陳繼發(fā) 彭燦陽(yáng) 曲湘勇* 季 方

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長(zhǎng)沙 410128；3.美國(guó)安牧然國(guó)際公司，芝加哥 IL 60611)

蒙脫石對(duì)產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能和盲腸菌群的影響

陳繼發(fā)1,2彭燦陽(yáng)1,2曲湘勇1,2*季 方3

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長(zhǎng)沙 410128；3.美國(guó)安牧然國(guó)際公司，芝加哥 IL 60611)

本試驗(yàn)旨在研究蒙脫石對(duì)產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能和盲腸菌群的影響。選取480只75周齡的羅曼蛋雞，隨機(jī)分成5組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0.3、0.6、0.9和1.2 g/kg的蒙脫石。預(yù)試期7 d，正試期70 d。結(jié)果表明：1)與對(duì)照組相比，0.9 g/kg蒙脫石組產(chǎn)蛋雞試驗(yàn)第1～5周日產(chǎn)蛋量顯著提高(P<0.05)，試驗(yàn)組料蛋比有降低的趨勢(shì)(P=0.073)。2)0.3、0.9和1.2 g/kg蒙脫石組測(cè)序獲得的有效序列和優(yōu)質(zhì)序列均多于對(duì)照組(P>0.05)。3)試驗(yàn)組的Beta多樣性提高，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組Shannon指數(shù)有提高的趨勢(shì)(P=0.096)，Simpson指數(shù)呈降低的趨勢(shì)(P=0.095)。4)在門(mén)水平上，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和螺旋體門(mén)的相對(duì)含量均有提高(P>0.05)；0.9 g/kg蒙脫石組中WPS_2的相對(duì)含量顯著增加(P<0.05)；0.3 g/kg蒙脫石組迷蹤菌門(mén)相對(duì)含量顯著降低(P<0.05)。在屬水平上，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組瘤胃球菌屬的相對(duì)含量顯著提高(P<0.05)，紫單胞菌屬的相對(duì)含量呈提高的趨勢(shì)(P=0.067)；0.6和1.2 g/kg蒙脫石組多爾氏菌屬和布勞特氏菌屬的相對(duì)含量顯著提高(P<0.05)；0.6 g/kg蒙脫石組中帕拉普氏菌屬的相對(duì)含量顯著提高(P<0.05)。5)屬水平上聚類分析顯示，試驗(yàn)組與對(duì)照組的腸道菌群相似度降低。由此可見(jiàn)，蒙脫石在一定程度上影響了產(chǎn)蛋雞盲腸菌群的多樣性及物種豐度，飼糧中添加0.9 g/kg蒙脫石有提高產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能的趨勢(shì)。

