楊桂芹 楊 航 劉吉喆 劉海英 董維國(guó) 朱 鑫

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866)

大豆低聚糖及其功能組分對(duì)體外條件下肉仔雞盲腸內(nèi)容物糞臭素產(chǎn)量及菌群組成的影響

楊桂芹 楊 航 劉吉喆 劉海英 董維國(guó) 朱 鑫

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866)

本試驗(yàn)旨在研究大豆低聚糖(SBO)及其功能組分對(duì)體外條件下肉仔雞盲腸內(nèi)容物糞臭素產(chǎn)量及菌群組成的影響。試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，以42日齡肉仔雞盲腸內(nèi)容物為菌源，將厭氧培養(yǎng)液分裝于無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，分成5個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)。對(duì)照組添加250 μmol/L的L-色氨酸，蔗糖(SUC)、水蘇糖(STA)、棉籽糖(RAF)和SBO組分別在對(duì)照組的基礎(chǔ)上添加1%的SUC、STA、RAF和SBO。另外，每組均設(shè)1個(gè)不加L-色氨酸但其他成分都相同的空白對(duì)照。利用ANKOM RFS 體外產(chǎn)氣系統(tǒng)，39 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。采用PCR-變性梯度膠凝電泳(DGGE)技術(shù)研究了發(fā)酵液菌群組成的差異。結(jié)果表明：1)SUC、STA、SBO組24 h發(fā)酵液累積產(chǎn)氣量極顯著高于對(duì)照組和RAF組(P<0.01)；SBO、SUC和STA組吲哚濃度分別比對(duì)照組降低了98.15%、97.72%和94.17%(P<0.01)，糞臭素濃度分別比對(duì)照組降低了79.04%、71.88%和70.28%(P<0.05)；SUC組乳酸濃度極顯著高于其他各組(P<0.01)；對(duì)照組pH極顯著高于除RAF組之外的其他各組(P<0.01)。2)SBO組菌群均勻度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；SUC、STA、RAF、SBO組菌群豐富度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；SBO、STA、RAF組菌群相似性高于對(duì)照組；試驗(yàn)組有3條特異性條帶，相似菌分別為延長(zhǎng)布勞特氏菌(Blautiaproducta)、迪氏副擬桿菌(Parabacteroidesdistasonis)、路氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)。綜上，在本試驗(yàn)條件下，添加1%的SUC、STA和SBO顯著降低了肉仔雞體外盲腸內(nèi)容物培養(yǎng)液中L-色氨酸代謝生成吲哚和糞臭素的濃度，提高了菌群豐富度，并促進(jìn)了特異性菌的增殖。降低糞臭素效果優(yōu)劣依次為SBO、SUC、STA。

糞臭素；大豆低聚糖；盲腸菌群；體外發(fā)酵；肉仔雞

我國(guó)肉雞業(yè)發(fā)展迅速且規(guī)模不斷擴(kuò)大，與此同時(shí)，雞場(chǎng)排出的大量糞便所產(chǎn)生的臭氣對(duì)環(huán)境的污染也不斷加劇。通過(guò)營(yíng)養(yǎng)學(xué)技術(shù)從根源上減少養(yǎng)雞業(yè)的臭氣污染，越來(lái)越引起人們的廣泛關(guān)注[1]，對(duì)促進(jìn)肉雞業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展和探索環(huán)境友好型畜牧業(yè)具有重要科學(xué)意義。糞臭素是微生物降解L-色氨酸(L-tryptophan，L-Try)的代謝產(chǎn)物，是引起豬雞排泄物產(chǎn)生惡臭的主要物質(zhì)之一[2-3]。研究表明，L-Try的可利用度和腸道微生物的組成和活力是影響動(dòng)物腸道糞臭素濃度的主要因素[4]。肉仔雞盲腸糞臭素濃度顯著高于回腸和直腸，其濃度差異主要與腸道菌群多樣性和豐富度有關(guān)[5]。大豆低聚糖(SBO)是以大豆及其加工副產(chǎn)品為原料生產(chǎn)的、含有一定量的水蘇糖(STA)、棉籽糖(RAF)和蔗糖(SUC)等低聚糖的產(chǎn)品(GB/T 22491—2008)。一般75%的SBO中，含18%STA、6%RAF、24%SUC[6]。Coon等[7]報(bào)道，火雞對(duì)RAF和STA的回腸消化率不足1%，但排泄物消化率高達(dá)84%～90%，進(jìn)一步說(shuō)明了SBO及其功能組分主要在禽類后腸道被微生物利用。Li等[8]研究了不同纖維源在豬直腸菌群作用下對(duì)L-Try體外代謝的影響，結(jié)果表明體外培養(yǎng)體系中糞臭素的產(chǎn)生受到直腸微生物組成的影響，而后者與纖維物質(zhì)的來(lái)源密切相關(guān)。盛清凱等[9]研究表明，外源L-Try是豬糞體外發(fā)酵液中色氨酸和糞臭素的主要影響因素。本課題組前期研究表明，飼糧添加SBO顯著降低了42日齡肉仔雞排泄物吲哚和糞臭素的濃度[10]，顯著降低了在肉仔雞盲腸和直腸菌群作用下L-Try代謝生成糞臭素的濃度[11]，但何種單一聚合度(單體組分)的SBO在其中起主要作用還不完全清楚，其作用機(jī)制也有待于進(jìn)一步闡明。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料及樣品采集

