張慧敏 夏海磊 黃 強(qiáng) 緒 欣 毛永江 岑 寧 楊章平

(揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

海子水牛瘤胃微生物的宏基因組學(xué)分析

張慧敏 夏海磊 黃 強(qiáng) 緒 欣 毛永江 岑 寧 楊章平*

(揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

為系統(tǒng)探討海子水牛瘤胃內(nèi)的微生物組成及木質(zhì)纖維素降解酶系，本試驗(yàn)利用基于高通量測序的宏基因組學(xué)技術(shù)對海子水牛(2.5歲左右，平均體重為493 kg)瘤胃液樣本進(jìn)行組學(xué)分析。結(jié)果表明，共獲得了77 283 638條reads，并拼接出744 712個scaffold。經(jīng)prodigal分析后，共預(yù)測出827 044個基因。通過基因注釋發(fā)現(xiàn)海子水牛瘤胃中含有多種木質(zhì)纖維素降解微生物，如生黃瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)及棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)。此外，還發(fā)現(xiàn)有38 011個基因編碼蛋白質(zhì)具有木質(zhì)纖維素降解酶活性，其中糖苷水解酶(GH)基因數(shù)量最多(17 877個)，糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)(8 637個)、碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)(4 693個)和碳水化合物酯酶(CE)基因(4 214個)數(shù)量次之，多糖裂合酶(PL)(1 296個)和輔助氧化還原酶(AA)基因(934個)數(shù)量較少。在GH基因中，歸屬于GH2、GH43、GH97、GH3家族的基因較多，且編碼蛋白質(zhì)具有寡糖降解酶活性的基因數(shù)量最多。此外還發(fā)現(xiàn)了少量的纖維小體組分蛋白基因。結(jié)合其他物種腸胃宏基因組中GH基因比對分析，發(fā)現(xiàn)海子水牛瘤胃中的纖維素酶、半纖維素酶和分支降解酶比例與奶牛瘤胃較為接近。由此可見，海子水牛瘤胃內(nèi)含有豐富的木質(zhì)纖維素降解微生物及酶系，這將為篩選具有工業(yè)應(yīng)用潛力的酶基因奠定理論基礎(chǔ)。

海子水牛；瘤胃；宏基因組；微生物；木質(zhì)纖維素降解酶

木質(zhì)纖維素是含有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等成分的植物生物質(zhì)的統(tǒng)稱[1]。瘤胃是自然界中降解木質(zhì)纖維素能力最強(qiáng)的生態(tài)系統(tǒng)之一，能夠在48 h內(nèi)降解飼糧中60%～65%的木質(zhì)纖維素，為反芻動物提供營養(yǎng)物質(zhì)，可見瘤胃內(nèi)蘊(yùn)藏著豐富的木質(zhì)纖維素降解微生物和酶系[2]。瘤胃內(nèi)微生物種類繁多、數(shù)量巨大，共有超過3 000種微生物，既包括細(xì)菌、原蟲、真菌和古細(xì)菌，也有噬菌體和病毒[3]。瘤胃是一座巨大的生物資源庫，蘊(yùn)藏著許多有具有工業(yè)應(yīng)用潛力的木質(zhì)纖維素降解酶系。Zhou等[4]從牦牛瘤胃中發(fā)現(xiàn)了一個雙功能酶，同時具有葡萄糖苷酶及木糖苷酶的活性。Huang等[5]從湖羊瘤胃中獲得了一種嗜低溫的木聚糖酶基因。但瘤胃是一個嚴(yán)格厭氧的環(huán)境，絕大多數(shù)瘤胃微生物是不可培養(yǎng)的，這就大大限制了人們對瘤胃基因資源的探索研究。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，宏基因組測序已成功運(yùn)用于分析特定環(huán)境中的微生物組成、代謝通路研究以及酶蛋白的功能分析等[6]。

