劉永達 韓 光 王志彬 趙 平,△

（1中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院疼痛科，沈陽 110004; 2中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽 110004）

·論 著·

兩種不同神經(jīng)病理性疼痛模型中自噬的改變*

劉永達1韓 光2王志彬1趙 平1,2△

（1中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院疼痛科，沈陽 110004;2中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽 110004）

目的：通過觀察坐骨神經(jīng)壓迫模型CCI (chronic constriction injury, CCI) 和脊神經(jīng)結(jié)扎SNL(spinal nerve ligation, SNL) 兩種經(jīng)典的神經(jīng)病理性疼痛模型中自噬特異性蛋白表達，探討兩種神經(jīng)病理性疼痛中自噬的改變。方法：雄性SD大鼠（200～250 g）分為CCI假手術(shù)組（sC組），CCI組（C組），CCI +腹腔注射生理鹽水組（C+V組），CCI+腹腔注射氯喹組（C+C組）， SNL假手術(shù)組（sS組），SNL組（S組），SNL＋腹腔注射生理鹽水組（S+V組），SNL＋腹腔注射氯喹組（S+C組）。各組術(shù)前以及術(shù)后1、3、5、7天進行疼痛行為學測試。在術(shù)后7天sC組、C組取脊髓L4～6，sS組、S組取脊髓L4～5進行LC3、p62蛋白質(zhì)免疫印跡檢測。C+C組、C+V組、S+C組、S+V組檢測LC3表達水平。結(jié)果：CCI模型和SNL模型產(chǎn)生明顯的神經(jīng)病理性疼痛行為學改變，注射氯喹導致機械痛閾降低；CCI模型中LC3-II、p62與假手術(shù)組相比升高；SNL模型與相應(yīng)假手術(shù)組相比LC3-II升高，p62升高。C+C組和對照組相比LC3升高，S+C組與相應(yīng)的對照組相比LC3升高。結(jié)論：不同神經(jīng)病理性疼痛模型中自噬發(fā)生的改變不盡相同，并且抑制自噬可以增加神經(jīng)病理性疼痛。增強自噬可以成為神經(jīng)病理性疼痛治療方法。

神經(jīng)病理性疼痛；自噬；LC3；p62；氯喹

由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和疾病而直接引起的神經(jīng)病理性疼痛，其發(fā)病率高，嚴重影響病人的生活質(zhì)量[1～3]。但是其發(fā)病原因不盡相同，臨床表現(xiàn)個體差異明顯，發(fā)病機制錯綜復(fù)雜，常規(guī)治療效果并不令人滿意，因此，闡明其發(fā)病機制并且提供相應(yīng)臨床策略成為了亟待解決的問題[4]。

自噬在神經(jīng)退行性病變，癌癥，炎癥狀態(tài)下都有改變[5]，綜述表明，自噬可參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展、維持過程中[6]。本文首次通過對不同神經(jīng)病理性疼痛模型分別應(yīng)用氯喹抑制自噬，從而進一步佐證自噬在神經(jīng)病理性疼痛中起到積極作用。本文通過對比CCI和SNL兩種模型中自噬相關(guān)蛋白的表達，以及應(yīng)用氯喹分別阻斷CCI和SNL兩種神經(jīng)病理性疼痛自噬的降解步驟，從而說明自噬在神經(jīng)病理性疼痛中的作用。

方 法

1.材料

SD (Sprague Dawley)大鼠，雄性，SPF級別，體重200～250 g，動物來自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。實驗前置于SPF級動物房中飼養(yǎng)3天，12 h黑/白光照，自由飲水進食。本實驗動物使用經(jīng)過中國醫(yī)科大學動物倫理委員會批準。

采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為8組(n＝5)：CCI假手術(shù)組（sC組）進行除了結(jié)扎神經(jīng)步驟以外的CCI手術(shù)操作組；CCI組（C組）建立CCI模型組；CCI空白組(C+V組)，建立CCI模型之后腹腔注射生理鹽水15 mg/kg/d，每天1次至術(shù)后第5天；CCI氯喹組(C+C組)，建立CCI模型之后進行腹腔注射氯喹，15 mg/kg/d，每天1次至術(shù)后第5天，用來阻斷自噬降解階段；SNL假手術(shù)組（sS組）不結(jié)扎L5神經(jīng)，其他手術(shù)步驟同SNL；SNL組（S組）建立SNL神經(jīng)病理性疼痛模型；SNL空白組（S+V組）建立CCI模型后腹腔注射生理鹽水15 mg/kg/d，每天1次至術(shù)后第5天；SNL氯喹組（S+C組）建立CCI模型后進行腹腔注射氯喹，15 mg/kg/d，每天1次至術(shù)后第5天，用來阻斷自噬降解階段。

