肖琳　麥麗娟　麥群弟

[摘要] 目的 探討非酒精性脂肪肝（NAFLD）患者血清miR-122的表達水平，探索新的診斷NAFLD的生物學標記。方法 選擇臨床確診的NAFLD患者48例，健康對照組48例。留取血清，用實時熒光定量PCR方法檢測血清miR-122的表達。統(tǒng)計學分析miR-122在兩組間表達水平的差異。 結(jié)果 NAFLD患者血清miR-122的表達水平較對照組明顯升高（P<0.01）。 結(jié)論 miR-122可能參與了NAFLD的發(fā)病機制，有可能成為NAFLD新的診斷標記物。

[關(guān)鍵詞] NAFLD；miR-122；診斷；標記物

[中圖分類號] R575.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）28-0001-03

[Abstract] Objective To investigate the expression of serum miR-122 in patients with nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD）， and to explore the new dagnostic biomarkers of NAFLD. Methods 48 patients with clinically diagnosed NAFLD and 48 healthy controls were selected. Their serum specimens were taken. The difference in expression levels of miR-122 between the two groups was statistically analyzed. Results The expression level of serum miR-122 in NAFLD patients was significantly higher than that in control group（P<0.01）. Conclusion miR-122 may be involved in the pathogenesis of NAFLD and may become a new diagnostic marker for NAFLD.

[Key words] NAFLD； MiR-122； Diagnosis； Marker

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是肝功能酶學異常和慢性肝病常見的原因之一，以肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要的病理特征。在西方發(fā)達國家流行率很高，據(jù)報道成人NAFLD患病率為20%～33%[1-2]。在我國，隨著生活水平的提高和生活方式的改變，肥胖癥和代謝綜合征的發(fā)生率呈逐年上升趨勢。一些經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)如廣州、上海、香港等地成人NAFLD患病率達到15%[3]。NAFLD可增加患心血管疾病、2型糖尿病及代謝綜合征的風險，患病人群廣泛，臨床表現(xiàn)隱匿，呈多系統(tǒng)受累，缺乏特效的治療藥物。重度NAFLD可發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎（NASH），約有20%進展為肝纖維化和肝硬化。目前我國NAFLD的患病率逐年上升，并有年輕化態(tài)勢，因此探索無創(chuàng)的、簡便易行的用于診斷及預(yù)測疾病嚴重程度的生物學指標具有重要的意義。

miRNA是近年發(fā)現(xiàn)的新的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因，長約18～25個核苷酸，是內(nèi)源性、非編碼的小RNA分子[4]，廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)，通過與靶mRNA的3-UTR堿基配對，抑制mRNA的翻譯或直接使mRNA降解，從而對細胞和基因的多種行為進行控制，如打開和關(guān)閉基因、刪除一些不需要的DNA片段、抑制同源的mRNA的表達等。目前認為miRNAs在生物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，通過對基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，miRNAs參與機體的生理及病理過程，與許多疾病的發(fā)病機制有關(guān)。本研究的目的旨在揭示miR-122在NAFLD發(fā)病機制中的作用，探索一種新的簡便易行的生物學標記用于診斷NAFLD，為尋找治療NAFLD的藥物作用靶點奠定基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2014年5月～2015年5月本院門診就診的NAFLD患者48例為實驗組，包括男28例，女20例，年齡23～64歲，平均（46.4±1.7）歲；對照組48例，為本院的健康體檢人群，排除高血壓、高血脂、糖尿病及肝功能異常者。其中男29例，女19例，年齡20～61歲，平均（44.6 ±2.3）歲。NAFLD的診斷標準參考《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[5]。兩組患者的一般資料比較，無統(tǒng)計學差異（P>0.05），具有可比性。

1.2 實驗室檢測

入組人群均取空腹靜脈血5 mL，標本離心后取上清液移至Eppendorf管中，-70℃保存?zhèn)溆?。采用實時熒光定量PCR法檢測兩組miR-122的表達情況。按照miRNeasy Serum/Plasma Kit標準操作步驟，提取樣本血清中總RNA。qRT-PCR按照miRNA qRT-PCR檢測系統(tǒng)操作步驟進行。反應(yīng)體系為：模板2 μL，特異引物2 μL，SYBR緩沖液10 μL和無RNA酶的滅菌水4 μL。擴增條件：預(yù)變性95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 15 s，45～70個循環(huán)。擴增結(jié)束后進入熔解曲線分析。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件嚴格按說明書進行。miRNA 水平用閾值循環(huán)（Ct 值）表達，采用2-△△Ct法評估m(xù)iR-122的相對表達量，以2-△Ct代表每組細胞的表達量[6]，并以此為基礎(chǔ)進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。endprint

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR結(jié)果

按照miRNA qRT-PCR檢測系統(tǒng)的操作方法進行實驗，繪制miR-122的擴增曲線和溶解曲線見封三圖1、2，結(jié)果顯示目標基因與內(nèi)參基因的擴增曲線有很好的一致性，溶解曲線呈現(xiàn)一單峰，無非特異性擴增，表明擴增效率較高，特異性較好。