目前，已有許多應(yīng)用高通量測序技術(shù)研究反芻動物瘤胃微生物的報(bào)道。Hess等[7]在2011年首次對奶牛瘤胃微生物的宏基因組進(jìn)行了測序，共發(fā)現(xiàn)了27 755個木質(zhì)纖維素降解酶基因，其中糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GH)家族GH13(3 442個)和GH3(2 844個)的基因最多，而含有黏連模塊和對接模塊的基因分別為80和188個，這些基因?yàn)榘l(fā)掘新型木質(zhì)纖維素降解酶提供了可能性。Patel等[8]利用青草、干草飼喂水牛，采樣后進(jìn)行宏基因組高通量測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青草組的水牛瘤胃中GH28及果膠裂解酶的基因數(shù)量顯著多于干草組。Singh等[9]利用高通量測序技術(shù)對印度水牛瘤胃微生物宏基因組進(jìn)行測序，共獲得了137 270個重疊群(contigs)，預(yù)測其中2 614個具有降解木質(zhì)纖維素的功能。王繼文等[10]對山羊瘤胃與糞便微生物基因組進(jìn)行了比對研究，發(fā)現(xiàn)二者存在較大差異，瘤胃微生物主要以擬桿菌門為主，厚壁菌門次之，相對豐度最高的屬為普雷沃菌屬，而糞便中的微生物以厚壁菌門為主，擬桿菌門次之，相對豐度最高的屬為瘤胃球菌科下未分類的屬。

海子水牛屬沼澤型水牛，分布于江蘇北部沿海地區(qū)，是我國主要的地方良種之一，它適應(yīng)當(dāng)?shù)氐淖匀簧鷳B(tài)條件，抗逆性突出，耐粗飼，在草質(zhì)較差的情況下，仍能較好地生長及勞役，可見海子水牛瘤胃內(nèi)蘊(yùn)藏著獨(dú)特的木質(zhì)纖維素降解微生物和酶系。然而，到目前為止，對于沼澤型水牛瘤胃內(nèi)的微生物組成及其功能基因尚鮮見報(bào)道。本研究借助于高通量測序技術(shù)，首次獲得海子水牛瘤胃微生物的宏基因組數(shù)據(jù)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對分析后，獲得功能注釋，結(jié)合其他物種腸胃宏基因組信息進(jìn)行比對研究，旨在系統(tǒng)探討海子水牛瘤胃內(nèi)的微生物組成及木質(zhì)纖維素降解酶系，以期從中發(fā)掘新型具有工業(yè)應(yīng)用潛力的木質(zhì)纖維素降解酶。

1 材料與方法

1.1樣品采集

選取3頭2.5歲左右的海子水牛，平均體重為493 kg。試驗(yàn)水牛的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致，每天飼喂2次，自由采食，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。飼喂60 d后進(jìn)行稱重并屠宰，屠宰后立刻采集瘤胃液樣品，經(jīng)4層滅菌紗布過濾后，迅速置于液氮中。

在相同的飼糧及生活環(huán)境下，牛瘤胃內(nèi)的微生物群落組成較為相似[7,11]，因此我們隨機(jī)選取1頭海子水牛的瘤胃液進(jìn)行下一步測序分析。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2宏基因組DNA的提取

按照QIAamp DNA micro kit (德國Qiagen)試劑盒說明書的要求，進(jìn)行瘤胃液宏基因組DNA的分離和純化。使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop分光光度計(jì)，對分離純化后的DNA進(jìn)行檢測和評價。

1.3宏基因組測序及分析

純化后的樣品送上海歐易生物公司進(jìn)行高通量測序。首先利用Covaris M220進(jìn)行宏基因組DNA片段化處理，打斷至300 bp左右，末端連接Y字形接頭，通過接頭PCR將DNA片段連接到芯片上形成“橋”并制成文庫，隨后通過Illumina HiSeq 2000高通量測序平臺進(jìn)行測序。

獲得測序數(shù)據(jù)后，首先進(jìn)行宿主基因的過濾和質(zhì)量剪切等優(yōu)化處理；其次使用軟件SOAP denovo 2.04對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接組裝，組裝時選用的kmer參數(shù)為65；然后使用軟件prodigal 2.6.3對基因組序列進(jìn)行基因預(yù)測；最后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對分析。

通過BLAST將預(yù)測得到的基因序列與GenBank的非冗余核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(Nonredundant database，NR)進(jìn)行比對(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/taxonomy)，將evalue≤1e-5的序列作為有意義的序列，并獲得物種注釋信息；最后將預(yù)測基因與COG數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/COG/COG/kyva)、GO數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)和KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)進(jìn)行比對，獲得基因功能注釋。