蒙脫石；生產(chǎn)性能；腸道微生物；高通量菌群；產(chǎn)蛋雞

動(dòng)物腸道是一個(gè)開(kāi)放的生態(tài)系統(tǒng)，棲居著大量的微生物。腸道菌群的穩(wěn)態(tài)對(duì)維持宿主的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)吸收和免疫應(yīng)答等生理功能均具有重要作用。許多因素能夠影響腸道菌群的組成及其多樣性，研究證實(shí)，霉菌毒素能夠降低動(dòng)物腸道微生物多樣性，破壞腸道正常菌群的生態(tài)平衡，進(jìn)而產(chǎn)生一系列毒性效應(yīng)[1-2]；此外，動(dòng)物腸道中過(guò)度繁殖的病原菌能造成腸道菌群失衡，破壞腸黏膜屏障功能，降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和機(jī)體免疫防御能力，進(jìn)而降低動(dòng)物的生產(chǎn)性能，甚至增加死亡率[3-4]。因此，控制生物毒素誘導(dǎo)的腸道微生物紊亂，維護(hù)動(dòng)物腸道健康具有重要意義。蒙脫石是一種鋁硅酸鹽類黏土，其擁有巨大的比表面積，表面分布著無(wú)數(shù)微孔，具有很好的吸附性和離子交換能力，已被證實(shí)能在腸道中吸附細(xì)菌和霉菌毒素[5-6]。Xia等[7]和Hu等[8]研究表明，蒙脫石能顯著減少肉雞小腸和盲腸中大腸桿菌和梭菌的數(shù)量；蒙脫石在不同程度上降低了斷奶仔豬回腸和結(jié)腸中大腸桿菌、梭菌和沙門(mén)氏菌的數(shù)量[9-10]；此外，蒙脫石能增加奶牛瘤胃中具有降解臭氣味物質(zhì)的菌屬，減少瘤胃纖維分解菌和腸道病原菌——弗氏志賀菌屬[11]。但這些研究主要基于傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)法，只局限于特定細(xì)菌或一定豐度的微生物，對(duì)未知微生物均未涉及，且其準(zhǔn)確度也不盡理想，不能充分反映蒙脫石對(duì)腸道微生物菌群的影響。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)蒙脫石提高了產(chǎn)蛋高峰期蛋雞的生產(chǎn)性能[12]，我們猜想蒙脫石或許能夠延緩產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋末期生產(chǎn)性能的降低，進(jìn)而延長(zhǎng)產(chǎn)蛋周期。此外，鑒于腸道微生物與宿主免疫、營(yíng)養(yǎng)吸收和生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)性，我們猜測(cè)其對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的影響與腸道菌群存在一定關(guān)聯(lián)。因此，本試驗(yàn)在產(chǎn)蛋末期蛋雞飼糧中添加不同水平的蒙脫石，探討其對(duì)產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能的影響；并采用準(zhǔn)確性高、信息量大的宏基因組測(cè)序技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù)，定性、定量地探究蒙脫石對(duì)產(chǎn)蛋雞盲腸微生物組成、菌群多樣性和物種豐度的影響，以全面、準(zhǔn)確地評(píng)估蒙脫石在維護(hù)腸道微生物屏障中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選取480只75周齡、體重相近、健康的羅曼蛋雞，隨機(jī)分成5組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0.3、0.6、0.9和1.2 g/kg的蒙脫石。預(yù)試期各組統(tǒng)一飼喂基礎(chǔ)飼糧，每天對(duì)雞群進(jìn)行觀察，并及時(shí)調(diào)整雞群，使各組產(chǎn)蛋雞的飼糧消耗量、產(chǎn)蛋率和蛋重差異不顯著(P>0.05) 。預(yù)試期7 d，正試期70 d。試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧參考NY/T 33—2004《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

試驗(yàn)產(chǎn)蛋雞采用開(kāi)放式雞舍上、中、下3層階梯式籠養(yǎng)，每籠3只，每4籠1個(gè)重復(fù)，各組的試驗(yàn)雞保證分布在上、中、下層的數(shù)量相等。每日喂料2次(08:00和14:30)，上午、下午各勻料2次。各組飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同，試驗(yàn)第1～5周雞舍溫度、相對(duì)濕度分別為(20.64±1.76) ℃、(68.90±0.90)%；第6～10周雞舍溫度、相對(duì)濕度分別為(22.60±1.04) ℃、(74.46±2.74)%。雞只自由采食、飲水，每日光照時(shí)間為16 h，自然光照和人工光照相結(jié)合。每日清掃雞舍1次，每周對(duì)雞舍帶雞噴霧消毒1次，每隔3 d清糞1次。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet：VA 6 000 IU,VB25.5 mg,VD32 500 IU,VB11.75 mg,VB64 mg,VB120.017 5 mg,VE 25 mg,VK32.25 mg,生物素 biotin 0.14 mg,葉酸 folic acid 0.9 mg,煙酸nicotinic acid 34 mg,泛酸 pantothenate 12 mg,植酸酶phytase 400 U,膽堿 chloride 300 mg,Fe 75 mg,Cu 7.5 mg,Zn 60 mg,Mn 60 mg,I 0.75 mg,Se 0.15 mg,Ca 9.5 g,P 2.0 g,食鹽NaCl 3.7 g。

2)營(yíng)養(yǎng)水平均為計(jì)算值。The nutrient levels were calculated values.

1.2試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用的蒙脫石由美國(guó)安牧然國(guó)際公司提供，其主要成分為：鈣蒙脫石>70%，無(wú)定形水合二氧化硅>15%，其他礦物元素<15%。

1.3生產(chǎn)性能測(cè)定

正式飼養(yǎng)期內(nèi)，每日記錄各組(以重復(fù)為單位)產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重、軟破殼蛋數(shù)及死淘雞數(shù)，每周統(tǒng)計(jì)1次采食量。計(jì)算統(tǒng)計(jì)期內(nèi)的平均日采食量、產(chǎn)蛋率、平均蛋重、料蛋比和日產(chǎn)蛋量。

1.4腸道微生物分析

1.4.1 樣品采集

試驗(yàn)第70天，從每組隨機(jī)選取8只雞(每個(gè)重復(fù)1只)，頸部放血死亡后剖開(kāi)腹腔，取盲腸內(nèi)容物置于1.5 mL的高壓滅菌離心管中，并迅速放置液氮中保存，然后放入-80 ℃冰箱凍存。

1.4.2 細(xì)菌DNA提取及檢測(cè)

