苗淑彥 朱錦裕 趙臣澤 董小敬 孫龍生

(揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009)

豆粕替代魚粉對烏鱧腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶好氧菌組成及產(chǎn)蛋白酶能力的影響

苗淑彥 朱錦裕 趙臣澤 董小敬 孫龍生

(揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009)

本試驗通過對烏鱧腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶好氧菌株進行分離和培養(yǎng)，并測定其產(chǎn)蛋白酶能力，來評價豆粕替代魚粉對烏鱧腸道好氧菌組成及產(chǎn)蛋白酶能力的影響。首先配制以脫脂魚粉為主要蛋白質(zhì)源的對照組(D1組)飼料，飼料中魚粉添加量為55%；然后用豆粕替代對照組飼料中不同比例的魚粉，配制2種試驗組飼料，飼料中豆粕添加量分別為35%(D2組)和75%(D3組)。上述3種試驗飼料分別投喂平均體重為(10.50±0.84) g的烏鱧幼魚8周，每種試驗飼料投喂3個重復，每個重復28尾魚，試驗在室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行。結(jié)果顯示：隨著豆粕替代魚粉比例的增加，烏鱧的終末體重、增重率和特定生長率顯著降低(P<0.05)。從3組烏鱧腸道內(nèi)共分離出21株產(chǎn)蛋白酶好氧菌，其中，D1組為16株，D2組為19株，D3組為20株。以水解圈直徑與菌株直徑之比值(R/r值)表示產(chǎn)蛋白酶能力，豆粕替代魚粉顯著降低了菌株P1004和P1018的R/r值(P<0.05)，但顯著增加了菌株P1009和P1012的R/r值(P<0.05)。隨著豆粕替代魚粉比例的增加，菌株P1018的R/r值顯著下降(P<0.05)。對產(chǎn)蛋白酶能力最大的菌株P1009進行生理生化特征鑒定和16S rDNA序列分析，得出菌株P1009為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。本試驗結(jié)果表明，烏鱧腸道內(nèi)存在著豐富的產(chǎn)蛋白酶好氧菌，豆粕替代魚粉對烏鱧腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶好氧菌數(shù)量和產(chǎn)蛋白酶能力產(chǎn)生了一定影響，烏鱧腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶能力最強的菌株P1009是銅綠假單胞菌，可以考慮將其作為益生菌開發(fā)的潛在菌種。

烏鱧；蛋白質(zhì)源；產(chǎn)蛋白酶好氧菌；產(chǎn)蛋白酶能力；益生菌

此外，消化道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)對食物具有可塑性，易受飼料營養(yǎng)成分的影響[8-11]。鐘蕾等[12]通過聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)指紋分析并結(jié)合克隆、測序，對鳡(Elopichthysbambusa)的腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用配合飼料和冰鮮魚飼喂的鳡腸道內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展使得對魚粉的需求量急劇上升，但由于過度捕撈、環(huán)境污染及厄爾尼諾現(xiàn)象等不良氣候的影響，野生魚粉資源日益減少，世界魚粉的供應已不能滿足養(yǎng)殖需求。減少水產(chǎn)飼料中魚粉的添加量，從而降低水產(chǎn)飼料對魚粉資源的依賴，是緩解魚粉資源壓力的有效措施之一。在對魚粉替代蛋白質(zhì)源的研究中，由于豆粕具有蛋白質(zhì)含量高、消化率高和氨基酸平衡等特點，被作為水產(chǎn)飼料中適宜的植物蛋白質(zhì)源。本研究通過對烏鱧(Channaargus)腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶好氧菌株的培養(yǎng)，并測定其產(chǎn)蛋白酶的能力，來評價不同蛋白質(zhì)源(全魚粉和豆粕替代部分魚粉)對烏鱧腸道好氧菌組成及產(chǎn)蛋白酶能力的影響，為進一步完善烏鱧腸道微生態(tài)營養(yǎng)理論提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1試驗飼料配方和制作

對照組(D1組)飼料蛋白質(zhì)源為脫脂魚粉，添加量為55%。在對照組飼料的基礎上，用豆粕替代不同比例的魚粉配制2種試驗組飼料，飼料中豆粕添加量分別為35%(D2組)和75%(D3組)。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。配制飼料前，所有原料過80目篩，混勻，然后添加魚油和大豆卵磷脂充分混合，加水混勻后在螺桿擠壓機中制成3.0 mm×4.0 mm的顆粒，50 ℃烘箱內(nèi)干燥后置-20 ℃冰箱保存。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

