韓茜 周濟(jì)華 張海林

671000 大理，云南省地方病防治所 云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點實驗室

云南省2006—2015年狂犬病病毒核蛋白基因進(jìn)化特征分析

馮云 章域震 楊衛(wèi)紅 潘虹 張云智 袁慶虹 韓茜 周濟(jì)華 張海林

671000 大理，云南省地方病防治所 云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點實驗室

目的闡明云南省2006—2015年118株狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)核蛋白(Nucleoprotein, N)基因進(jìn)化特征及流行病學(xué)特點。方法在云南省狂犬病流行區(qū)采集狂犬、可疑犬和病牛腦組織以及狂犬病病例腦組織、唾液和腦脊液標(biāo)本，用直接免疫熒光法進(jìn)行病毒抗原檢測，陽性標(biāo)本提取病毒核酸，通過RT-PCR擴(kuò)增RABV的N基因序列并進(jìn)行序列測定，用MEGA5.0軟件鄰接法(Neighbor-Joining)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果經(jīng)RT-PCR和序列測定獲得2012—2015年云南省91株RABV的N基因序列，并與2006—2011年獲得的云南27株RABV及鄰省和東南亞地區(qū)的29株RABV的N基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明，云南RABV進(jìn)化群可分為YN-A(105株)、YN-B(6株)和YN-C(7株)，并分別屬于中國進(jìn)化群中的China-I、China-VI和China-II。YN-A流行株在2006—2015年間每年均有分布，其中，2006—2011年14株，2012—2015年91株，并分布于13個州(市)；YN-B和YN-C分別僅分布于2006—2010年和2008—2011年，地區(qū)分布也較為局限。YN-A和YN-C與相鄰四川、貴州、廣西和湖南省的China-I或China-II進(jìn)化群流行株親緣關(guān)系較近，YN-B與緬甸、泰國、越南和柬埔寨流行株親緣關(guān)系較近。結(jié)論云南省RABV存在不同傳播來源的3個進(jìn)化群。YN-A為優(yōu)勢進(jìn)化群，在2006—2015年間廣泛分布于云南省狂犬病流行區(qū)，并具有較強(qiáng)的傳播速率。2012年以來云南省未再發(fā)現(xiàn)YN-B和YN-C進(jìn)化群的流行。

狂犬病是一種由狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)引起的致死率幾乎100%的急性腦脊髓炎。RABV呈世界性分布，幾乎感染所有的哺乳動物。犬咬傷是人感染狂犬病的主要途徑[1-3]。歸因于養(yǎng)犬?dāng)?shù)量的激增，尤其是農(nóng)村地區(qū)，20世紀(jì)80年代，狂犬病在我國大范圍流行，90年代得到控制。我國新一輪狂犬病大流行起始于本世紀(jì)初，幾乎席卷整個中國，雖然近幾年疫情有下降趨勢但仍未得到有效控制[4-6]。

云南省位于我國西南邊陲，狂犬病疫情較鄰省溫和，但仍屬于我國狂犬病的高發(fā)地區(qū)[6-7]。RABV核蛋白(Nucleoprotein, N)或糖蛋白(Glycoprotein, G)基因全序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，我國的RABV可劃分為6個進(jìn)化群(China-I、II、III、IV、V和VI)，各省有不同的分布[8-9]。以往研究顯示，云南境內(nèi)流行的RABV進(jìn)化群可分為YN-A、YN-B、YN-C和YN-D，并依次屬于China-I、China-VI、China-II和China-III[7]，RABV的遺傳多樣性提示該省RABV來源的復(fù)雜性[7, 10-14]。本研究于2012—2015年在云南省狂犬病流行區(qū)獲得91株RABV N基因序列，同時使用本課題組2008—2011年獲得的RABV病毒株以及GenBank國內(nèi)外RABV病毒株的N基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，以期闡明云南RABV的分布和進(jìn)化特征。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本采集在云南省狂犬病流行地區(qū)采集狂犬、可疑犬和病牛(被狂犬咬傷而發(fā)病的牛)腦組織標(biāo)本，狂犬病病例唾液、腦脊液和尸檢腦組織標(biāo)本(其中1例為貴州省盤縣狂犬病例到昆明就醫(yī)并死于昆明)。所有標(biāo)本置于密封凍存管中，4 ℃冷藏箱立即運送到云南省地方病防治所檢測。

1.2RABV抗原檢測使用熒光標(biāo)記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體(Chemicon, Temecula, CA, USA)對腦組織標(biāo)本進(jìn)行直接免疫熒光試驗(DFA)。按文獻(xiàn)方法操作[15]，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。觀察到翠綠色點狀熒光，即可判定為陽性。陽性標(biāo)本貯存于-80 ℃冰箱，備用。