試驗(yàn)用的SBO、SUC、RAF、STA均為市售商品低聚糖，由河南某生物科技有限公司生產(chǎn)。采用蒽酮比色法[12]，實(shí)測(cè)SBO、SUC、RAF、STA的總糖含量分別為76.10%、64.53%、68.21%和88.07%。愛(ài)拔益加(AA)肉仔雞飼養(yǎng)至42日齡時(shí)，選取30只健康雞只(飼喂玉米-豆粕型無(wú)抗生素飼糧，公母各占1/2)，平均體重為2.75 kg；宰殺，剖開(kāi)腹腔，分離盲腸，用細(xì)線結(jié)扎，剪下，裝入事先準(zhǔn)備好的自封袋中，稱重(每只雞6～7 g盲腸內(nèi)容物)，迅速置-80 ℃冰箱備用。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別設(shè)SUC、STA、RAF、SBO和對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)。對(duì)照組添加250 μmol/L的L-Try，SUC、STA、RAF和SBO組分別在對(duì)照組的基礎(chǔ)上添加3.10 g SUC、2.27 g STA、2.93 g RAF、2.63 g SBO(以總糖含量計(jì)為1%)，體外培養(yǎng)液體積為200 mL。另外，考慮到不同底物原料蛋白質(zhì)含量的差異，每組均設(shè)1個(gè)不加L-Try但其他成分都相同的空白對(duì)照，其結(jié)果用于對(duì)吲哚和糞臭素濃度的校正。

1.3體外培養(yǎng)液的配制及發(fā)酵

參照Yokoyama等[13]的方法，配制基礎(chǔ)培養(yǎng)液。調(diào)整pH至5.7±0.3(雞的盲腸內(nèi)容物pH為5.7)；然后，在1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓、121 ℃條件下滅菌15 min[14]；將盲腸內(nèi)容物從-80 ℃冰箱取出，置超凈工作臺(tái)解凍，按照公、母肉雞盲腸內(nèi)容物樣品1∶1混合后，稱取30 g懸浮于3 L無(wú)菌厭氧培養(yǎng)液中。充分?jǐn)嚢韬笥?層紗布過(guò)濾以除去粗微粒物質(zhì)，并將濾液分裝到ANKOM RFS無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，每瓶198 mL，操作全程開(kāi)通CO2以保證菌群的活性。在各組培養(yǎng)液中添加2 mL 5.1 mg/mL的L-Try(L-Try添加終濃度為250 μmol/L)，試驗(yàn)組再分別添加1%的SUC、STA、RAF和SBO，空白對(duì)照添加2 mL的無(wú)菌蒸餾水，充分振蕩混勻。將培養(yǎng)瓶中通滿CO2，蓋上產(chǎn)氣系統(tǒng)的密封蓋并擰緊，放入39 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，厭氧培養(yǎng)24 h。用帶蓋離心管留取部分發(fā)酵液分別至-20和-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4發(fā)酵液產(chǎn)氣量、糞臭素濃度和發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

1.4.1 產(chǎn)氣量

ANKOM RFS體外產(chǎn)氣系統(tǒng)能自動(dòng)檢測(cè)產(chǎn)氣瓶中產(chǎn)生的氣體，并且記錄氣壓信息。根據(jù)公式，將氣壓信息換算成產(chǎn)生氣體的體積(mL)。