1.4碳水化合物基因分析

使用CAZy數(shù)據(jù)庫(http://www.cazy.org/)的對應(yīng)工具h(yuǎn)mmscan(http://hmmer.janelia.org/search/hmmscan)將預(yù)測基因與CAZy數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得基因?qū)?yīng)的碳水化合物活性酶注釋信息，然后使用碳水化合物活性酶對應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該碳水化合物活性酶的豐度。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中氨基酸序列的相似性，可以將不同物種來源的碳水化合物活性酶分成GH、糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferase，GT)、多糖裂合酶(polysaccharide lyase，PL)、碳水化合物酯酶(carbohydrate esterase，CE)、碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding module，CBM)、輔助氧化還原酶(auxiliary activity，AA)共6大類蛋白質(zhì)家族。同時將海子水牛的CAZy分析結(jié)果，與奶牛及印度水牛瘤胃、白蟻后腸及雞盲腸宏基因組中的CAZy分析結(jié)果進(jìn)行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1宏基因組測序結(jié)果

經(jīng)Illumina Hiseq高通量測序平臺測序，獲得77 283 638條reads，過濾水牛宿主基因(GCA_000003055.5,Bostaurus Bos_taurus_UMD_3.1.1)后共獲得了10.79 GB的測序數(shù)據(jù)。使用軟件SOAP denovo 2.04對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接組裝，共得到744 712個scaffold，約250 Mbp的宏基因組序列(表2)。

使用軟件prodigal 2.6.3對基因組序列進(jìn)行基因預(yù)測，預(yù)測得到氨基酸序列共827 044條，基因平均長度274 bp。

2.2基因注釋結(jié)果

將827 044條基因序列與NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，選取evalue≤1e-5的序列，共498 644條。如圖1所示，與NR數(shù)據(jù)庫中序列的相似度主要分布在50%以上，只有7.8%的序列與NR數(shù)據(jù)庫序列高度相似(相似度>95%)，表明此次測序結(jié)果中含有許多新基因。

表2 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

圖1 與NR數(shù)據(jù)庫序列的相似度

將測序數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫比對，獲得分析序列的蛋白質(zhì)功能注釋信息。同時統(tǒng)計(jì)基因比對到各個物種的比例，結(jié)果顯示蛋白質(zhì)編碼基因來源于擬桿菌門(55.3%)的最多，來源于厚壁菌門的比例可達(dá)到12.7%,3.23%及2.71%的基因分別來源于纖維桿菌門及變形菌門(表3)。

此外，將樣品中物種水平上的分類層級關(guān)系繪制成進(jìn)化分支圖(圖2)，從根部開始向外，依次為界—門—綱—目—科—屬—種—菌株的分類。共分類出來了3個界：細(xì)菌界、古菌界、病毒界，海子水牛瘤胃中的微生物大部分為細(xì)菌界。在菌株的分類中，未分類的甲烷短桿菌(Methanobrevibacterunclassified)及豬沙波病毒(Porcinesapelovirus)分別屬于古菌界及病毒界。而細(xì)菌界中共測得8種主要菌株，分別為棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)、生黃瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、未分類的丁酸弧菌(Butyrivibriounclassified)、鏈球菌(Streptococcusinfantarius)、密螺旋體JC4(Treponemasp. JC4)及伯氏密螺旋體(Treponemabryantii)、產(chǎn)琥珀酸纖維桿菌(Fibrobactersuccinogenes)。

表3 最多的15個門的分布

2.3COG數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果

對宏基因組中的預(yù)測基因進(jìn)行COG功能分類預(yù)測。發(fā)現(xiàn)功能集中在碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝的基因是最多的，數(shù)量達(dá)到37 933個，由此可見該宏基因組內(nèi)可能含有大量的木質(zhì)纖維素降解酶基因(圖3)。

2.4GO分類結(jié)果

對得到的基因進(jìn)行GO分類，統(tǒng)計(jì)基因在生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞成分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3個GO類別中。在BP類中，集中在代謝、細(xì)胞外加工的基因最多；在CC類中，集中在細(xì)胞、細(xì)胞組分的基因最多；在MF類中，集中在結(jié)合以及催化功能的基因最多(圖4)。