2.2兩組血清miR-122的比較

NAFLD組血清miR-122的表達量為（-9.71±2.40）（2-△Ct），對照組血清miR-122的表達量為（-5.55±1.55）（2-△Ct），在NAFLD組血清miR-122的表達水平明顯升高，兩組比較有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。見封三圖3。

3 討論

非酒精性脂肪肝是世界范圍內(nèi)廣泛流行的肝臟疾病，在病理進展過程中包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝癌。非酒精性脂肪肝的診斷目前主要依靠肝組織學特征、脂肪變性、肝小葉炎癥、氣球樣變、肝纖維化等。臨床很需要一個非侵入性的血清標記物代替組織學診斷。非酒精性脂肪肝的嚴重程度和進展受到各種因素的影響，如環(huán)境因素、遺傳因素、表觀遺傳變異等。近來許多研究顯示microRNAs與非酒精性脂肪肝的發(fā)生有關(guān)。

miR-122 是miRNAs 家族成員之一，是最早發(fā)現(xiàn)的具有組織特異性的一種miRNAs，在肝組織高度表達，約占肝組織miRNAs的70%。許多研究發(fā)現(xiàn)miR-122在肝臟的生理功能和疾病發(fā)生方面都有重要的作用，miR-122表達水平的改變參與調(diào)控HCV、HBV感染、非酒精性脂肪性肝病及肝臟腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。近年來隨著人們生活方式的改變，NAFLD的發(fā)生率逐年上升，miR-122在NAFLD中的作用也受到學者們關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)miR-122是糖和脂質(zhì)代謝的重要因子，能夠促進膽固醇和脂肪酸合成，抑制膽汁酸和脂肪酸氧化，在肝臟脂質(zhì)代謝調(diào)控中發(fā)揮廣泛作用。Salvoza NC等[8]檢測NAFLD患者和健康對照組循環(huán)miR-21，miR-34a，miR-122，miR-125b和miR-375的表達水平，結(jié)果顯示血清miR-34a和miR-122水平在NAFLD患者明顯高于健康對照組。ROC工作特征曲線分析顯示miR-34a 和 miR-122曲線下面積分別是0.781 和 0.858。Yamada H等[9]用高脂飲食喂養(yǎng)大鼠2～10周，肝臟和血清中甘油三酯明顯增加，miR-122水平顯著升高，而血清轉(zhuǎn)氨酶活性正常，提示miR-122有益于診斷早期NAFLD，對于監(jiān)測肝臟疾病優(yōu)于傳統(tǒng)的臨床指標。Miyaaki H 等[10]報道血清和肝臟miR-122有明顯的相關(guān)性，輕度脂肪肝組血清和肝臟miR-122水平相對較低，在輕度纖維化組，肝臟和血清miR-122水平明顯高于嚴重纖維化組，表明血清和肝臟miR-122與肝臟脂肪變性和纖維化有關(guān)。國內(nèi)有學者高金保等[11]研究初步證實在NAFLD患者血清中miR-122、miR-21、miR-34a和miR-451呈高表達，尤以miR-122和miR-34a表達水平較高、提示有可能作為NAFLD診斷的生物學標志。多數(shù)研究認為血清miR-122水平與肝臟組織學嚴重程度有關(guān)，可用于早期評價脂肪肝進展及評價非酒精性脂肪性肝炎患者發(fā)生肝細胞癌的風險。研究發(fā)現(xiàn)在非酒精性脂肪性肝炎患者中，高水平的miR-122表達，不會發(fā)生肝細胞癌和進展到嚴重肝病階段。也有研究發(fā)現(xiàn)在疾病進展到肝纖維化之前miR-122表達水平呈下降趨勢。Akuta N等[12]選擇36例經(jīng)組織學證實NAFLD、并且無肝細胞癌的日本籍患者作為研究對象，進行二次肝活檢，探討血清miR-122水平與肝組織學特征的關(guān)系。第1次、第2次肝活檢的平均時間是4.6年。結(jié)果顯示，第二次肝活檢以后，組織學評分改善的患者，miR-122水平明顯降低。血清miR-122水平與肝組織學評分有明顯的相關(guān)性，而且和肝功能ALT、AST密切相關(guān)。

miR-122是肝臟特別是肝細胞中含量最為豐富的miRNA，其靶基因與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。Csak T等[13]通過動物實驗在飲食誘導(dǎo)的脂肪性肝炎大鼠和離體的肝細胞中評價miR-122及其靶基因的功能。發(fā)現(xiàn)HIF-1α，波形蛋白和MAP3K3是miR-122的靶基因。肝組織中miR-122降低與循環(huán)中外泌體豐富及蛋白質(zhì)豐富的血清miR-122升高相關(guān)。肝組織中miR-122降低有助于上調(diào)改變組織結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)基因（HIF-1α，波形蛋白和MAP3K3）的基因表達，認為其可能在NASH相關(guān)肝纖維化的發(fā)生機制中起重要作用。