分別從每組的8份盲腸內(nèi)容物樣品中隨機(jī)選取6份，每份稱取(200±10) mg置于2 mL離心管中，采用糞便基因組DNA提取試劑盒(DP328，天根生化科技有限公司)提取盲腸內(nèi)容物DNA，嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作。用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop ND-2000 UV，賽默飛世爾科技公司)檢測(cè)DNA濃度，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度，之后將合格的DNA樣品送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序分析。

1.4.3 Illumina MiSeq宏基因組測(cè)序

利用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行Barcoded Illumina Miseq測(cè)序，對(duì)樣品16S rRNA的V4區(qū)建立文庫(kù)并上機(jī)測(cè)序。具體操作如下：選擇16S rDNA的V4區(qū)作為目的擴(kuò)增區(qū)域，用引物對(duì)515F/806R目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。目標(biāo)條帶用DNA切膠回收試劑盒進(jìn)行回收，得純化樣本，并用BioTek酶標(biāo)儀測(cè)定各樣本濃度并定量。每個(gè)樣品DNA等量混合，采用標(biāo)準(zhǔn)的Illumina TruSeq DNA文庫(kù)制備流程構(gòu)建所需的宏基因組上機(jī)文庫(kù)，最后在Illumina Miseq分析平臺(tái)上進(jìn)行Barcoded Illumina Miseq測(cè)序，采用PE250測(cè)序策略。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

對(duì)經(jīng)過(guò)雙端(pair-end)測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，截?cái)嗷蛏釛壍唾|(zhì)量序列(50個(gè)連續(xù)堿基平均質(zhì)量>Q30，接頭污染、含有N和低復(fù)雜度的reads)。用軟件Flash v1.2.11連接通過(guò)質(zhì)量控制的序列，舍棄無(wú)法連接的序列。利用軟件USEARCH 7.0.1090去掉純化后數(shù)據(jù)的嵌合體，應(yīng)用Qiime 1.8.0分析軟件合并去掉嵌合體的數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)按照Ulust算法將序列相似性≥97%的操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)進(jìn)行聚類。選取每個(gè)類最長(zhǎng)的序列為代表序列，通過(guò)RDP-classifier v2.2軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)有比對(duì)進(jìn)行物種注釋，得到每個(gè)OTU的分類學(xué)信息。通過(guò)軟件Mothur 1.31.2對(duì)生成的OTU信息進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性和豐富度分析。

微生物測(cè)序數(shù)據(jù)采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，然后通過(guò)Duncan氏法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，用P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有提高或降低的趨勢(shì)。

2 結(jié) 果

2.1蒙脫石對(duì)產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，試驗(yàn)第1～5周，0.9 g/kg蒙脫石組產(chǎn)蛋雞日產(chǎn)蛋量較對(duì)照組、0.3和0.6 g/kg 蒙脫石組顯著提高(P<0.05)；試驗(yàn)組料蛋比較對(duì)照組有降低的趨勢(shì)(P=0.073)，其中0.9 g/kg蒙脫石組料蛋比較對(duì)照組降低了9.69%(P>0.05)。

表2 蒙脫石對(duì)產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能的影響

續(xù)表2項(xiàng)目Items時(shí)間Time/周蒙脫石添加水平Montmorillonitesupplementallevel/(g/kg)00.30.60.91.2SEMP值P-value平均蛋重Averageeggweigh/g1～567.9067.4167.9970.6668.310.500.2826～1064.7564.2864.2163.9663.820.190.5731～1066.4265.9766.2467.4566.190.290.716

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2蒙脫石對(duì)產(chǎn)蛋雞盲腸菌群測(cè)序數(shù)據(jù)的影響

由表3可知，除0.6 g/kg蒙脫石組外，其余試驗(yàn)組獲得的有效序列和優(yōu)質(zhì)序列均多于對(duì)照組(P>0.05)。反映97%相似度下樣品取樣深度的稀釋曲線見(jiàn)圖1，每個(gè)樣品均在27000條左右，表明取樣深度一致；此外，物種觀察指數(shù)稀釋曲線隨著測(cè)試深度的不斷加深而逐漸增加，且達(dá)到了平臺(tái)期，說(shuō)明測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中的所有物種。

表3 97%相似性水平下物種豐富度和多樣性指數(shù)

2.3蒙脫石對(duì)產(chǎn)蛋雞盲腸菌群Alpha多樣性的影響

將各組樣品所有序列按97%的相似度進(jìn)行OTU聚類，利用程序運(yùn)算得到評(píng)價(jià)樣品中群落豐富度和多樣性的Alpha多樣性指數(shù)，見(jiàn)表3。各組間Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。0.6 g/kg蒙脫石組的Ace指數(shù)顯著高于1.2 g/kg蒙脫石組(P<0.05)，蒙脫石對(duì)Shannon指數(shù)有提高的趨勢(shì)(P=0.096)，對(duì)Simpson指數(shù)有降低的趨勢(shì)(P=0.095)。