Vxt=Vj×(Ppsit-Ppsi0)×0.068。

式中：Vxt為t(h)時(shí)刻產(chǎn)生氣體的體積(mL)；Vj為模塊瓶?jī)?nèi)液面上部空間的體積(mL)；Ppsit為t(h)時(shí)刻樣本模塊瓶GPM軟件記錄的累積壓力(psi,1 psi=6.895 kPa)；Ppsi0為t(h)時(shí)刻空白模塊瓶GPM軟件記錄的累積壓力(psi)。

1.4.2 pH

厭氧培養(yǎng)結(jié)束后，用校正的pHS-3C型pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH。

1.4.3 吲哚和糞臭素濃度

參照文獻(xiàn)[11]的方法，用Agilen-1100型高效液相色譜儀測(cè)定發(fā)酵液的吲哚和糞臭素濃度。

1.4.4 乙酸、丙酸、丁酸和乳酸濃度

參照文獻(xiàn)[15]的方法，用Agilent-7890B氣相色譜儀測(cè)定發(fā)酵液的乙酸、丙酸、丁酸和乳酸濃度。

1.5發(fā)酵液菌群結(jié)構(gòu)測(cè)定

1.5.1 基因組DNA的提取

使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)環(huán)境微生物DNA提取試劑盒，提取發(fā)酵液中總細(xì)菌基因組DNA，并用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增

細(xì)菌通用引物同文獻(xiàn)[10]。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：rTaq酶(5 U/μL)0.4 μL、10×PCR buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)3.2 μL、GC-338F(20 μmol/L)1 μL、518R(20 μmol/L)1 μL、模板DNA 50 ng，補(bǔ)ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。

1.5.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

采用Bio-Rad Dcode系統(tǒng)進(jìn)行DGGE分析。采用變性梯度為35%～55%、濃度為7%的聚丙烯酰胺凝膠在1×TAE、150 V、60 ℃下電泳5 h。采用硝酸銀染色并用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。采用Poly-Gel DNA提取試劑盒(OMEGA)回收目的條帶，并進(jìn)行克隆測(cè)序。測(cè)定序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，尋找親緣關(guān)系最近的細(xì)菌或克隆。

1.5.4 PCR-DGGE圖譜分析

采用Quantity one軟件對(duì)圖譜條帶數(shù)目、密度進(jìn)行數(shù)字化分析，其計(jì)算公式如下所示：

式中：H、S和E分別代表多樣性指數(shù)[香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-wiener index)]、豐富度和均勻度；pi為樣品中單一條帶的光密度值在該樣品所有條帶光密度總值中所占的比率；N為DGGE圖譜單一泳道上條帶的豐度；Ni為第i泳道條帶的豐度；S是全部樣品中所有條帶數(shù)目總和；Hmax為H的最大值。

不同樣品間菌群差異的兩兩比較，依據(jù)戴斯相似系數(shù)(Dice coefficient，Cs)，用MEGA 4.1軟件進(jìn)行聚類分析。Cs的計(jì)算公式為：

式中:Nx為x泳道樣本的條帶數(shù);Ny為y泳道樣本的條帶數(shù);j為2個(gè)泳道共有的條帶數(shù)。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較。糞臭素濃度、發(fā)酵參數(shù)、菌群結(jié)構(gòu)之間采用雙變量相關(guān)分析。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵液累積產(chǎn)氣量

由表1可知，發(fā)酵至3 h，各組發(fā)酵液累積產(chǎn)氣量差異顯著(P<0.05)，之后各階段各組累積產(chǎn)氣量差異極顯著(P<0.01)；發(fā)酵至6、9 h時(shí)，RAF組累積產(chǎn)氣量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；發(fā)酵至21 h之前，RAF組累積產(chǎn)氣量均低于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)；發(fā)酵至24 h時(shí)，SUC、STA、SBO組累積產(chǎn)氣量極顯著高于對(duì)照組和RAF組(P<0.01)，對(duì)照組累積產(chǎn)氣量最低。各階段SUC、STA、SBO組之間累積產(chǎn)氣量差異不顯著(P>0.05)。由圖1可直觀看出各階段各組累積產(chǎn)氣量的變化情況。

2.2發(fā)酵液吲哚、糞臭素濃度及發(fā)酵參數(shù)