2.5KEGG分析結(jié)果

105 560個基因被富集到247條KEGG通路中，表4為富集最明顯的前10條KEGG通路。大部分基因被富集在小分子的代謝中，如氨基酸的生物合成、嘌呤代謝、嘧啶代謝、碳代謝、氨酰tRNA的生物合成等。此外，還有5 236個基因富集在淀粉和蔗糖代謝中。

A:未分類的甲烷短桿菌Methanobrevibacterunclassified；B:豬薩佩羅病毒Porcinesapelovirus；C:棲瘤胃普雷沃氏菌Prevotellaruminicola；D：生黃瘤胃球菌屬Ruminococcusflavefaciens；E:白色瘤胃球菌屬Ruminococcusalbus；F:未分類的丁酸弧菌屬Butyrivibriounclassified；G:鏈球菌Streptococcusinfantarius；H:梅毒螺旋體菌 JC4Treponemasp. JC4；I:布賴恩蒂密螺旋體Treponemabryantii；J:產(chǎn)琥珀酸纖維桿菌屬Fibrobactersuccinogenes。

圖2物種的分類

Fig.2 The classification of species

2.6CAZy數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果

經(jīng)hmmscan分析，發(fā)現(xiàn)有38 011個基因比對到CAZy數(shù)據(jù)庫中，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖5所示，宏基因組中的GH基因數(shù)量最多(17 877個)，GT(8 637個)、CBM(4 693個)和CE基因(4 214個)次之，PL和AA基因較少，數(shù)量分別為1 296和934個。此外還發(fā)現(xiàn)了42個黏連蛋白(cohesin)基因、236個對接蛋白(dockerin)基因以及82個S層同源結(jié)構(gòu)域(S-layer homology，SLH)。

17 877個GH基因分布在不同的GH基因家族，其中GH2、GH43、GH97、GH3家族的基因較多，GH12和GH62家族的基因最少(表4)。瘤胃中的木質(zhì)纖維素降解酶可水解植物細(xì)胞壁中的纖維素和半纖維素，根據(jù)水解底物類型的不同，可將海子水牛瘤胃宏基因組內(nèi)的GH基因家族分類(表5)，有932個基因編碼的蛋白質(zhì)具備纖維素酶活性，其中GH5及GH9基因家族的數(shù)量較多；1 011個基因編碼的蛋白質(zhì)具備半纖維素酶活性，其中GH10基因家族的基因數(shù)量最多；分支降解酶(GH67和GH78)的編碼基因共有538個；3 266個基因編碼的蛋白質(zhì)具有寡糖降解酶活性，其中GH2基因家族的基因數(shù)量最多。

A:RNA加工和修改 RNA processing and modification；B:染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學(xué) Chromatin structure and dynamics；C:能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換 Energy production and conversion；D:細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分區(qū) Cell cycle control,cell division,chromosome partitioning；E:氨基酸運(yùn)輸和代謝 Amino acid transport and metabolism；F:核苷酸運(yùn)輸和代謝 Nucleotide transport and metabolism；G:碳水化合物的運(yùn)輸和代謝 Carbohydrate transport and metabolism；H:輔酶運(yùn)輸和代謝 Coenzyme transport and metabolism；I:脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝 Lipid transport and metabolism；J:翻譯,核糖體結(jié)構(gòu)和生物轉(zhuǎn)化 Translation,ribosomal structure and biogenesis；K:轉(zhuǎn)錄 Transcription；L:復(fù)制、重組和修復(fù) Replication,recombinationan drepair；M:細(xì)胞壁/膜/包膜生物合成 Cell wall/membrane/envelope biogenesis；N:細(xì)胞活性 Cellmotility；O:蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯后的修改,蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化,分子伴侶 Post translational modification,protein turn over,chaperones；P:無機(jī)離子運(yùn)輸和代謝 Inorganicion transport and metabolism；Q:次生代謝產(chǎn)物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝 Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism；R:通用功能預(yù)測 General function prediction; S:未知功能 Function unknown；T:信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 Signal transduction mechanisms；U:胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和膜泡運(yùn)輸 Intracellular trafficking,secretion,andvesicular transport；V:防御機(jī)制 Defense mechanisms；W:細(xì)胞外結(jié)構(gòu) Extracellular structures；X:移動基因組(噬菌體原、轉(zhuǎn)座子) Mobilome (prophages,transposons)；Y:核結(jié)構(gòu) Nuclear structure；Z:細(xì)胞骨架 Cytoskeleton。

