張玲，張東來，鄧曉華

(1.黑龍江省林業(yè)科學研究所，哈爾濱 150081；2.黑龍江省林業(yè)科學院，哈爾濱 150081)

黃檗雌雄植株增殖培養(yǎng)性別差異研究

張玲1，張東來2*，鄧曉華2

(1.黑龍江省林業(yè)科學研究所，哈爾濱 150081；2.黑龍江省林業(yè)科學院，哈爾濱 150081)

為解決黃檗無性系繁殖障礙，保護黃檗種質資源及解決苗木短缺問題，選擇黃檗雌雄植株水培植株和新萌生枝條莖段為外植體，探討不同滅菌方法、不同采樣時間、不同性別對黃檗增殖培養(yǎng)的影響。結果表明：黃檗增殖培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/LNAA+1.0 mg/LGA3，該培養(yǎng)基誘導率達80%以上。黃檗外植體增殖培養(yǎng)滅菌采用0.1% HgCl2滅菌8 min能達到較好效果，不傷害苗木生長。黃檗最佳采樣時間為5月份；黃檗雌雄植株增殖培養(yǎng)性別間差異顯著，腋芽培養(yǎng)雌株平均增殖率約為雄株2～3倍。黃檗無性系繁殖技術不建全，組織培養(yǎng)是解決黃檗種質資源短缺的最好方法，黃檗雌雄植株新萌生枝條擴繁技術已經獲得成功，需要進一步研究黃檗試管苗生根問題。

黃檗；雌雄植株；增殖培養(yǎng)；差異

0 引言

黃檗(PhellodendronamurenseRupr.)，又名黃菠蘿，雌雄異株植物，為我國特有種，是東北三大珍貴硬闊葉用材樹種之一，同時也是我國名貴中藥關黃柏的藥源植物。以樹皮入藥，含小檗堿、藥根堿、黃檗酮、黃檗內脂及少量防己堿等成分，有清熱瀉火、健脾止瀉、燥濕解毒和抑菌等功效[1]。由于其具有木材和藥用雙重經濟價值而被大量砍伐，導致黃檗資源銳減，已被列為國家一級珍貴樹種、國家二級保護易危物種。黃檗的化感作用影響其對自身及其他種群自然更新，主要靠種子和根蘗繁殖，繁殖速度慢，難以滿足市場需求。黃檗自然更新差，成熟種子不容易脫落，種子萌發(fā)受限，不能完成種子后熟和春化。黃檗扦插繁殖技術不成熟，目前沒有找到合適的扦插方法。組織培養(yǎng)技術可在短期內獲得大量整齊優(yōu)質的苗木，是解決種苗短缺的有效途徑之一。組織培養(yǎng)技術不受季節(jié)限制，繁殖力高等，能夠很好地解決這個問題。國內對黃檗的研究多集中在其價值利用、化學成分分析、提取、環(huán)境脅迫與次生代謝以及藥效學等方面，也有部分工作涉及到人工栽培繁殖、組織培養(yǎng)、種群生態(tài)、病蟲害等方面[2-8]，有關黃檗雌雄植株組織培養(yǎng)在性別上的差異研究未見報道。雌雄異株的物種不同性別間在生理生化、生長、形態(tài)、生殖、分布以及基因表達等方面出現明顯的差異[9]。不同性別的植物具有不同的經濟價值，研究黃檗雌雄植株組織培養(yǎng)性別差異，可以為黃檗無性系繁殖技術從機理角度深入研究提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品采集于哈爾濱松樂公園，黃檗均為人工混交林。樂松公園位于黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)，黃檗平均樹齡為45 a，郁閉度為0.6左右，林內有白樺、水曲柳和榆樹等喬木，忍冬、紫丁香等灌木[9]。在12月末采集的枝條雪藏3月份水培(1)、3月份直接水培(2)、5月份剪取黃檗莖段(3)，用流水沖洗1h，再用飽和中性洗滌液清洗枝條，流水沖洗徹底，濾紙吸干表面水分，放到滅好菌的超凈工作臺上，消毒滅菌，最后用無菌水漂洗3～5次后用無菌濾紙吸干表面水分，接種在已滅過菌的培養(yǎng)基上。

培養(yǎng)基選擇：(1)MS+1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/LNAA+1.0 mg/LGA3。(2)MS+1.0 mg/L6-BA單位下同+0.05 mg/LNAA+3%蔗糖；(3)MS+0.25 mg/L6-BA+1.5 mg/LNAA+3%蔗糖。