由表2可知，SBO、SUC和STA組發(fā)酵液中的吲哚濃度分別比對(duì)照組降低了98.15%、97.72%和94.17%(P<0.01)，但SUC、STA和SBO組的吲哚濃度差異不顯著(P>0.05)，RAF組的吲哚濃度與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。各組發(fā)酵液中的糞臭素濃度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中，SBO、SUC、STA和RAF組的糞臭素濃度分別比對(duì)照組降低了79.04%、71.88%、70.28%和62.42%(P<0.05)，但SBO、SUC、STA和RAF組的糞臭素濃度差異不顯著(P>0.05)。各組發(fā)酵液中的乙酸濃度差異不顯著(P>0.05)。SUC組發(fā)酵液中的乳酸濃度極顯著高于其他各組(P<0.01)，RAF、SBO組的乳酸濃度與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。對(duì)照組發(fā)酵液的pH極顯著高于除RAF組之外的其他各組(P<0.01)。

2.3發(fā)酵液菌群組成

2.3.1 菌群多樣性

由圖2可知，12、20、25、26號(hào)條帶在各組中均存在。有部分條帶只在某個(gè)組中存在，有部分條帶只在某個(gè)組中未出現(xiàn)。由表3可知，各組發(fā)酵液中菌群多樣性指數(shù)差異不顯著(P>0.05)；SBO組發(fā)酵液中菌群均勻度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；SUC、STA、RAF、SBO組發(fā)酵液中菌群豐富度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3.2 菌群相似性

由圖3可知，圖譜條帶被明顯分成兩簇，兩簇之間相似性系數(shù)為0.49。上方簇為2個(gè)對(duì)照組樣品和1個(gè)RAF組樣品，相似性系數(shù)為0.68，而2個(gè)對(duì)照組樣品之間的相似性系數(shù)為0.76。下方簇中，與其他樣品相似性系數(shù)最低的為SUC組樣品1-2，僅為0.51；而對(duì)照組樣品5-3與其他樣品的相似性系數(shù)為0.64，明顯低于其他3組；相似性高的有4簇，分別為SBO組樣品4-1和樣品4-3、STA組樣品2-2和樣品2-3、RAF組樣品3-1和樣品3-3、SUC組樣品1-1和SBO組樣品4-2，相似性系數(shù)依次為0.89、0.88、0.84、0.84，這些樣品為添加了SBO、STA、RAF的組，相似性系數(shù)均高于對(duì)照組。

表1 大豆低聚糖及其功能組分在肉仔雞盲腸菌群作用下對(duì)發(fā)酵液累積產(chǎn)氣量的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same column, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

圖1 大豆低聚糖及其功能組分在

2.3.3 菌群PCR-DGGE指紋圖譜優(yōu)勢(shì)條帶序列

本試驗(yàn)對(duì)PCR-DGGE指紋圖譜中11條具有共性、特異性的條帶進(jìn)行了回收、克隆和測(cè)序。由表4可知，在11個(gè)測(cè)序結(jié)果中，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中細(xì)菌的相似度都在99%～100%。其中12、20、25、26號(hào)條帶為15個(gè)發(fā)酵液樣品的共有條帶，其相似菌分別為鶉雞腸球菌(Enterococcusgallinarum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、菊花迪克氏菌(Dickeyachrysanthemi)、宋內(nèi)氏志賀氏菌(Shigellasonnei)。4號(hào)條帶僅在RAF組樣品3-1中出現(xiàn)，其相似菌為延長(zhǎng)布勞特氏菌(Blautiaproducta)。9號(hào)條帶在SUC組樣品1-1、1-2，STA組樣品2-1、2-3，RAF組所有樣品和SBO組樣品4-1、4-2中出現(xiàn)，其相似菌為迪氏副擬桿菌(Parabacteroidesdistasonis)。28號(hào)條帶在SUC、STA、RAF和SBO組中出現(xiàn)，相似菌為路氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)?？梢?jiàn)，4、9、28號(hào)條帶僅在試驗(yàn)組中出現(xiàn)。

表2 大豆低聚糖及其功能組分在肉仔雞盲腸菌群作用下對(duì)發(fā)酵液吲哚、糞臭素濃度及發(fā)酵參數(shù)的影響

各組發(fā)酵液中丙酸和丁酸均未檢出。

No propionate and butyrate were detected in fermentation broth in all groups.

1-1，1-2，1-3為蔗糖組樣品；2-1，2-2，2-3為水蘇糖組樣品；3-1，3-2，3-3為棉子糖組樣品；4-1，4-2，4-3為大豆低聚糖組樣品；5-1，5-2，5-3為對(duì)照組樣品。圖3同。

1-1, 1-2 and 1-3 were samples in SUC group; 2-1, 2-2 and 2-3 were samples in STA group; 3-1, 3-2 and 3-3 were samples in RAF group; 4-1, 4-2 and 4-3 were samples in SBO group; 5-1, 5-2 and 5-3 were samples in control group. The same as Fig.3.