1)維生素預混料為每千克飼料提供Vitamin premix provided the following per kg of diets：VA 32 mg，VD 5 mg，VE 240 mg，VK 10 mg，VB125 mg，VB245 mg，煙酸 nicotinic acid 200 mg，VB620 mg，生物素 biotin 60 mg，肌醇 inositol 800 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 60 mg，葉酸 folic acid 20 mg，VB1210 mg，VC 2 000 mg，微晶纖維素microcrystalline cellulose 4 292.54 mg。

2)礦物質(zhì)預混料為每千克飼料提供Mineral premix provided the following per kg of diets：CuSO4·5H2O 10 mg，Na2SeO320 mg，MnSO4·H2O 45 mg，CoCl2·6H2O (1%) 50 mg，ZnSO4·H2O 50 mg，Ca(IO3)2(1%) 60 mg，F(xiàn)eSO4·H2O 80 mg，MgSO4·7H2O 1 200 mg，沸石粉 zeolite powder 18 485 mg。

1.2試驗用魚及養(yǎng)殖管理

試驗用烏鱧幼魚購自江蘇省揚州市高郵董氏特種魚類養(yǎng)殖場，為當年人工培育的同一批種苗，大小均勻、健康無病。養(yǎng)殖試驗在揚州大學水產(chǎn)養(yǎng)殖溫室內(nèi)進行，養(yǎng)殖容器為300 L的玻璃鋼桶，桶內(nèi)水流速度為2 L/min。試驗前投喂商業(yè)飼料(粗蛋白質(zhì)含量為45%)，暫養(yǎng)2周以適應環(huán)境。試驗開始前禁食24 h，然后選擇體重[(10.50±0.84) g]相近、體格健壯的烏鱧幼魚，隨機分為3組，每組設3個重復，每個重復放養(yǎng)28尾魚。每天人工投喂2次(08:00和17:00)試驗飼料，每日觀察攝食情況并記錄，調(diào)整飼料投喂達飽食水平，試驗周期為8周。在養(yǎng)殖期間，每周檢測2次水質(zhì)指標，水溫為(27.5±1.5) ℃，pH為6.7～6.9，溶解氧濃度為5.5～6.5 mg/L，氨氮濃度為0.037～0.072 mg/L、亞硝酸氮濃度為0.014～0.031 mg/L。

1.3樣品收集及指標測定

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，烏鱧試驗魚禁食24 h后取樣。所有試驗魚在取樣前要用MS-222(100 mg/kg)麻醉，以減少取樣操作對魚體產(chǎn)生的應激。逐尾魚稱重，計算增重率(WGR)和特定生長率(SGR)；計數(shù)每桶的魚尾數(shù)，計算成活率(SR)。

計算公式如下：

隨后，每桶隨機取10尾魚，用75%乙醇棉球擦拭魚體表面以減少細菌污染，用無菌手術剪和手術刀進行解剖。取出腸道后，用滅菌棉線將腸道兩端扎緊，置于離心管中，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)。為保證試驗數(shù)據(jù)的可靠性，10尾魚的腸道置于同一個離心管中，并進行3次重復試驗。

好氧菌的培養(yǎng)：使用無菌手提式勻漿機勻漿腸黏膜，并用滅菌PBS按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的梯度對勻漿液進行稀釋后混勻；取不同梯度的稀釋液各50 μL，分別涂布于淡水魚類培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術有限公司產(chǎn)品，配方如下：蛋白胨5.0 g，牛肉膏2.5 g，酵母膏2.5 g，葡萄糖1.0 g，氯化鈉15.0 g，硫酸鎂0.05 g，磷酸氫二鉀0.2 g，瓊脂15.0 g，pH 7.2～7.4)上，每個樣品做3個平行。30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù)，并用接種環(huán)依此挑取不同大小、不同顏色和不同形狀的單個菌落在培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)。30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，選取純化菌落，接種于淡水魚類培養(yǎng)基中，置于搖床(200 r/min)30 ℃擴大培養(yǎng)18 h。各菌液分別取1 mL置于無菌離心管內(nèi)，與40%甘油按1∶1比例混合后保存于-20 ℃冰箱，待提取DNA用于菌株鑒定。