圖3COG分類

Fig.3 COG classification

3 討 論

本試驗(yàn)通過高通量測序技術(shù)對海子水牛瘤胃液樣本進(jìn)行組學(xué)分析，共獲得了77 283 638條reads，并拼接出744 712個Scaffold。將測序數(shù)據(jù)與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，功能集中在碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝的基因是最多的，除此之外，富集在氨基酸運(yùn)輸及代謝、細(xì)胞壁及細(xì)胞膜生物合成基因也較多，這與印度水牛的報(bào)道相似[9]。在GO分類分析中發(fā)現(xiàn)，集中在結(jié)合以及催化功能的基因最多。由此可見，海子水牛瘤胃宏基因組內(nèi)可能含有大量的木質(zhì)纖維素降解酶基因。

根據(jù)基因注釋到物種的比例可知，來源于擬桿菌門的基因較多，可占55.3%。Jami等[13]在奶牛瘤胃中也發(fā)現(xiàn)了相同的微生物分布。此外，根據(jù)物種分類結(jié)果可知，海子水牛瘤胃中的微生物大部分為細(xì)菌界，其中的生黃瘤胃球菌、白色瘤胃球菌及產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌可產(chǎn)出大量的纖維素酶降解飼糧中的木質(zhì)纖維素，被認(rèn)為是瘤胃中降解木質(zhì)纖維素的主要微生物，而棲瘤胃普雷沃氏菌可降解木聚糖及果膠[14-15]。

纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶的協(xié)同作用可降解植物的細(xì)胞壁，為反芻動物提供營養(yǎng)物質(zhì)，而這3類酶基因均存在于海子水牛的瘤胃中。GH5及GH9基因家族的含量較高，二者可達(dá)到GH基因總量的4.77%。GH10、GH11、GH26和GH28家族的酶具有半纖維素酶活性，其中GH10和GH11家族屬于木聚糖酶，它能從木聚糖主鏈的內(nèi)部隨機(jī)切割β-1,4木糖苷鍵，將其降解為低聚木糖和少量木糖，而CE1、CE4、CE6及CE7家族的木聚糖酯酶可作用于木聚糖的支鏈[8,16]。此外，PL1、PL9及PL10家族的酶具有果膠裂解酶活性，而CE8家族的酶具有果膠甲基酯酶活性，可脫去果膠中的甲酯基團(tuán)，生成果膠酸[17]。在GH分類中，寡糖降解酶的比例最高，可能是由于經(jīng)過纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶的協(xié)同作用后，植物細(xì)胞壁被降解為大量的低聚寡糖，這些物質(zhì)需要被進(jìn)一步降解后才可被反芻動物吸收利用。而寡糖降解酶中的GH2家族的酶數(shù)量最多，主要包括β-D-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-D-甘露糖苷酶及外切β-氨基葡萄糖苷酶[18]。