2.方法

根據(jù)Bennet GJ的報道[7]進行CCI (Chronic Constriction Injury)手術(shù)操作。10%水合氯醛麻醉后，切開左側(cè)大腿中部皮膚肌肉，暴露、分離坐骨神經(jīng)，用4-0絲線進行三道寬松結(jié)扎，間距1～1.5 mm。沖洗，逐層縫合。置于單籠飼養(yǎng)7天。CCI假手術(shù)組組除了不進行神經(jīng)結(jié)扎外，其他與CCI組操作相同。

SNL (Spinal Nerve Ligation)手術(shù)參照Kim方法[8]，按照手術(shù)標準操作，10%水合氯醛麻醉后，以L4水平為中心，暴露大鼠左側(cè)腰椎3～4 cm，分離并且適當少量切除椎旁肌肉，咬去橫突暴露L5神經(jīng)，用4-0號絲線扎緊神經(jīng)，結(jié)扎處遠端剪斷神經(jīng)后，沖洗，逐層縫合。手術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)大鼠至術(shù)后第7天。SNL假手術(shù)組組除了不進行神經(jīng)結(jié)扎外，其他與SNL組操作相同。所有手術(shù)操作，由同一人完成。

將被測大鼠單獨置于帶金屬絲網(wǎng)眼板(孔徑0.8×0.8 cin)的透明有機玻璃箱(50 cm×30 cm ×20 cm)中,安靜的適應(yīng)環(huán)境10～30 min。測定痛閾前,大鼠無尋覓、排便、排尿以及棲息在后腿上等動作。機械縮足反射閾值(MWT)采用von Frey測痛儀測定。用金屬探頭垂直刺激大鼠左、右后腳底。刺激強度逐漸增大，大約3 s內(nèi)使大鼠后腳產(chǎn)生快速縮足、揚足或添足反應(yīng)。首先測定從0. 6 g 開始，當此力度不能引起陽性反應(yīng)，則給予相鄰大一級的力度刺激，如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予相應(yīng)小一級力度刺激，連續(xù)進行直至出現(xiàn)第1 次陽性和陰性反應(yīng)的情況，此時的陽性反應(yīng)力度為陽性反應(yīng)最小力度，連續(xù)測量3次，間隔5 min，取其平均值。測定時間固定為上午8點到下午8點之間，術(shù)前3天、術(shù)后1天、3天、5天、7天進行行為學測試，行為學測試操作為同一人，并且不知曉分組情況，以減小偏倚。

CCI組大鼠7天后處死，取脊髓L4～6；SNL組大鼠7天后處死，取脊髓L4～5。加入預(yù)冷的蛋白裂解液50 μg/100 mg，冰上剪碎脊髓后，使用超聲進一步打碎脊髓組織，冰上靜置30 min后，將勻漿置于4℃下15 000轉(zhuǎn)/min，離心20 min。取上清，采用BCA法進行蛋白定量，測定蛋白濃度。根據(jù)濃度曲線調(diào)整濃度后，加入loading buffer后進行99攝氏度，3分鐘的蛋白變性。應(yīng)用12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫注射1 h，加入一抗4度冷房過夜。TBST洗3次，每次10 min，二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗3次，每次10 min，滴ECL發(fā)光液顯影。應(yīng)用GE發(fā)光機獲取圖片，應(yīng)用ImageJ進行圖像灰度值分析。以穆迪調(diào)帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達水平。

3.統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量結(jié)果以均數(shù)±標準誤(±SEM)表示，重復(fù)測量設(shè)計資料比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，各組之間進行單因素方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1. 各組大鼠行為學比較