圖2發(fā)酵液菌群PCR-DGGE指紋圖譜

Fig.2 PCR-DGGE fingerprints of microbiota in fermentation broth

2.4發(fā)酵液糞臭素濃度、發(fā)酵參數(shù)與菌群多樣性間的相關(guān)關(guān)系

由表5可知，發(fā)酵液乙酸濃度與菌群多樣性指數(shù)、豐富度均呈正相關(guān)，其中乙酸濃度與菌群多樣性指數(shù)呈極顯著正相關(guān)(r=0.964，P<0.01)，乙酸濃度與菌群豐富度呈顯著正相關(guān)(r=0.954，P<0.05)；pH與菌群均勻度呈顯著正相關(guān)(r=0.909，P<0.05)。

3 討 論

3.1大豆低聚糖及其功能組分在肉仔雞盲腸菌群作用下對(duì)L-Try代謝生成糞臭素的影響

發(fā)酵底物和微生物種類對(duì)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣速率及代謝產(chǎn)物都有一定的影響[16]。Lan等[17]以81日齡肉仔雞盲腸菌群為接種物，體外發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明，與SBO和RAF相比，STA具有較大的產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率。本試驗(yàn)結(jié)果表明，SUC、STA、SBO組發(fā)酵液24 h累積產(chǎn)氣量極顯著高于對(duì)照組，但3組間差異不顯著。說(shuō)明肉仔雞盲腸微生物能夠很好地利用SBO及其功能組分(RAF除外)進(jìn)行發(fā)酵，SUC、STA、SBO均為肉仔雞盲腸微生物很好的碳源。易中華等[18]以42日齡肉仔雞盲腸內(nèi)容物為菌源，體外發(fā)酵RAF、STA、果寡糖和甘露寡糖，結(jié)果表明它們的可發(fā)酵性依次降低，且RAF發(fā)酵產(chǎn)氣量最大、產(chǎn)氣速率最快。本試驗(yàn)結(jié)果表明，RAF產(chǎn)氣量最小，這可能與本試驗(yàn)中添加了L-Try有關(guān)，由于蛋白質(zhì)源的存在影響了碳水化合物的發(fā)酵。本試驗(yàn)中，在發(fā)酵21 h之前，RAF組的累積產(chǎn)氣量低于對(duì)照組，至發(fā)酵24 h累積產(chǎn)氣量才超過(guò)對(duì)照組，說(shuō)明RAF的發(fā)酵速度較慢，造成前期微生物依賴L-Try為發(fā)酵底物，使L-Try降解增加，進(jìn)一步使吲哚和糞臭素產(chǎn)生量增加，尤其RAF組吲哚的產(chǎn)量比SUC、STA和SBO組分別高出220.51、212.39和221.50 ng/mL。

表3 大豆低聚糖及其功能組分對(duì)體外條件下肉仔雞盲腸菌群多樣性的影響

圖3 15個(gè)發(fā)酵液樣品的未加權(quán)配對(duì)組法聚類分析

條帶號(hào)Bandnumbers相似菌Similarstrain登錄號(hào)Accessionnumbers相似度Similarity/%分類Classification備注Note4延長(zhǎng)布勞特氏菌BlautiaproductaNR_113270100厚壁菌門Firmicutes梭菌綱Clostridia布勞特氏菌屬BlautiaRAF組3-1特有9迪氏副擬桿菌ParabacteroidesdistasonisNR_04134299擬桿菌門Bacteroidetes擬桿菌綱Bacteroidia副擬桿菌屬ParabacteroidesSUC組1-1、1-2,STA組2-1、2-3,RAF組和SBO組4-1、4-2共有12鶉雞腸球菌EnterococcusgallinarumNR_10455999厚壁菌門Firmicutes芽孢桿菌綱Bacilli腸球菌屬Enterococcus共有