A1:生物黏附 biological adhesion;A2:生物調(diào)節(jié) biological regulation;A3:細(xì)胞死亡 cell killing;A4：組織或生物合成細(xì)胞組件 cellular component organization or biogenesis;A5：細(xì)胞過程 cellular process;A6:發(fā)育過程 developmental process;A7：定位建立 establishment of localization;A8：增長 growth;A9：免疫系統(tǒng)的過程 immune system process;A10：定位 localization;A11:移動 locomotion;A12:代謝過程 metabolic process;A13:多細(xì)胞生物的過程 multicellular organismal process;A14:多組織過程 multi-organism process;A15:生物過程反向調(diào)節(jié) negative regulation of biological process;A16:生物過程正向調(diào)節(jié) positive regulation of biological process;A17:生物過程的調(diào)節(jié) regulation of biological process;A18:繁殖 reproduction;A19:生殖過程 reproductive process;A20:刺激反應(yīng) response to stimulus;A21：節(jié)律過程 rhythmic process;A22：信號signaling;A23：單組織過程 single-organism process;B1：細(xì)胞 cell;B2：細(xì)胞連接 cell junction;B3：細(xì)胞部分 cell part;B4：細(xì)胞外基質(zhì) extracellular matrix;B5：細(xì)胞外基質(zhì)部分 extracellular matrix part;B6：細(xì)胞外區(qū)域 extracellular region;B7：細(xì)胞外區(qū)域部分 extracellular region part;B8：大分子復(fù)合物 macromolecular complex;B9：膜 membrane;B10：膜部分 membrane part;B11：膜封閉腔 membrane-enclosed lumen;B12：線粒體相關(guān)黏附復(fù)合體 mitochondrion-associated adherens complex;B13：類核 nucleoid;B14：細(xì)胞器 organelle;B15：細(xì)胞器的部分 organelle part;B16：共質(zhì)體 symplast;B17：突觸 synapse;B18：突觸部分 synapse part;B19病毒粒子 virion;B20：病毒粒子部分 virion part;C1：D-丙氨酰載體功能D-alanyl carrier activity;C2:抗氧化功能 antioxidant activity;C3：結(jié)合 binding;C4：催化功能 catalytic activity;C5：通道調(diào)節(jié)功能 channel regulator activity;C6：化學(xué)引誘物功能 chemoattractant activity;C7:化學(xué)排斥物功能 chemorepellent activity;C8:電子載體功能 electron carrier activity;C9：酶調(diào)節(jié)功能 enzyme regulator activity;C10：金屬伴侶功能 metallochaperone activity;C11：分子傳感器功能 molecular transducer activity;C12:成形素功能 morphogen activity;C13：核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子功能 nucleic acid binding transcription factor activity;C14：營養(yǎng)儲存功能 nutrient reservoir activity;C15：蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子功能 protein binding transcription factor activity;C16：蛋白質(zhì)標(biāo)記 protein tag;C17：受體功能 receptor activity;C18:受體調(diào)節(jié)功能 receptor regulator activity;C19：結(jié)構(gòu)分子功能 structural molecule activity;C20：翻譯調(diào)節(jié)功能 translation regulator activity;C21：運(yùn)輸功能 transporter activity。

A代表注釋到BP的條目，B代表注釋到CC的條目，C代表注釋到MF的條目。

A represents the term of BP, B represents the term of CC, and C represents the term of MF.

圖4 最多的20個CO條目分類

表5 海子水牛瘤胃微生物宏基因組中GH基因的分布

表6 不同動物的微生物宏基因組中GH基因的分布

此外，本試驗(yàn)還在海子水牛瘤胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)了42個黏連蛋白基因、236個對接蛋白基因以及82個S層同源結(jié)構(gòu)域，它們均是構(gòu)成纖維小體的組分。纖維小體是一種由木質(zhì)纖維素降解酶依靠腳手架蛋白形成的多酶復(fù)合體[19]，并借助黏附蛋白固定于細(xì)胞表面，可持續(xù)、高效地降解木質(zhì)纖維素。目前已在生黃瘤胃球菌和白色瘤胃球菌中發(fā)現(xiàn)了纖維小體[20]。Hess等[7]發(fā)現(xiàn)奶牛瘤胃中含有黏連蛋白和對接蛋白的基因分別為80和188個。

將海子水牛的瘤胃宏基因組與奶牛[7]和印度水牛的瘤胃[9]、白蟻后腸[11]及雞盲腸[12]宏基因組數(shù)據(jù)中的GH基因進(jìn)行分類比對，發(fā)現(xiàn)在不同的宏基因組中，寡糖降解酶比例均為最高。但與其他4種動物腸胃微生物宏基因組相比，海子水牛中的寡糖降解酶數(shù)量最少。海子水牛和奶牛瘤胃宏基因組中的纖維素酶、半纖維素酶和分支降解酶比例接近。印度水牛中的纖維素酶最少，但寡糖降解酶最多。海子水牛瘤胃中纖維素酶及寡糖降解酶的比例與印度水牛瘤胃存在許多不同，這可能與2種水牛飼糧中粗飼料與精飼料的比例有關(guān)，印度水牛飼糧中粗飼料與精飼料的比例為75∶25[9]，而海子水牛的則為85∶15，粗飼料含量高可能導(dǎo)致瘤胃內(nèi)存在高比例的纖維素酶和低比例的寡糖降解酶。但在GH基因家族分布中，2種水牛瘤胃中GH6、GH7、GH12、GH48及GH62家族基因數(shù)量均較少[8]。白蟻后腸微生物宏基因組中的纖維素酶和半纖維素酶基因最多，其中GH5(5.71%)和GH10(5.39%)家族的基因比例最高，主要是由于木材中纖維素及半纖維素的比例高于牧草。雞盲腸中的纖維素酶及半纖維素酶的比例最低，但寡糖降解酶比例較高。由此可見宿主基因型及飼料的不同可影響腸胃GH基因的組成。