產(chǎn)蛋白酶好氧菌株的篩選及產(chǎn)蛋白酶能力的測定：將純化的菌液稀釋至10-7，混勻后取50 μL 涂布于蛋白酶篩選培養(yǎng)基(配方如下：干酪素10.0 g，Na2HPO22.0 g，MgSO40.5 g，NaCl 0.20 g，L-酪氨酸0.05 g，牛肉浸膏3.0 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 8.0，121 ℃滅菌20 min)中，每個樣品設5個平行，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落周圍有無水解圈，測量產(chǎn)蛋白酶菌株的直徑(r，cm)和對應的水解圈直徑(R，cm)，用水解圈直徑與菌株直徑之比值(R/r值)表示產(chǎn)蛋白酶能力的大小。

產(chǎn)蛋白酶好氧菌株的鑒定：參照《伯杰細菌鑒定手冊》(第8版)對菌株進行細菌形態(tài)觀察和生理生化鑒定。

16S rDNA鑒定方法如下：釆用天根公司細菌基因組提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)按試驗操作提取目標菌株DNA。以DNA為模板，采用通用引物擴增其16S rDNA片段，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′；反向引物為1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反應體系中含ddH2O 21 μL，Mix 25 μL，正向、反向引物各1 μL，DNA模板2 μL。PCR擴增條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循環(huán)35次；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物由華大基因公司測序。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用平均值±標準誤(mean±SE)的形式表示，顯著水平為P<0.05。當差異顯著時采用Tukey’s多重比較分析組內(nèi)和組間的差異顯著性。

2 結(jié) 果

2.1豆粕替代魚粉對烏鱧生長性能的影響

由表2可知，D1組烏鱧的終末體重、增重率和特定生長率顯著高于D2和D3組(P<0.05)，D2組烏鱧的終末體重、增重率和特定生長率又顯著高于D3組(P<0.05)。D1、D2和D3組烏鱧的成活率分別為88.00%、86.67%和88.00%，豆粕替代不同比例魚粉對烏鱧的成活率沒有產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

同列數(shù)據(jù)肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表3同。

In the same column, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as Table 3.

2.2豆粕替代魚粉對烏鱧腸道產(chǎn)蛋白酶好氧菌數(shù)量的影響

通過對各組烏鱧腸道菌群進行培養(yǎng)，共分離出21株具有產(chǎn)蛋白酶能力的好氧菌。其中，D1組為16株，D2組為19株，D3組為20株，菌株編號見表3。其中，D1組未檢出的菌株為P1003、P1006、P1015、P1016和P1020，D2組未檢出的菌株為P1002和P1020，D3組未檢出的菌株為P1002。

在菌株篩選的基礎上，對每株好氧菌的產(chǎn)蛋白酶能力進行測定，測定結(jié)果用R/r值表示，結(jié)果見表3。統(tǒng)計分析表明，同組內(nèi)不同菌株間的R/r值存在顯著差異(P<0.05)。D1組內(nèi)產(chǎn)蛋白酶能力較強的菌株為P1007、P1008和P1009，D2和D3組內(nèi)產(chǎn)蛋白酶能力較強的菌株為P1009和P1012。其中，P1009菌株在3組內(nèi)的產(chǎn)蛋白酶能力均最強，3組中該菌株的R/r值分別為2.91、3.22和3.15；D1組內(nèi)產(chǎn)蛋白酶能力較弱的菌株包括P1002、P1010、P1014和P1019，D2組內(nèi)產(chǎn)蛋白酶能力較弱的菌株包括P1003、P1010和P1014，D3組內(nèi)產(chǎn)蛋白酶能力較弱的菌株包括P1003、P1014和P1019。

表3 分離自烏鱧腸道的產(chǎn)蛋白酶好氧菌株及其產(chǎn)蛋白酶能力

續(xù)表3菌株編號No.ofstrainsR/r值R/rvalueD1組D1groupD2組D2groupD3組D3groupP10111.95±0.06bc1.77±0.11cd1.73±0.09cP10122.44±0.20de2.92±0.16i2.94±0.14gP10132.16±0.13cd2.29±0.09f2.18±0.02eP10141.32±0.12a1.26+0.11a1.31±0.07aP1015—2.52±0.02g2.59±0.09fP1016—1.99±0.14d1.96±0.09cdP10172.01±0.05c1.86±0.10d1.90±0.06cdP10182.19±0.09d1.95±0.04d1.84±0.06cP10191.46±0.10a1.46±0.06b1.42±0.11abP1020——1.62±0.07bP10212.22±0.50d1.97±0.13e2.03±0.08d