續(xù)表4條帶號(hào)Bandnumbers相似菌Similarstrain登錄號(hào)Accessionnumbers相似度Similarity/%分類Classification備注Note15卷曲乳桿菌LactobacilluscrispatusNR_11927499厚壁菌門Firmicutes芽孢桿菌綱Bacilli乳桿菌屬LactobacillusSUC組1-1、1-3,STA組,RAF組,SBO組和對(duì)照組5-3共有17芬戈?duì)柕聞e樣桿菌AlistipesfinegoldiiNR_11530099擬桿菌門Bacteroidetes擬桿菌綱Bacteroidia別樣桿菌屬AlistipesSBO組4-1、4-3和對(duì)照組5-2、5-3共有20肺炎克雷伯菌KlebsiellapneumoniaeNR_04175099變形菌門Proteobacteria加瑪變形菌綱Gammaproteobacteria克雷伯菌屬Klebsiella共有22弗格森埃希氏菌EscherichiafergusoniiNR_074902100變形菌門Proteobacteria加瑪變形菌綱Gammaproteobacteria埃希氏菌屬EscherichiaSUC組,STA組,RAF組,SBO組和對(duì)照組5-2、5-3共有25菊花迪克氏菌DickeyachrysanthemiNR_11773899變形菌門Proteobacteria加瑪變形菌綱Gammaproteobacteria迪克氏菌屬Dickeya共有26宋內(nèi)氏志賀氏菌ShigellasonneiNR_10482699變形菌門Proteobacteria加瑪變形菌綱Gammaproteobacteria志賀氏菌屬Shigella共有28路氏乳桿菌LactobacillusreuteriNR_075036100厚壁菌門Firmicutes芽孢桿菌綱Bacilli乳桿菌屬LactobacillusSUC、STA、RAF和SBO組共有29類肺炎克雷伯菌KlebsiellaquasipneumoniaeNR_134062100變形菌門Proteobacteria加瑪變形菌綱Gammaproteobacteria克雷伯菌屬KlebsiellaSUC組,STA組,RAF組,SBO組4-1、4-3和對(duì)照組5-3共有

表5 發(fā)酵液糞臭素濃度、發(fā)酵參數(shù)與肉仔雞盲腸菌群多樣性間的相關(guān)關(guān)系

**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)，*表示顯著相關(guān)(P<0.05)。

** means extremely significant correlation (P<0.01), and * means significant correlation (P<0.05).

Li等[8]報(bào)道，添加甜菜粕和果寡糖顯著降低了豬直腸菌群作用下L-Try培養(yǎng)液中糞臭素的濃度和相對(duì)產(chǎn)率。本試驗(yàn)表明，添加SBO及其功能組分顯著降低了發(fā)酵液糞臭素濃度，其降低效果由高到低依次為SBO、SUC、STA、RAF，添加RAF對(duì)發(fā)酵液吲哚濃度無(wú)顯著影響。說(shuō)明無(wú)論是SBO，還是其功能組分都具有較好的降低發(fā)酵液糞臭素產(chǎn)量的效果，但RAF效果最差。主要是由于RAF發(fā)酵速度慢，導(dǎo)致微生物首先利用L-Try，進(jìn)而導(dǎo)致其分解產(chǎn)物的增加。研究表明，腸道微生物的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)需要碳水化合物和蛋白質(zhì)參與，在肉仔雞腸道遠(yuǎn)端，細(xì)菌糖化發(fā)酵優(yōu)先，只有當(dāng)碳水化合物用盡時(shí)，腐敗作用才會(huì)出現(xiàn)[19]。SBO及其功能組分降低糞臭素濃度的效果，主要是源于其作為微生物的能源物質(zhì)優(yōu)先發(fā)酵，進(jìn)而減少了細(xì)菌對(duì)L-Try的發(fā)酵，因此減少了糞臭素的產(chǎn)生量。

非可消化碳水化合物(NDC)在結(jié)腸中通過(guò)微生物的發(fā)酵，最終產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸[20]。因此，單胃動(dòng)物腸道中乙酸、丙酸和丁酸的含量和比例可間接反映腸道微生物菌群狀況[21]。Lan等[22]以81日齡肉雞盲腸內(nèi)容物為菌源，體外發(fā)酵SBO、大豆水溶性多糖等4種NDC以及STA和RAF，結(jié)果表明SBO組發(fā)酵液具有最高的丁酸產(chǎn)量和最低的pH、氨氮濃度(199.3 mg/L)。本試驗(yàn)中SBO及其功能組分對(duì)發(fā)酵液乙酸濃度無(wú)顯著影響，但對(duì)照組乙酸濃度最低(10.27 mmol/L)。Macfarlane等[23]報(bào)道，細(xì)菌發(fā)酵時(shí)所使用的底物會(huì)影響到短鏈脂肪酸(SCFA)的產(chǎn)量，一般以蛋白質(zhì)為發(fā)酵底物所產(chǎn)生的SCFA量會(huì)比以碳水化合物為基質(zhì)的少。本試驗(yàn)中，添加SBO極顯著降低了發(fā)酵液乳酸濃度和pH，對(duì)照組的pH最高，對(duì)照組和RAF組pH差異不顯著。由于低pH環(huán)境有利于乳酸菌的增長(zhǎng)，減少了腐敗菌的滋生，進(jìn)而達(dá)到減少糞臭素產(chǎn)生的效果。