各組大鼠術(shù)前行為學沒有明顯差異; sC組與C組相比較第3天出現(xiàn)明顯行為學差異，說明CCI模型建立導致神經(jīng)病理性疼痛；C+C組與C+V組比較，行為學指標第1天開始出現(xiàn)統(tǒng)計學差異的下降，說明應(yīng)用氯喹抑制自噬導致神經(jīng)病理性疼痛加強；sS組與S組相比，較術(shù)后第1天的行為學指標出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，說明SNL模型導致嚴重的神經(jīng)病理性疼痛；S+V組、S+C組中，行為學指標第1天開始出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，說明應(yīng)用氯喹抑制自噬導致SNL模型疼痛進一步加強；C組與C+V組沒有統(tǒng)計學差異；同樣的，S組與S+V組沒有統(tǒng)計學差異（見圖1）。

圖1 A: sC, C, C+V, C+C組機械縮足反射閾值的比較*P ＜ 0.05, C組與sC組相比；#P ＜ 0.05, C+C組與C+V組相比, C+V組與C組比較無統(tǒng)計學差異B: sS, S, S+V, S+C組機械縮足反射閾值的比較*P ＜ 0.05, S組與sS組相比; #P ＜ 0.05, S+C組與S+V組相比, S+V組與S組比較無統(tǒng)計學差異Fig.1 A: Mechanical withdrawal threshold in sC, C, C+V, C+C groups*P ＜ 0.05, group C compared with group sC. #P ＜ 0.05, group C+ C compared with group C+V, there is no signi fi cant difference between C+C and C.B: Mechanical withdrawal threshold in sS, S, S+V, S+C groups*P ＜ 0.05, group S compared with group sS. #P ＜ 0.05, group S+C compared with group S+V, there is no signi fi cant difference between S+C and S.

2.各組大鼠脊髓自噬相關(guān)蛋白LC3，p62表達的比較

sC組與C組中，兩組LC3、p62明顯增加，說明通過組間比較CCI模型疼痛建立后自噬受損；C+C組與C+V組相比，LC3明顯增加，說明CCI模型應(yīng)用氯喹后自噬進一步受到抑制。S組與sS組相比，LC3-II、p62灰度值明顯增加，說明SNL模型自噬受損；S+C組與S+V組LC3灰度值相比明顯增加，說明氯喹加重自噬的抑制；C組與C+V組沒有統(tǒng)計學差異，S組與S+V組沒有統(tǒng)計學差異（見圖2、3）。

討 論

本研究結(jié)果通過測試兩種神經(jīng)病理性疼痛模型行為學表現(xiàn)從而證明手術(shù)后神經(jīng)病理性疼痛模型的成功建立，并且檢測兩個自噬相關(guān)蛋白的表達。LC3（微管相關(guān)蛋白-3）是經(jīng)典的自噬指標。自噬發(fā)生后自噬小體增多，LC3-II表達增多[9]。由于自噬是一個動態(tài)變化的過程，并不能根據(jù)自噬小體多少來評價自噬潮水平，自噬起始的增加以及自噬降解步驟的減少都可以增加自噬小體數(shù)量，所以檢測p62，用來反映自噬降解步驟的情況。根據(jù)文獻報道，自噬降解水平增強，p62減小[10]。通過對sC組與C組LC3-II以及p62的分析，以及上述兩個指標得知自噬小體的數(shù)量增加和自噬降解水平降低，說明自噬功能受損，由于自噬是動態(tài)過程，從時間點觀測，上述兩個指標可能得出不嚴謹?shù)慕Y(jié)論，所以我們應(yīng)用自噬的抑制劑氯喹，來阻斷自噬小體降解水平，進一步判斷神經(jīng)病理性疼痛中自噬受損是否加重，疼痛表現(xiàn)是否也進一步加重。C+C組與C+V組兩組進行比較，應(yīng)用氯喹的模型組（C+C組）LC3-II水平增高，即自噬小體水平增加，證實了應(yīng)用氯喹對自噬降解階段的阻斷，行為學分析上C+C組MWT從第1天開始明顯下降。這說明，神經(jīng)病理性疼痛模型CCI中，自噬受損會加重神經(jīng)病理性疼痛。

圖2 各組LC3表達情況(±SEM)xFig.2 The expression level of LC3 in each group (±SEM)

圖3 sC，C，sS，S組p62表達情況(±SEMx )Fig.3 The level of p62 in group sC, C, sS, and S (±SEM)

S組與sS組相比，LC3-II、p62灰度值明顯增加，從上述指標來看，在SNL神經(jīng)病理性疼痛模型中自噬降解階段受到抑制。并且進一步證實自噬受到抑制會加重SNL模型中神經(jīng)病理性疼痛的表現(xiàn)，S+C組與S+V組相比，LC3-II表達升高，并且行為學上S+C組行為學分析從第1天開始明顯下降。由此可見SNL模型中自噬受損可以導致神經(jīng)病理性疼痛的加重。