2.3豆粕替代魚粉對烏鱧腸道產(chǎn)蛋白酶好氧菌產(chǎn)蛋白酶能力的影響

篩選肉眼可見明顯水解圈，且水解圈界限明顯可辨的菌株進行產(chǎn)蛋白酶能力比較。由表4可知，豆粕替代魚粉顯著降低了菌株P1004和P1018

的產(chǎn)蛋白酶能力(P<0.05)，但顯著增加了菌株P1009和P1012的產(chǎn)蛋白酶能力(P<0.05)；另外，隨著豆粕替代魚粉比例的增加，菌株P1018的產(chǎn)蛋白酶能力顯著下降(P<0.05)。

表4 豆粕替代魚粉對烏鱧腸道產(chǎn)蛋白酶好氧菌產(chǎn)蛋白酶能力的影響

同行數(shù)據(jù)肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.4產(chǎn)蛋白酶能力最強菌株P1009的鑒定

用淡水魚類培養(yǎng)基進行培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，菌株P1009的菌落較小，中央隆起，且為革蘭氏染色陰性菌。其生理生化特征如表5所示，精氨酸雙水解酶試驗、氧化酶試驗、葡萄糖發(fā)酵試驗和枸櫞酸鹽是驗結(jié)果均為陽性，而氧化酶試驗和麥芽糖酶試驗結(jié)果均為陰性。對菌株P1009進一步進行16S rDNA序列分析鑒定，結(jié)果表明菌株P1009為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。

3 討 論

魚粉具有高蛋白質(zhì)，富含必需氨基酸、脂肪酸和未知生長因子，適口性好以及較好的消化率等優(yōu)點，一直以來被作為水產(chǎn)飼料中的主要蛋白質(zhì)源。在本研究中，全魚粉對照組(D1組)烏鱧的增重率和特定生長率顯著高于豆粕替代組(D2組、D3組)，充分說明魚粉是水產(chǎn)飼料的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)源[13]。當豆粕替代不同比例魚粉，使得飼料中豆粕添加量分別為35%和75%時，烏鱧的生長受到了顯著影響，這可能與大豆中含有的某些營養(yǎng)拮抗因子，比如大豆凝集素、胰蛋白酶抑制因子、皂角甙等有關[14]。

表5 菌株P1009生理生化特征鑒定結(jié)果

“+”表示陽性，“-”表示陰性。

“+” means positive, and “-” means negative.

利用高通量測序技術發(fā)現(xiàn)，脊椎動物消化道內(nèi)存在大量的微生物。以人體為例，結(jié)腸內(nèi)聚積著10倍于人體細胞數(shù)、100倍于人體基因組的細菌，種類達到1 150種之多[15]，這些細菌在腸道內(nèi)構(gòu)成了復雜的微生態(tài)系統(tǒng)[16]。消化道菌群與宿主和消化道環(huán)境(如飼料或食物及生境)三者之間構(gòu)成了相互作用與相互依賴的“三角”關系，參與動物飼料消化、營養(yǎng)吸收、能量代謝的過程[2-3,17]。本試驗通過對烏鱧腸道內(nèi)的好氧菌進行培養(yǎng)，共篩選出21株具有產(chǎn)蛋白酶能力的好氧菌株。王建建等[18]通過對野生和養(yǎng)殖銀鯧(Pampusargenteus)消化道內(nèi)產(chǎn)酶菌進行分析，結(jié)果表明，野生銀鯧消化道內(nèi)分離到16株產(chǎn)酶菌，其中44%可培養(yǎng)菌能產(chǎn)蛋白酶，養(yǎng)殖銀鯧消化道內(nèi)分離到22株產(chǎn)酶菌，其中70%可培養(yǎng)菌可產(chǎn)蛋白酶。楊亞東等[19]用培養(yǎng)法對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)腸道內(nèi)的微生物進行培養(yǎng)，共獲得27株產(chǎn)蛋白酶的菌株。以上結(jié)果說明，動物腸道內(nèi)的微生物具有分泌消化酶的功能，能協(xié)助宿主對營養(yǎng)物質(zhì)進行消化吸收，從而提高宿主對飼料的利用率[20]。