本試驗(yàn)采用氣相色譜法，未檢測(cè)到發(fā)酵液中的丙酸和丁酸，易中華等[18]以肉仔雞盲腸內(nèi)容物為菌源，體外發(fā)酵STA和RAF，測(cè)得24 h發(fā)酵液乙酸、丙酸和丁酸的摩爾比例分別為5.6∶2.5∶1.9和5.6∶2.3∶2.1。說(shuō)明肉仔雞腸道微生物發(fā)酵碳水化合物主要產(chǎn)生乙酸和乳酸，而產(chǎn)生的丙酸和丁酸極少。

3.2大豆低聚糖及其功能組分對(duì)體外條件下肉仔雞盲腸菌群組成的影響

近年來(lái)，PCR-DGGE、qPCR、宏蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物腸道菌群生態(tài)學(xué)研究，已成為研究肉仔雞腸道微生物的主要技術(shù)手段，并用于解釋與惡臭化合物生成有關(guān)的新菌落[10-11]。本試驗(yàn)中，添加SBO及其功能組分后，對(duì)發(fā)酵液菌群多樣性指數(shù)無(wú)顯著影響，與侯瑞[11]報(bào)道的結(jié)果一致。但本試驗(yàn)中，添加SBO及其功能組分后顯著提高了發(fā)酵液菌群的豐富度，SBO組顯著降低了發(fā)酵液菌群的均勻度。在體外培養(yǎng)體系中，菌群PCR-DGGE指紋圖譜的差異，以及STA、RAF、SBO組與對(duì)照組相似性的差異，可能解釋了SBO及其功能組分降低糞臭素產(chǎn)生的原因。另外，試驗(yàn)組有3條特異性條帶，相似菌分別為延長(zhǎng)布勞特氏菌、迪氏副擬桿菌、路氏乳桿菌，說(shuō)明添加SBO及其功能組分能夠通過(guò)促進(jìn)以上細(xì)菌的增殖降低吲哚、糞臭素的產(chǎn)生。

3.3發(fā)酵液糞臭素濃度、發(fā)酵參數(shù)與盲腸菌群組成的相關(guān)關(guān)系分析

已往的研究大多注重SBO(或其部分組分)對(duì)人或動(dòng)物腸道微生物菌群的影響，少量文獻(xiàn)涉及對(duì)糞臭素產(chǎn)量、pH和有機(jī)酸等的影響，有關(guān)它們之間相關(guān)關(guān)系的研究?jī)H見(jiàn)零星報(bào)道[24-25]。通過(guò)研究糞臭素、吲哚等濃度與腸道菌群間的相關(guān)關(guān)系，將有助于揭示SBO及其功能組分降低肉仔雞糞臭素、吲哚等產(chǎn)生的微生物學(xué)機(jī)制，對(duì)探究降低糞臭素污染的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控措施具有重要科學(xué)意義。胡彩虹等[26]以豬糞為菌源體外發(fā)酵L-Try，結(jié)果表明，pH較高的環(huán)境有利于糞臭素的產(chǎn)生，而pH較低的環(huán)境有利于吲哚的產(chǎn)生。說(shuō)明環(huán)境酸度與吲哚和糞臭素的產(chǎn)生量存在一定關(guān)系。王琪等[25]報(bào)道，42日齡肉仔雞排泄物pH與盲腸乳酸濃度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.927)。本研究表明，添加SBO及其功能組分極顯著影響肉仔雞體外發(fā)酵液的乳酸濃度和pH，其中SBO組pH最低，而對(duì)照組的pH最高。結(jié)合吲哚濃度、糞臭素濃度數(shù)據(jù)分析，與以上報(bào)道基本一致。另外產(chǎn)氣量越高，菌群的發(fā)酵特性越好，越不利于L-Try降解產(chǎn)生吲哚。張沛[5]研究表明，肉仔雞腸道菌群多樣性指數(shù)、豐富度和總菌數(shù)量與糞臭素產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，r分別為0.748、0.783和0.700。本研究表明，發(fā)酵液的乙酸濃度與菌群多樣性指數(shù)呈極顯著正相關(guān)，乙酸濃度與菌群豐富度呈顯著正相關(guān)，pH與菌群均勻度呈顯著正相關(guān)，而吲哚和糞臭素濃度與菌群結(jié)構(gòu)無(wú)顯著相關(guān)性。因此，本試驗(yàn)中也可能是由于SBO及其功能組分通過(guò)增加或降低某些菌群的數(shù)量來(lái)降低糞臭素的產(chǎn)生，待后續(xù)試驗(yàn)報(bào)道。另外，此結(jié)果是否與肉仔雞腸道內(nèi)菌群的變化一致，還需動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