AA：輔助氧化還原酶；CBM：碳水化合物結(jié)合模塊；CE：碳水化合物酯酶；GH：糖苷水解酶；GT：糖基轉(zhuǎn)移酶；PL：多糖裂合酶。

AA: auxiliary activityCBM: carbohydrate binding modules;CE: carbohydrate esterases;GH: glycosyl hydrolases;GT: glycosyl transferases;PL: polysaccharide lyases.

圖5CAZy數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果

Fig.5 Distribution of CAZyme encoding genes

4 結(jié) 論

① 通過高通量測序發(fā)現(xiàn)海子水牛瘤胃中含有多種木質(zhì)纖維素降解微生物，如生黃瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌及棲瘤胃普雷沃氏菌?？梢?，海子水牛瘤胃內(nèi)含有豐富的木質(zhì)纖維素降解微生物。

② 水牛瘤胃中還含有大量的糖苷水解酶基因，其中GH2、GH43、GH97、GH3家族的基因較多，且編碼蛋白質(zhì)具有寡糖降解酶活性的基因數(shù)量最多?？梢姡Ｗ铀Ａ鑫竷?nèi)含有豐富的木質(zhì)纖維素降解酶系。

[1] 鄧玉營,黃振興,阮文權(quán),等.木質(zhì)纖維素沼氣體系中共培養(yǎng)菌群形成及適應(yīng)性變化研究進(jìn)展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2016,22(5):944-958.

[2] WANG G R,DUAN Y L.Studies on lignocellulose degradation by rumen microorganism[J].Advanced Materials Research,2014,853:253-259.

[3] KIM M,MORRISON M,YU Z T.Status of the phylogenetic diversity census of ruminal microbiomes[J].FEMS Microbiology Ecology,2011,76(1):49-63.

[4] ZHOU J,BAO L,CHANG L,et al.Beta-xylosidase activity of a GH3 glucosidase/xylosidase from yak rumen metagenome promotes the enzymatic degradation of hemicellulosic xylans[J].Letters in Applied Microbiology,2012,54(2):79-87.

[5] HUANG H Q,WANG G Z,ZHAO Y Y,et al.Direct and efficient cloning of full-length genes from environmental DNA by RT-qPCR and modified TAIL-PCR[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2010,87(3):1141-1149.

[6] 王祿祿,王立志,周美麗.宏基因組學(xué)技術(shù)在反芻動物瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)上的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2017,29(2):223-228.

[7] HESS M,SCZYRBA A,EGAN R,et al.Metagenomic discovery of biomass-degrading genes and genomes from cow rumen[J].Science,2011,331(6016):463-467.

[8] PATEL D D,PATEL A K,PARMAR N R,et al.Microbial and carbohydrate active enzyme profile of buffalo rumen metagenome and their alteration in response to variation in the diet[J].Gene,2014,545(1):88-94.

[9] SINGH K M,REDDY B,PATEL D,et al.High potential source for biomass degradation enzyme discovery and environmental aspects revealed through metagenomics of Indian buffalo rumen[J].BioMed Research International,2014,2014:267189.

[10] 王繼文,王立志,閆天海,等.山羊瘤胃與糞便微生物多樣性[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2015,27(8):2559-2571.

[11] WARNECKE F,LUGINBüHL P,IVANOVA N,et al.Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite[J].Nature,2007,450(7169):560-565.

[12] QU A,BRULC J M,WILSON M K,et al.Comparative metagenomics reveals host specific metavirulomes and horizontal gene transfer elements in the chicken cecum microbiome[J].PLoS One,2008,3(8):e2945.

[13] JAMI E,MIZRAHI I.Composition and similarity of bovine rumen microbiota across individual animals[J].PLoS One,2012,7(3):e33306.