1.3RABV核酸檢測使用TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)試劑提取病毒RNA。用Ready-To-Go You-Prime First-strand Beads (GE Healthcare, USA)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。巢式PCR法擴(kuò)增RABV N基因片段。擴(kuò)增引物及操作方法見：中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，2012年狂犬病監(jiān)測和實驗室檢測技術(shù)培訓(xùn)班教材，北京，2012，6—13，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4N基因全序列測定選擇RABV核酸檢測陽性樣本，使用50 μl反應(yīng)體系，用Go Taq Green Master Mix (Promega, USA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用兩對引物，NQ(5′-ATGTAACACCTCTACAATGG-3′和5′-GCCCTGGTTCGAACATTCT-3′)和NH(5′-AAGATGTGYGCYAAYTGGAG-3′和5′-GGATTGACRAAGATCTTGCTCAT-3′)[16]。反應(yīng)體系依次加入Go Taq Green Master Mix 25 μl、上下游引物各1 μl、去離子水18 μl、DNA 5 μl，充分混勻。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取2 μl產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果。PCR產(chǎn)物在生工生物工程上海有限公司完成測序。

1.5序列分析使用DNAStar軟件中的SeqMan對獲得的核苷酸序列進(jìn)行編輯；用MEGA 5.0軟件鄰接法(Neighbor-Joining method)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。本研究引用來自GenBank中29株RABV N基因序列，其中東南亞國家等12株，國內(nèi)其他省份17株(四川4株、貴州3株、廣西3株、湖南3株、湖北1株、重慶1株、福建1株、內(nèi)蒙古1株)。

2 結(jié)果

2.1序列測定2012—2015年在云南省各地采獲的標(biāo)本經(jīng)DFA和RT-PCR檢測，RABV核酸陽性者經(jīng)N基因全序列擴(kuò)增和測序，共獲得91株云南RABV的N基因核苷酸序列，其中來自犬腦組織85株、牛腦組織1株、人腦組織5株。本次測定的91株RABV分布于云南省13個州(市)及貴州省盤縣(緊鄰云南省曲靖市)(表1)。所有本次測定的云南91株RABV N基因核苷酸序列均已提交GenBank，序列號：CYN1262D-CYN1383D株依次為KP072009-KP072030，CYN1385D-CYN13115H株為KP202418-KP202448，CYN14116H- CYN15143D和CYN15145D株依次為KT932670-KT932698，CYN15146D-CYN15151D和CYN15153D-CYN15155D株依次為KX096992-KX097000。還獲得此前本室測定的2008—2011年云南23株RABV N基因序列[7]以及張文東等[10]測定的2006—2007年云南4株RABV(Md06、Zt07、Qj07和Tc06)的N基因序列(表1)。

表1 云南省118株狂犬病病毒的地區(qū)和年度分布

2.2進(jìn)化分析使用上述2006—2015年云南118株RABV的N基因核苷酸序列與來自GenBank的29株RABV國內(nèi)外參考株N基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，圖1顯示，云南株可分為3個進(jìn)化群，稱為YN-A、YN-B和YN-C。YN-A有105株，包括2012—2015年所有91株及2006—2011年14株，地區(qū)分布幾乎涉及所有本次調(diào)查地區(qū)，并與四川株(包含在圖1的YN-A黑色三角中，即為圖2中看到的JX005941、JX005944、JX005942和JX005943株)高度聚為同一進(jìn)化支，它們均與貴州株(DQ666295)、湖南株(DQ666317、EU008919、EU008920)和湖北株(EU159380)同屬China-I進(jìn)化群。YN-B有6株，包括2006年1株(保山Tc06)、2008年3株(曲靖CYN0810D、西雙版納CYN0812D和昭通CYN0818D)、2009年1株(紅河CYN0923H)和2010年1株(德宏CYN1009D)，屬于China-VI進(jìn)化群，并與東南亞進(jìn)化群(緬甸EU086164、老撾EU086194、泰國GQ303556、越南EU086209、柬埔寨EU086167、中國廣西FJ594278和DQ866 111株)同在一個分支。YN-C有7株，包括2008年2株(西雙版納CYN0811D和昭通CYN0814D)、2009年3株(玉溪CYN0920H、玉溪CYN0922H 和紅河CYN0924H)、2010年1株(普洱CYN1008D)和2011年1株(西雙版納CYN1134H)，并與廣西株(DQ866120)和貴州株(DQ 666289)同屬China-II進(jìn)化群。

圖1 云南省2006—2015年118株狂犬病病毒N基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis on the N gene sequences of 118 rabies virus strains in Yunnan from 2006 to 2015