Ray等[21]研究發(fā)現(xiàn)，生長在同一環(huán)境下攝食不同食物的卡特拉(Catlacatla)、印度鯪(Cirrhinusmrigala)和南亞野鯪(Labeorohita)消化道菌群所產(chǎn)酶的種類和活性不同，這也證明了魚類消化道菌群結(jié)構(gòu)隨食物的改變而發(fā)生“結(jié)構(gòu)—功能”的變化。本研究中，用豆粕替代不同比例魚粉后，烏鱧腸道產(chǎn)蛋白酶好氧菌株的種類和數(shù)量發(fā)生了變化。例如，D2和D3組烏鱧未檢測出菌株P1002，D1組烏鱧未檢測出菌株P1003、P1006、P1015和P1016，而D1和D2組烏鱧未檢測出菌株P1020。同時，部分菌株的產(chǎn)蛋白酶能力也受到了顯著的影響，豆粕替代魚粉有助于提高菌株P1009和P1012的產(chǎn)蛋白酶能力。對其他魚類的研究也證明，飼料蛋白質(zhì)的來源顯著影響腸道菌群結(jié)構(gòu)。例如，用豆粕替代金頭鯛(SparusaurataL.)飼料中30%的魚粉，其腸道中藍藻和乳桿菌數(shù)量顯著增加，但Synergistetes數(shù)量顯著下降[22]。Gajardo等[23]用不同種類的植物性蛋白質(zhì)源替代魚粉飼喂大西洋鮭(SalmosalarL.)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全魚粉對照組的大西洋鮭腸道內(nèi)含有較多的桿菌屬、鏈球菌屬、梭菌屬和鯨桿菌屬，以上結(jié)果可能與微生物生長所需營養(yǎng)成分有關，由于植物性蛋白質(zhì)源中含有更多的難以消化的纖維和低分子低聚糖，因此也更利于以此為代謝底物的乳酸菌等微生物的生長[24-25]。

益生菌是一類具有巨大實用價值的生物工程產(chǎn)品，常見水產(chǎn)益生菌的種類主要有乳酸菌和芽孢桿菌等，其中應用最廣泛的是能產(chǎn)生蛋白酶的芽孢桿菌，其在促進養(yǎng)殖動物生長、增強抗病力、改善水體環(huán)境等方面具有重要作用。另外，從養(yǎng)殖動物腸道內(nèi)分離出的其他菌種也可以作為潛在益生菌進行開發(fā)利用。在本研究中，從烏鱧腸道內(nèi)篩選的銅綠假單胞菌具有較高的產(chǎn)蛋白酶能力。Chythanya等[26]研究了銅綠假單胞菌胞外產(chǎn)物對哈維氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、河弧菌(V.fluvialis)等對蝦致病菌的抑菌效果，確定了銅綠假單胞菌對這些病原菌的抑菌作用。Vijayan等[27]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌能有效抑制弧菌和氣單胞菌。鑒于銅綠假單胞菌在蛋白酶分泌和抑菌方面的重要功能，可以考慮將其作為益生菌開發(fā)的潛在菌種。同時，考慮到豆粕替代魚粉后對烏鱧腸道內(nèi)的產(chǎn)蛋白酶菌株及其產(chǎn)蛋白酶能力均產(chǎn)生了一定變化，因此在開發(fā)益生菌的同時，應考慮到飼料原料的影響，以期能最大程度地發(fā)揮益生菌的重要功能。需要注意的是，部分產(chǎn)蛋白酶菌株，如蜂窩哈夫尼亞菌和維氏氣單胞菌，均屬于條件致病菌[28-29]。

據(jù)估計，脊椎動物消化道內(nèi)可被鑒定的微生物僅占10%，而能在實驗室條件下進行培養(yǎng)的微生物僅占1%[30-31]。對淡水魚如神仙魚(Pterophyllumscalare)和眼斑星麗魚(Astronotusocellatus)以及海水魚如漠斑牙鲆(Paralichthyslethostigma)進行的研究也發(fā)現(xiàn)，消化道厭氧菌在魚類營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收過程中發(fā)揮重要的作用，這些厭氧菌能夠提供多種不同的酶，包括糖酶、磷酸酶、脂肪酶以及蛋白酶等，從而幫助魚類對營養(yǎng)物質(zhì)進行消化和吸收[32]。因此，本試驗采用基礎培養(yǎng)試驗的方法對烏鱧腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶菌株進行分析，本身存在一定的局限性。另外，由于本試驗僅采用淡水魚類培養(yǎng)基進行產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選，可能會導致某些可培養(yǎng)菌無法正常生長。因此，對烏鱧腸道益生菌的開發(fā)還需依賴菌株培養(yǎng)方法和試驗手段的進一步提高。