[14] FLINT H J,BAYER E A.Plant cell wall breakdown by anaerobic microorganisms from the mammalian digestive tract[J].Annals of the New York Academy of Sciences,2008,1125(1):280-288.

[15] FLINT H J,BAYER E A,RINCON M T,et al.Polysaccharide utilization by gut bacteria:potential for new insights from genomic analysis[J].Nature Reviews Microbiology,2008,6(2):121-131.

[16] ZHANG H M,LI J F,WANG J Q,et al.Determinants for the improved thermostability of a mesophilic family 11 xylanase predicted by computational methods[J].Biotechnology for Biofuels,2014,7(1):3.

[17] YADAV S,YADAV P K,YADAV D,et al.Pectin lyase:a review[J].Process Biochemistry,2009,44(1):1-10.

[18] NASCIMENTO A S,MUNIZ J R C,APARCIO R,et al.Insights into the structure and function of fungal β-mannosidases from glycoside hydrolase family 2 based on multiple crystal structures of theTrichodermaharzianumenzyme[J].FEBS Journal,2014,281(18):4165-4178.

[19] HYEON J E,JEON S D,HAN S O.Cellulosome-based,Clostridium-derived multi-functional enzyme complexes for advanced biotechnology tool development:advances and applications[J].Biotechnology Advances,2013,31(6):936-944.

[20] DASSA B,BOROVOK I,RUIMY-ISRAELI V,et al.Rumen cellulosomics:divergent fiber-degrading strategies revealed by comparative genome-wide analysis of six Ruminococcal strains[J].PLoS One,2014,9(7):e99221.

*Corresponding author, professor, E-mail: yzp@yzu.edu.cn

MetagenomicAnalysisofMicroorganismsinRumenofHaiziBuffalo

ZHANG Huimin XIA Hailei HUANG Qiang XU Xin MAO Yongjiang CEN Ning YANG Zhangping*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

In order to investigate microorganism composition and lignocellulolytic enzymes in rumen ofHaizibuffalo, rumen fluid sample ofHaizibuffalo (about 2.5 years of age, average body weight was 493 kg) was surveyed using metagenomic high-throughput sequencing. The results showed as follws: a total of 77 283 638 reads were obtained, which were assembled into 744 712 scaffolds. And then, a total of 827 044 genes were predicted by prodigal analysis. Many microorganisms involved in lignocellulose degradation were identified by gene annotation, such asRuminococcusflavefaciens,Ruminococcusalbus,FibrobactersuccinogenesandPrevotellaruminicola. We identified potential 38 011 genes encoding lignocellulolytic enzymes including glycoside hydrolase (GH) (17 877 genes), glycosyl transferase (GT) (8 637 genes), carbohydrate binding module (CBM) (4 693 genes), carbohydrate esterase (CE) (4 214 genes), polysaccharide lyase (PE) (1 296 genes), and auxiliary activity (AA) (934 genes). AmongGHgenes, most genes belonged toGH2,GH43,GH97 andGH3 families, and a higher abundance of oligosaccharide degrading enzymes in buffalo rumen metagenome was identified. Besides that, we also predicted that some genes could encode the cellulosome component. Compared withGHgenes in the gastrointestinal metagenome of other species, the proportions of cellulose, hemicellulase and debranching enzyme were similar betweenHaizibuffalo and dairy cow. These results demonstrate that buffalo rumen is considerably enriched in functional microorganisms and enzymes involved in lignocellulose degradation with great prospects to obtain enzyme genes that may be applied in the industry.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(11)：4151-4161]

Haizibuffalo; rumen; metagenome; microorganism; lignocellulolytic enzyme

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.11.039

S823

A

1006-267X(2017)11-4151-11

2017-05-04

國家自然科學(xué)基金青年基金(31702142)；江蘇省自然科學(xué)基金青年基金(BK20160455)；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目資助(15KJB230004)；揚(yáng)州大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金資助(x20160673)

張慧敏(1986—)，女，山東濰坊人，講師，博士研究生，從事反芻動物飼料酶制劑研究。E-mail： minmin-911@163.com

*通信作者:楊章平，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: yzp@yzu.edu.cn

(責(zé)任編輯 王智航)