(4)MS+1.0 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA+0.25 mg/LGA3+2.5%蔗糖。所有培養(yǎng)基均附加6 g瓊脂，pH為5.8～6.0。每個處理接種30瓶，進行3個批次實驗。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照時間12 h/d，光強為30～40 Lx。

1.2 外植體消毒滅菌

(1)0.1% HgCl2溶液浸泡8 min，無菌水沖洗3～5次。

(2)3% NaClO溶液浸泡10 min，無菌水沖洗3～5次。

(3)75%酒精浸泡10 s，無菌水沖洗3～5次。

1.3 數據計算

外植體增殖系數=繼代后的外植體總數/繼代前外植體總數。

誘導率=分化的外植體總數/接種外植體總數。

存活率=存活的接種數/接種外植體總數。

利用SPSS 19.0軟件中的One-sample T test檢驗各處理之間存在差異，表中數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌方法對外植體的影響

外植體選擇5月份萌發(fā)嫩枝，接種后的第三天觀察試驗外植體的滅菌狀況，發(fā)現75%酒精滅菌出現褐化，并有燒死嫩葉。3% NaClO溶液滅菌不徹底的腋芽開始出現染菌現象。經0.1%氯化汞滅菌8 min的試材污染率較小，并沒有出現褐化現象，經過30d觀察，組培苗可以正常生長，這說明0.1%氯化汞溶液滅菌8 min適合黃檗外植體滅菌，即可以達到殺菌的目的，又對黃檗外植體無損傷，見表1。

表1 不同滅菌處理對黃檗外植體影響Tab.1 The effects of different sterilization methods on Phellodendron amurense

2.2 不同培養(yǎng)基對黃檗莖段增殖的影響

將外植體切成1 cm左右的頂芽帶一對腋芽的莖段轉入4種培養(yǎng)基中。因試驗采用激素及濃度的差異，外植體出現明顯不同生長狀況。研究發(fā)現6-BA與NAA組合比較適應黃檗組織培養(yǎng)，與前人研究結果一致，但是生長較慢，本研究通過改良培養(yǎng)基中的激素添加適量GA3達到即擴繁又生長的目的。通過觀察(1)號培養(yǎng)基接種3 d，葉柄開始脫落，外植體挺直，但未見明顯的生長。黃檗生長較慢，接種7 d，外殖體開始變綠，植株開始萌動，10 d開始正常生長，但腋芽未開始增殖，15～17 d，腋芽開始膨脹，20～25 d腋芽分化，誘導率和平均增殖系數見表2。(2)號培養(yǎng)生長緩慢，出現黃化現象，葉片脫落嚴重；(3)號培養(yǎng)基培養(yǎng)7d莖段與培養(yǎng)基接觸處開始膨大，出現愈傷組織，生長較慢；(4)號培養(yǎng)基培養(yǎng)10d左右開始變黃，葉片脫落，無生長跡象。

2.3 不同采樣時間對黃檗腋芽增殖的影響

以室外采種接種黃檗莖段進行擴繁增殖培養(yǎng)，篩選出(1)號培養(yǎng)基為最佳增殖培養(yǎng)基。以(1)號培養(yǎng)基篩選黃檗雌雄植株性別間的差異，見表3。(1)水培污染率較小，分化率可以達到80%左右，但生長較慢，其中雌株誘導率為82%，雄株誘導為80%。(2)水培材料結果與(1)號水培材料無顯著差異。(3)5月采集嫩枝，誘導率較高，雌株誘導率大于雄株，方差分析結果表現，黃檗植株增殖培養(yǎng)性別間差異存在顯著差異(P<0.05)，如圖1和圖2所示。

表2 培養(yǎng)基對黃檗莖段增殖的影響Tab.2 The effects of rapid propagation on different culture medium

表3 黃檗雌雄植株增殖培養(yǎng)性別差異Tab.3 The gender difference on rapid propagation of Phellodendron amurense

圖2 黃檗腋芽增殖培養(yǎng)第30天Fig.2 The rapid propagation 30 days of Phelldendron amurense