4 結(jié) 論

① 烏鱧腸道內(nèi)存在著豐富的產(chǎn)蛋白酶好氧菌，這些好氧菌的產(chǎn)蛋白酶能力存在一定的差異。其中，菌株P1009、P1008、P1007、P1012和P1015的產(chǎn)蛋白酶能力較強，R/r值為2.44～3.22。

② 豆粕替代魚粉顯著降低了菌株P1004和P1018的產(chǎn)蛋白酶能力，但顯著增加了菌株P1009和P1012的產(chǎn)蛋白酶能力。隨著豆粕替代魚粉比例的增加，菌株P1018的產(chǎn)蛋白酶能力顯著下降，該結(jié)果說明了消化道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)對食物具有可塑性。

③ 通過16S rDNA序列分析鑒定表明產(chǎn)蛋白酶能力最強的菌株P1009是銅綠假單胞菌，結(jié)合銅綠假單胞菌的特性，可以考慮將其作為益生菌開發(fā)的潛在菌種。

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Author, MIAO Shuyan, professor, E-mail: shuyanmiao@126.com

EffectsofReplacementofFishMealbySoybeanMealonCompositionandProtease-ProducingActivityofProtease-ProducingAerobicBacteriainIntestinalTractofChannaargus

MIAO Shuyan ZHU Jinyu ZHAO Chenze DONG Xiaojing SUN Longsheng

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

In order to investigate the effects of replacement of fish meal by soybean meal on composition and protease-producing activity of protease-producing aerobic bacteria in intestinal tract ofChannaargus, the protease producing bacteria in intestinal tract ofChannaarguswere isolated and cultured. The selected strains were further quantitatively assayed for the protease-producing activity. One control group (D1group) diet was formulated with defatted fish meal as the main protein source, and the defatted fish meal addition in this diet was 55%. Next then, two experimental group diets were formulated using soybean meal to replace different ratio of fish meal in control group diet, and the soybean meal in those two diets was 35% (D2group) and 75% (D3group), respectively. Each diet was assigned to three replicates of 28Channaarguswith the average body weight of (10.50±0.84) g for 8 weeks in a re-circulated water system indoor. The results showed as follows: The final weight, weight gain rate and specific growth rate was significantly decreased with the replacement ratio of fish meal by soybean meal increasing (P<0.05). A total of 21 protease-producing aerobic bacteria were isolated from the intestine ofChannaargus, which was 16 from D1group, 19 from D2group and 20 from D3group. The replacement of fish meal by soybean meal significantly decreased the hydrolysis spot diameter (R)/strain diameter (r) value of strains P1004 and P1018 (P<0.05), which was used to express the protease-producing activity, but significantly increased the R/r value of strains P1009 and P1012 (P<0.05). With the replacement ratio of fish meal by soybean meal increasing, the R/r value of strain P1018 was significantly decreased (P<0.05). Physiological and biochemical characteristics identification and 16S rDNA sequence analysis revealed that the strain P1009, whose protease-producing activity was the highest in the present study, wasPseudomonasaeruginosa. In summary, the results indicate that there exist a great variety of protease-producing aerobic bacteria in intestinal tract ofChannaargus, and the replacement of fish meal by soybean meal can affect both the quantity and protease-producing activity of protease-producing bacteria. Strain P1009 which from the intestinal tract ofChannaargushas the highest protease-producing activity, and it can be as a potential source of probiotics.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(11)：4076-4084]

Channaargus; protein source; protease-producing aerobic bacteria; protease-producing activity; probiotics

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.11.029

S963

A

1006-267X(2017)11-4076-09

2017-04-10

國家自然科學基金(31402306)；江蘇省博士后科研資助計劃(1601058B)

苗淑彥(1978—)，女，江蘇揚州人，副教授，博士,主要從事水生動物營養(yǎng)與飼料研究。E-mail： shuyanmiao@126.com

(責任編輯 菅景穎)