丙型肝炎患者脂肪肝發(fā)生率較高，肝細胞脂肪變性是丙型肝炎患者主要的組織學特征。Cermelli S等[14]研究發(fā)現(xiàn)在慢性丙型肝炎患者中血清miR-122、miR-34a 和miR-16明顯高于對照組，與HCV病毒載量無相關(guān)性。同時在NAFLD患者的miR-122、miR-34a 和miR-16也明顯高于對照組。在慢性丙型肝炎組和NAFLD組，miR-122、miR-34a均與肝臟纖維化分期、炎癥活動度、肝臟酶學指標呈正相關(guān)，miR-122與血脂異常也有相關(guān)性，認為miR-122參與了脂代謝的調(diào)節(jié)機制，miR-122是調(diào)節(jié)膽固醇和脂肪酸的主要因子，可能是慢性丙型肝炎發(fā)生脂肪肝的原因之一。Clarke JD等[15]建立蛋氨酸膽堿缺乏小鼠NASH動物模型，造成中毒性肝損傷，miR-122和ALT/AST水平均明顯升高，認為miR-122可以作為評價NASH肝損傷的指標。

本研究結(jié)果顯示，NAFLD組血清miR-122表達量明顯高于健康對照組，與上述文獻報道一致，提示miR-122可能參與了NAFLD的發(fā)病機制，有望成為新的NAFLD的診斷標記和藥物作用靶點。還需要擴大樣本，根據(jù)NAFLD及肝損害的程度分層，進一步驗證miR-122的臨床診斷價值。

miRNAs作為疾病診斷標記物是近年來的研究熱點，但是miRNAs在NAFLD的相關(guān)研究中尚存在一些問題，值得深入探討：（1）相關(guān)研究標本量均較少，缺乏更多的大樣本的臨床研究數(shù)據(jù)。（2）NAFLD發(fā)病因素較多，與代謝綜合征密切相關(guān)，可以檢測到多種miRNAs的分子表達水平的變化，需要明確NAFLD中肝臟特異性的miRNAs。（3）明確NAFLD不同疾病進展階段、不同疾病嚴重程度miRNAs表達譜的變化。（4）同一種miRNAs在NAFLD不同疾病過程中的表達水平變化。endprint

[參考文獻]

[1] Farrell GC，Larter CZ. Nonalcoholic fatty liver disease：from steatosis to cirrhosis[J]. Hepatology，2006，43（2 Suppl 1）：S99-S112.

[2] De Alwis NM，Day CP. Non-alcoholic fatty liver disease：the mist gradually clears[J].J Hepatol，2008，48（Suppl 1）：S104-S112.

[3] Fan JG，F(xiàn)arrell GC. Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease in China[J].J Hepatol， 2009，50：204-210.

[4] Bladé C1，Baselga-Escudero L，Salvadó MJ，et al. miRNAs，polyphenols，and chronic disease[J].Mol Nutr Food Res，2013，57（1）：58-70.

[5] 中華醫(yī)學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組.中國非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）[J].中國醫(yī)學前沿雜志電子版，2012，4（7）：4-10.

[6] Schmittgen TD，Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative C（T） method[J].Nat Protoc，2008，3（6）：1101-1108.

[7] 楊穎卓，康鵬，高杰，等.肝特異性的miR-122調(diào)控肝臟疾病的研究進展[J].臨床肝膽病雜志，2014，30（5）：473-477.

[8] Salvoza NC，Klinzing DC，Gopez-Cervantes J，et al. Association of circulating serum miR-34a and miR-122 with dyslipidemia among patients with non-alcoholic fatty liver disease[J].PLoS One，2016，11（4）：e0153497.

[9] Yamada H，Ohashi K，Suzuki K，et al. Clin chim acta. Longitudinal study of circulating miR-122 in a rat model of non-alcoholic fatty liver disease[J]. Clinica Chimica Acta，2015，446：267-271.

[10] Miyaaki H，Ichikawa T，Kamo Y，et al. Significance of serum and hepatic microRNA-122 levels in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J].Liver Int，2014，34（7）：e302-e307.

[11] 高金保，劉霞.非酒精性脂肪性肝病患者血清中循環(huán)microRNAs表達水平及意義[J].中國肝臟病雜志（電子版），2014，6（2）：56-58.

[12] Akuta N， Kawamura Y，Suzuki F，et al. Analysis of association between circulating miR-122 and histopathological features of nonalcoholic fatty liver disease in patients free of hepatocellular carcinoma[J].BMC Gastroenterol，2016，16（1）：141.

[13] Csak T， Bala S， Lippai，et al. microRNA-122 regulates hypoxia-inducible factor-1 and vimentin in hepatocytes and correlates with fibrosis in diet-induced steatohepatitis[J]. Dliver Int，2015，35（2）：532-541.

[14] Cermelli S， Ruggieri A， Marrero JA，et al.Circulating microRNAs in patients with chronic hepatitis C and non-alcoholic fatty liver disease[J].PLoS One，2011，6（8）：e23937.

[15] Clarke JD，Sharapova T，Lake AD，et al. Circulating microRNA 122 in the methionine and choline-deficient mouse model of non-alcoholic steatohepatitis[J].J Appl Toxicol， 2014，34（6）：726-732.

（收稿日期：2017-08-16）endprint