2.4蒙脫石對(duì)產(chǎn)蛋雞盲腸菌群Beta多樣性的影響

Beta多樣性分析可以比較不同樣品間在物種多樣性方面存在的差異大小。經(jīng)主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis,PCoA)方法分析，見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示對(duì)照組(朝右邊三角形)與試驗(yàn)組能較好地區(qū)分，且菌群結(jié)構(gòu)分布(畫(huà)圈)相對(duì)緊湊，相似度較高；而各試驗(yàn)組菌群結(jié)構(gòu)分布零散、相似度低，多樣性較對(duì)照組提高，尤其是0.6 g/kg蒙脫石組(朝上三角形)和1.2 g/kg蒙脫石組(朝下三角形)。

2.5物種豐度差異性分析

為探討蒙脫石對(duì)盲腸微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的影響，在門(mén)和屬2個(gè)層次上對(duì)同類的OTU進(jìn)行聚類比較研究。由表4可知，在門(mén)水平上，相對(duì)含量大于0.5%的門(mén)共有6個(gè)，試驗(yàn)得出的其余9個(gè)菌門(mén)相對(duì)含量均低于0.5%，豐度很低。各組中擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和螺旋體門(mén)均為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，尤其是擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)相對(duì)含量分別為67.06%～70.34%和17.30%～21.38%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：試驗(yàn)組中的厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和螺旋體門(mén)相對(duì)含量均高于對(duì)照組(P>0.05)。此外，與對(duì)照組相比，0.3 g/kg蒙脫石組中迷蹤菌門(mén)相對(duì)含量顯著減少(P<0.05)；0.9 g/kg蒙脫石組中WPS_2相對(duì)含量顯著增加(P<0.05)。

Cont為對(duì)照組樣本；CZ1、CZ2、CZ3和CZ4分別為0.3、0.6、0.9和1.2 g/kg蒙脫石組樣本。下圖同。

Cont indicated the sample in control group; CZ1, CZ2, CZ3 and CZ4 indicated the samples in 0.3, 0.6, 0.9 and 1.2 g/kg montmorillonite group, respectively. The same as below.

圖1產(chǎn)蛋雞盲腸內(nèi)容物樣本測(cè)序序列稀釋曲線(相似度:97%)

Fig.1 Rarefaction curve of sequenced reads in cecal content samples of laying hens (similarity: 97%)

圖2 蒙脫石添加后產(chǎn)蛋雞腸道菌群Beta多樣性變化

由表5可知，在屬水平上，序列比對(duì)得到的54個(gè)屬中共有12個(gè)菌屬相對(duì)含量大于0.5%，產(chǎn)蛋雞盲腸中有很多相對(duì)豐度較低的菌屬。在相對(duì)含量大于0.5%的菌屬中，各組均以擬桿菌屬、考拉桿菌屬、顫螺菌屬和普氏菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，且擬桿菌屬序列占測(cè)序總量的24.63%；但各組間以上優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組中瘤胃球菌屬的相對(duì)含量顯著提高(P<0.05)，紫單胞菌屬相對(duì)含量有增加的趨勢(shì)(P=0.067)；0.6和1.2 g/kg蒙脫石組多爾氏菌屬和布勞特氏菌屬的相對(duì)含量顯著提高(P<0.05)。此外，0.6 g/kg蒙脫石組中帕拉普氏菌屬的相對(duì)含量顯著高于其他4組(P<0.05)；試驗(yàn)組中梭桿菌屬的相對(duì)含量低于對(duì)照組，且數(shù)值上隨著蒙脫石添加水平的提高而減小(P>0.05)。

表4 相對(duì)含量大于0.5%(序列占測(cè)序總量比例)或差異顯著的菌門(mén)