自噬無疑是一個熱門話題，并且在基礎(chǔ)實驗及臨床應(yīng)用上，通過調(diào)節(jié)自噬，可以為癌癥、神經(jīng)退行性疾病等病癥提供可行性治療方案。不同文獻已經(jīng)報道CCI、SNL模型中，應(yīng)用自噬的激活劑，雷帕霉素（rapamycin）可以緩解神經(jīng)病理性疼痛，并且抑制IL-1β釋放[11,12]。本研究中通過對自噬的抑制從而加重神經(jīng)病理性疼痛的佐證，我們可以得出這樣一個結(jié)論，即神經(jīng)病理性疼痛中，自噬是一種保護機制。這無疑為臨床醫(yī)生提供一個可以治療神經(jīng)病理性疼痛的新思路，也使得科研工作者對神經(jīng)病理性疼痛有更進一步的認識。

雖然CCI有文章指出[13]，在C57b1/6實驗鼠的CCI模型中，與自噬起始相關(guān)的蛋白Beclin1明顯增加，并且應(yīng)用實驗鼠脊髓左右側(cè)進行對比會得出不同模型中自噬改變不盡相同的結(jié)論，但是有趣的是應(yīng)用組間對比都是7天取材的SD大鼠CCI、SNL模型中LC3，p62兩個自噬指標趨勢相同。雖然在不同疼痛模型中自噬水平改變可能不盡相同，但不可否認的是，通過激活自噬、增加自噬潮，可以緩解神經(jīng)病理性疼痛[12]，并且神經(jīng)病理性疼痛中自噬過程是受到阻斷的，并且進一步阻斷自噬會加重神經(jīng)病理性疼痛。

本文首次分別對SNL和CCI兩種疼痛模型應(yīng)用氯喹阻斷自噬降解。然而長期觀察CCI模型中自噬特異性蛋白是否變化有待進一步研究，并且神經(jīng)病理性疼痛中自噬與凋亡的關(guān)系以及其機制，以及自噬在不同神經(jīng)細胞內(nèi)以及細胞相互間的調(diào)控機制仍有待進一步闡明。

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AUTOPHAGY IN THE SPINAL CORD IS ALTERED IN SNL AND CCI NEUROPATHIC PAIN MODELS*

LIU Yong-Da1, HAN Guang2, WANG Zhi-Bin1, ZHAO Ping1,2△
(1Department of Pain, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, China;2Department of Anesthesiology, shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, China)

Objective: To investigate the role of autophagy in neuropathic pain. Autophagy-related proteins LC3 and p62 were analyzed in CCI and SNL models. Methods: SD rats (200-300 g) were randomly divided into eight groups (n=5): sham CCI group (sC), CCI group (C), CCI+Chloroquine group (C＋C),CCI+vehicle group (C+V), SNL group (S), sham SNL group (sS), SNL+Chloroquine group (S+C), SNL+vehicle group (S+V). As a neuropathic pain-related behavioral test, mechanical withdrawal threshold (MWT)were recorded before operation (baseline) and day 1, day 3, day 5, and day 7 post operation. The expression of LC3 and p62 were examined in group sC, group C, group sS, and group S. In groups C+C, C+V, S+C and S+V, the level of LC3 was tested. Results: CCI and SNL models induced a severe reduction of neuropathic pain-related MWT, and chloroquine administration enhanced neuropathic pain. Compared with group sC,LC3 and p62 protein levels were signi fi cantly changed in group C. Compared with group sS, the expression level of LC3 and p62 were significantly increased in group S. Besides, the expression level of LC3 was signi fi cantly higher in group C+C than that of group C+V. In group S+C, the LC3 level was also signi fi cantly increased compared with group S+V. Conclusion: Autophagy in the spinal cord was differently altered in SNL and CCI models. Chloroquine, an autophagy inhibitor, administration could enhance neuropathic pain.Increasing autophagy might be a potential treatment for neuropathic pain.

Neuropathic pain; Autophagy; LC3; p62; Chloroquine

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.07.003

國家自然科學基金資助課題（No.81600971）

△通訊作者 zhaop@sj-hospital.org