為進(jìn)一步闡明YN-A進(jìn)化群病毒株間的進(jìn)化關(guān)系及其與相鄰省份流行株間的進(jìn)化關(guān)系，單獨使用YN-A病毒株(包括本次測定病毒株中具有代表性的22株及2006—2011年云南省代表株8株)與鄰省同屬China-I進(jìn)化群的9株RABV構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖2顯示，所有YN-A病毒株間同源較高，但亦存在一定差異，如2009—2015年的病毒株間親緣性較近并與四川2009年和2010年流行株(JX005941、JX005944、JX005942和JX005943)進(jìn)化關(guān)系最為接近；2006年和2007年YN-A流行株(Md06、Qj07和Zt07)則與2004—2006年貴州(DQ666295)、湖南(DQ666317、EU008920和EU008919)和湖北(EU159380)流行株同處一個獨立進(jìn)化亞支，具有較近的親緣關(guān)系，但與2009年以后YN-A流行株存在明顯差異。

注：▲ 2012—2015年狂犬病病毒云南株；● 2006—2011年狂犬病病毒云南株圖2 2006—2015年30株YN-A進(jìn)化群狂犬病病毒N基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Note:▲ The rabies virus strains in Yunnan from 2012 to 2015；● The rabies virus strains in Yunnan from 2006 to 2011Fig.2 Phylogenetic analysis on the N gene sequences of 30 YN-A strains of rabies virus from 2006 to 2015

2.3同源性分析使用118株云南RABV N基因序列進(jìn)行同源性比較，核苷酸和氨基酸同源性YN-A病毒株間分別為97.7%～100%和99.1%～100%，YN-B間分別為99.2%～100%和99.3%～100%，YN-C間分別為99.1%～100%和98%～100%。云南不同進(jìn)化群間核苷酸和氨基酸同源性YN-A與YN-B病毒株間分別為89.1%～89.7%和97.6%～98.7%，YN-A與YN-C間分別為88.2%～90.1%和96.2%～98.7%，YN-B與YN-C間分別為88.1%～89.9%和95.6%～97.8%。

3 討論

云南省地理位置較為特殊，北部和東部與我國狂犬病高發(fā)省區(qū)(四川、貴州和廣西等)相鄰，西部和南部與狂犬病地方性流行的緬甸、老撾和越南相連，因而狂犬病流行受到周邊地區(qū)疫情的影響。云南省20世紀(jì)80年代發(fā)生的狂犬病大流行于90年代中期得到控制，新一輪狂犬病流行始于2000年，隨后發(fā)病數(shù)逐年上升，疫區(qū)范圍不斷擴(kuò)大，2010年達(dá)到高峰，隨后逐年下降[7]，但至今仍在流行且新發(fā)縣區(qū)還在增加。不同地區(qū)RABV流行株存在一定差異并具地域特征，因此，開展RABV的監(jiān)測，闡明各地RABV的分子生物學(xué)特征對了解病毒進(jìn)化和傳播來源具有重要公共衛(wèi)生意義。以往研究表明，云南RABV具有多樣性及傳播來源較為復(fù)雜的特點[7, 10-14]，并存在YN-A、YN-B、YN-C和YN-D共4個進(jìn)化群[7]。本研究對2006—2015年云南省13個州(市)的118株RABV N基因序列的進(jìn)化和同源性分析表明，云南省存在YN-A、YN-B和YN-C三個進(jìn)化群，并基本闡明了各進(jìn)化群的地區(qū)和時間分布特點及其與相鄰省份和東南亞流行株的進(jìn)化關(guān)系，為防控本病提供了重要參考資料。此前僅有來自GenBank的1株云南早期RABV被鑒定為YN-D(China-III)[7]，隨后云南未再發(fā)現(xiàn)該進(jìn)化群。本次未檢測到Y(jié)N-D表明，近10年云南未再出現(xiàn)該進(jìn)化群的流行。

本研究發(fā)現(xiàn)，YN-A流行株廣泛分布于云南各州(市)流行區(qū)并貫穿于整個調(diào)查期間，在2006—2011年屬優(yōu)勢進(jìn)化群(同期伴隨有YN-B和YN-C)，2012—2015年則成為云南RABV流行的單一進(jìn)化群。YN-A屬于China-I進(jìn)化群，鑒于China-I進(jìn)化群為我國廣大地區(qū)尤其是云南相鄰省份的優(yōu)勢進(jìn)化群[8, 9]，認(rèn)為該進(jìn)化群病毒是通過犬類流動由鄰近省區(qū)傳入滇東南和東北地區(qū)，并逐步向滇中和滇西地區(qū)擴(kuò)散，如楚雄、大理、保山、臨滄、德宏和怒江州(市)近幾年的疫情及本次從當(dāng)?shù)厝筒±袡z測到的病原體均為YN-A病毒株。這些流行特征足以證明YN-A已經(jīng)發(fā)展成為主導(dǎo)云南狂犬病流行的主要進(jìn)化群。