① 添加1%的SBO、SUC和STA極顯著降低了肉仔雞體外盲腸發(fā)酵液吲哚濃度，降低幅度分別為98.15%、97.72%和94.17%；添加1%的SBO、SUC、STA和RAF顯著降低了發(fā)酵液糞臭素濃度，降低幅度分別為79.04%、71.88%、70.28%和62.42%。

② 添加1%的SBO顯著降低了發(fā)酵液菌群均勻度，添加1%的SBO及其功能組分顯著提高了發(fā)酵液菌群豐富度。SBO及其功能組分促進(jìn)了延長(zhǎng)布勞特氏菌、迪氏副擬桿菌、路氏乳桿菌細(xì)菌的增殖。

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Author, YANG Guiqin, professor, E-mail: guiqiny@126.com

EffectsofSoybeanOligosaccharideandItsFunctionalComponentsonSkatoleProductionandMicrobiotaCompositionofBroilersCecalContentsinVitro

YANG Guiqin YANG Hang LIU Jizhe LIU Haiying DONG Weiguo ZHU Xin

(CollegeofAnimalHusbandryandVeterinary,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China)

The aim of this study was to investigate the effects of soybean oligosaccharide (SBO) and its functional components on skatole production and microbiota composition of broilers cecal contentsinvitro. This experiment used a single-factor completely randomized design, the 42 days of age broiler cecal contents was used as bacterial source, and the anaerobic culture medium was divided into sterile culture bottles, and divided into 5 groups with 3 replicates per group. The control group was added 250 μmol/LL-tryptophan, sucrose (SUC), stachyose (STA), raffinose (RAF) and SBO groups were supplemented with 1% SUC, STA group RAF and SBO on the basis of control group, respectively. In addition, each group also had a blank control whichL-tryptophan was absent and the other components were the same. Microbial suspensions were anaerobically incubated at 39 ℃ for 24 h using ANKOM RFS gas production systeminvitro. The microbiota composition in fermentation broth were analyzed by PCR-denatured gradient gel electrophoresis (DGGE). The results showed as follows: 1) the 24 h cumulative gas production in fermentation broth in SUC, STA and SBO groups was significantly higher than that in control and RAF groups (P<0.01). Compared with the control group, the indole concentration in fermentation broth in SBO, SUC, and STA groups was significantly reduced by 98.15%, 97.72% and 94.17%, respectively (P<0.01), and the skatole concentration was significantly reduced by 79.04%, 71.88% and 70.28%, respectively (P<0.05). The lactate concentration in fermentation broth in SUC group was significantly higher than that in the other groups (P<0.01), and pH in the control group was significantly higher than that in the other groups except for the RAF group (P<0.01). 2) The microbiota evenness in fermentation broth in SBO group was significantly lower than that in the control group (P<0.05), and the microbiota richness in SUC, STA, RAF and SBO groups was significantly higher than that in control group (P<0.05). The microbiota similarity in fermentation broth in SBO, STA and RAF groups was higher than that in control group. Three specific bands were present only in experimental groups, the similar strain wereBlautiaproducta,Parabacteroidesdistasonis, andLactobacillusreuteri, respectively. In conclusion, under the present experimental condition, addition 1% SUC, STA, and SBO in broiler cecal contents culture medium significantly decreases the concentrations of indole and skatole by metabolism ofL-tryptophan, improves the microbiota richness, and promotes the proliferation of specific bacteria. The effect of skatole reduction is as follow: SBO>SUC>STA.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(11)：4058-4068]

skatole; soybean oligosaccharide; cecal microbiota; fermentationinvitro; broilers

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.11.027

S831.5

A

1006-267X(2017)11-4058-11

2017-04-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372328)

楊桂芹(1966—)，女，遼寧凌源人，教授，博士，從事家禽營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail: guiqiny@126.com

(責(zé)任編輯 李慧英)