雌株莖尖的分化頻率明顯地高于雄株，約為雌株的2～3倍，再生植株的長勢也好，污染率低。另外，黃檗組織培養(yǎng)采樣時間差異較大，1月份枝條雪藏后水培枝分化率高，但生長慢，5月份萌生枝條分化率高，生長快。因此在選用接種材料時，應充分考慮黃檗個體性別以及采樣時間，對再生植株可用腋生分枝迅速增殖。增殖系數過大則會出現叢生芽細弱、矮小、葉柄較長、不易生根或生根后移栽時不易成活等問題。同時還發(fā)現，樹木個體之間的差異對再生植株誘導率影響很大，有時甚至超過齡級的影響。

3 討論

(1)黃檗滅菌最好不要選擇酒精，容易褐化，并導致死亡。外植體的褐化與外植體自身的生物學特性密切相關，特別是藥用植物培養(yǎng)中普遍出現的現象，研究認為是植物體內多酚在多酚氧化酶的作用下轉變?yōu)轷愇镔|所致[10-11]，主要與植物外植體基因型、生物學特性、生理狀態(tài)、培養(yǎng)基、植物生長調節(jié)劑等條件，以及繼代時間過長，轉接過程中操作不當等等原因有關，黃檗增殖過程中褐化較嚴重，經過多次實驗探索，將培養(yǎng)基中添加活性炭可以有效地解決了繼代褐化現象。本研究考慮到材料比較幼嫩，對高濃度次氯酸鈉敏感度較差，3%次氯酸鈉溶液并適應減少消毒時間以減少對外植體的傷害，結果表明對外植體傷害較小，但消毒不夠徹底，而張玉紅研究認為用10%次氯酸鈉溶液消毒8 min殺菌效果最理想[3]，本研究采用此方法發(fā)現，有些細菌殺不完全。

(2)6-BA比例高時有利于芽的分化，NAA是植物組織培養(yǎng)常用的激素，不同激素的濃度及組合效果不一樣[12-13]。低濃度的6-BA與NAA混合時，適當NAA濃度可以促進生長，形成愈傷組織，6-BA比例高時有利于芽的分化，比例低時有利于根的分化，因此，本研究6-BA選擇1.5 mg/L和NAA0.2 mg/L組合，另外添加GA3，促進細胞分裂并調控其分化。黃檗愈傷組織對不同激素組合的反應，說明不同種類激素的效應差異對植物物種或性別差異反應的特異性，進一步說明了激素作用的復雜性[14-15]。

(3)本研究表明黃檗雌雄植株外植體增殖過程中性別差異顯著，產生差異的原因與雌雄植株的生理、生殖以及抗逆性等方面出現的差異有關。雌雄個體在適應自然界的過程中可能采取不同的生態(tài)對策，使其在生長、生殖、空間分布和資源配置方面表現出明顯的差異[16-18]。

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StudyontheDifferenceoftheRapidPropagationofPhellodendronamurenseRupr.inDioecious

Zhang Ling1，Zhang Donglai2*，Deng Xiaohua2

(1.Forestry Research Institute of Heilongjiang Province，Harbin 150081；2.Heilongjiang Academy of Forestry，Harbin 150081)

In order to solve thePhellodendronamurensereproduction barrier and to protect germplasm resources and solve the problem of shortage of nursery stock，we chosePhellodendronamurensenew initiation branch stem segments as explants to discuss the different sterilization methods，sampling time，the influence of gender on cultivatingPhellodendronamurensepropagation.The results showed that the best medium for the cultivation ofPhellodendronamurensewas MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+1.0mg/L GA3and the induction rate was more than 80%.Sterilized the explants ofPhellodendronamurensein 0.1% HgCl2for 8 min could reach a good effect and no harm to seedling growth.The best sampling time is May.The propagation culture of the male and female plants was remarkable，and the average breeding rate of the female was about two to three times than the male.Phellodendronamurensereproduction technology was incomplete，and the tissue culture technology is the best way to solve the shortage of germplasm resources.Phellodendronamurenseplant propagation technology has been successful with new initiation branches，and needs further study on thePhellodendronamurensetube seedlings rooting problems.

Phellodendronamurense；male and female plant；rapid propagation；difference

S 718

A

1001-005X(2017)06-0011-04

2017-06-09

國家自然科學基金資助項目(31600485)；黑龍江省省屬科研院所基本科研業(yè)務費專項(2016-06)

張玲，博士研究生，副研究員。研究方向：經濟林。E-mail：slyszl@126.com

*通信作者：張東來，碩士，副研究員。研究方向：森林培育。E-mail：slkyzdl@163.com

張玲，張東來，鄧曉華.黃檗雌雄植株增殖培養(yǎng)性別差異研究[J].森林工程，2017，33(6)：11-14.