YN-B和YN-C的地區(qū)和時間分布較為局限，并于2012—2015年未再發(fā)現(xiàn)這兩個進(jìn)化群的流行。YN-B屬于China-VI，在我國分布較為局限。YN-B病毒株與東南亞主要進(jìn)化群的親緣關(guān)系和同源性均較高，YN-B首次于2006年在滇西保山市騰沖縣犬類中檢測到[10]，隨后于2006和2007年分別從該市隆陽區(qū)和騰沖縣狂犬病病例中也檢測到[11]，并于2008和2009年在滇南的西雙版納和紅河州、滇東曲靖市和滇東北昭通市以及滇西德宏州梁河縣(2010)犬類中相繼檢測到Y(jié)N-B病毒。這些結(jié)果提示，2006—2010年，YN-B從滇西南境外傳入并在保山、德宏和西雙版納局部中緬邊境地區(qū)流行，進(jìn)而通過犬只流動將該病毒遠(yuǎn)距離傳播到滇東和東北地區(qū)乃至其它省份[7]。YN-C屬于China-II，China-II在我國流行時間較長，在2004年之前該進(jìn)化群與China-I均具有相似的傳播擴(kuò)散特點，然而，近幾年傳播速率逐漸減弱，分布較為局限[8, 17]。YN-C最早于2008年從昭通和西雙版納檢測到，2009和2010年在玉溪市、紅河州及普洱市也檢測到，2011年再次在西雙版納檢測到，之后未再發(fā)現(xiàn)該進(jìn)化群。這些結(jié)果提示，雖然YN-C形成從滇東北到滇西南的一條傳播鏈，但僅在有限的地區(qū)維持了較短時間，與China-II的傳播特點較為相似[8]。YN-B和YN-C流行株的傳播為何不斷減弱和消失，并被YN-A完全替換的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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2017-05-27)

(本文編輯：呂新軍)

PhylogeneticanalysisofthenucleoproteingenomeofrabiesvirusesinYunnanprovince,Chinafrom2006to2015

FengYun,ZhangYuzhen,YangWeihong,PanHong,ZhangYunzhi,YuanQinghong,HanXi,ZhouJihua,ZhangHailin

YunnanInstituteofEndemicDiseasesControlandPrevention,YunnanProvincialKeyLaboratoryforZoonosisControlandPrevention,Dali671000,China

FengYun,Email:ynfy428@163.com

ObjectiveTo understand the molecular evolution characteristics of the nucleoprotein (N) genes and epidemiological feature of 118 rabies virus (RABV) strains isolated in Yunnan province, China from 2006 to 2015.MethodsThe brain tissue samples from mad dogs, suspicious sick dogs, sick cow, and human brain tissue, saliva and CSF samples from rabies patients were collected in Yunnan province to detect the viral antigen by direct immunofluorescence assay (DFA). The viral RNA from positive samples was extracted. Coding region of N gene was amplified by RT-PCR and sequenced. The phylogenetic tree was constructed by Neighbor-Joining method of MEGA5.0 software.ResultsThe sequences of N genes of 91 RABV strains in Yunnan from 2012 to 2015 were obtained. With the sequences of N genes of 27 RABV strains in Yunnan from 2006 to 2011 and 29 RABV strains from Southeast Asian Countries, the phylogenetic analysis was performed. RABV strains in Yunnan were divided into clades YN-A (105 strains), YN-B (6 strains), YN-C (7 strains), which belonged to clades China-I, China-VI, China-II respectively. Clade YN-A was epidemic every year from 2006 to 2015, of them, 14 strains from 2006 to 2011 and 91 strains from 2012 to 2015 were distributed in 13 prefectures (cities) of Yunnan. Clades YN-B and YN-C were epidemic only from 2006 to 2010 and from 2008 to 2011 respectively. The regional distribution of clades YN-B and YN-C was limited. The strains of YN-A and YN-C were closely related to the strains of clades China-I and China-II from neighboring Sichuan, Guizhou, Guangxi and Hunan provinces. The strains of YN-B were closely related to the strains from Myanmar, Laos, Vietnam and Cambodia.ConclusionsThree RABV clades with multiple transmission sources were identified in Yunnan. Clade YN-A was widely distributed in rabies endemic area in Yunnan from 2006 to 2015, and it has strong ability to spread as principal clade in Yunnan. Since 2012, clades YN-B and YN-C were not found again in Yunnan.

Rabies virus; Nucleoprotein; Gene; Phylogenetic analysis

馮云，Email: ynfy428@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.010

狂犬病病毒；核蛋白；基因；系統(tǒng)進(jìn)化分析