表5 相對(duì)含量大于0.5%(序列占測(cè)序總量比例)或差異顯著的菌屬

將屬水平分類信息聚類后得到Heatmap，見(jiàn)圖3。30個(gè)樣品分成2大簇，左邊第1大簇16個(gè)樣品(0.3 g/kg蒙脫石組4個(gè)，0.9 g/kg蒙脫石組4個(gè)，1.2 g/kg蒙脫石組4個(gè)，對(duì)照組4個(gè))，右邊第2大簇14個(gè)樣品(其中0.6 g/kg蒙脫石組6個(gè)，且有4個(gè)連續(xù))，說(shuō)明不同組的樣品可以較好地聚在一起，0.6 g/kg蒙脫石組樣品的物種組成與其他4組差異性較大。此外，對(duì)照組的6個(gè)樣品中有5個(gè)距離較近(橫線)，物種組成相似度高；試驗(yàn)組中除0.3 g/kg 蒙脫石組外，其余3組的大部分樣品與對(duì)照組樣品相距較遠(yuǎn)，尤其是0.6 g/kg蒙脫石組，說(shuō)明物種在對(duì)照組與CZ組樣品間的組成差異性大?？傮w上，Heatmap結(jié)果與表5的結(jié)果相吻合。

3 討 論

3.1蒙脫石對(duì)產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能的影響

前人的研究表明蒙脫石能提高產(chǎn)蛋雞的生產(chǎn)性能。Yenice等[13]研究指出，飼糧中添加鈉質(zhì)蒙脫石，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率顯著提高，采食量無(wú)明顯變化；李俊營(yíng)等[14]報(bào)道，飼糧中添加1.5 g/kg的載鋅納米蒙脫石，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率提高了8.54%，料蛋比降低了2.19%；張軍民等[15]也指出，蒙脫石顯著提高了產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率，降低蛋的破損率，對(duì)采食量無(wú)影響。本課題組前期的研究表明，蒙脫石顯著提高了產(chǎn)蛋高峰期蛋雞的產(chǎn)蛋率，有降低料蛋比的趨勢(shì)[12]；本試驗(yàn)也得出，飼糧中添加0.9 g/kg蒙脫石顯著提高了產(chǎn)蛋雞的日產(chǎn)蛋量，試驗(yàn)組料蛋比有降低的趨勢(shì)，與以上研究結(jié)果基本一致。蒙脫石具有巨大的比表面積和良好的吸附性能，能夠增加食糜黏度，降低其在消化道內(nèi)的流通速率，可能有益于飼料養(yǎng)分的吸收、利用；此外，能吸附腸道內(nèi)有害物質(zhì)，與消化道中黏液蛋白結(jié)合，提高黏液的粘性和柔韌性，從而保護(hù)和修復(fù)腸道粘膜，維護(hù)腸道黏膜屏障[16]。綜上所述，飼糧中添加蒙脫石一定程度上能夠提高產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能，增加經(jīng)濟(jì)效益。

圖3 屬水平下30個(gè)盲腸內(nèi)容物樣品的聚類分析Heatmap

3.2蒙脫石對(duì)產(chǎn)蛋雞盲腸菌群多樣性的影響

腸道菌群多樣性是促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、維持機(jī)體免疫等生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，多樣性增加有利于機(jī)體新陳代謝和免疫防御，進(jìn)而益于宿主健康[17]。本研究表明，飼喂蒙脫石后產(chǎn)蛋雞盲腸菌群測(cè)序數(shù)量試驗(yàn)組與對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異，但0.9～1.2 g/kg蒙脫石組的有效序列和優(yōu)質(zhì)序列均多于對(duì)照組，說(shuō)明腸道微生物種類有所增加。此外，試驗(yàn)組中反映Alpha多樣性豐富度和均勻度的Shannon指數(shù)較對(duì)照組有提高趨勢(shì)，而Simpson指數(shù)有降低趨勢(shì)(Simpson指數(shù)越小說(shuō)明樣品中物種越豐富)；且PCoA方法分析Beta多樣性發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組菌群結(jié)構(gòu)分布相對(duì)零散，相似度較低，菌群多樣性提高。王聰[11]利用PCR-DGGE技術(shù)研究不同水平蒙脫石對(duì)奶牛瘤胃微生物區(qū)系的影響，發(fā)現(xiàn)隨著蒙脫石添加量的增加，奶牛瘤胃微生物Shannon指數(shù)逐漸降低，且添加2.5%和5.0%蒙脫石組較對(duì)照組顯著降低，說(shuō)明瘤胃菌群多樣性降低，與本試驗(yàn)結(jié)果不一致。造成結(jié)果差異的可能原因有試驗(yàn)動(dòng)物、蒙脫石種類及添加量、試驗(yàn)條件和檢測(cè)方法等。目前，尚未有關(guān)于蒙脫石對(duì)產(chǎn)蛋雞腸道菌群多樣性影響的報(bào)道，其是否影響產(chǎn)蛋雞腸道菌群多樣性還有待進(jìn)一步探討。

3.3蒙脫石對(duì)產(chǎn)蛋雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)和物種豐度的影響

家禽腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群與人類相似，優(yōu)勢(shì)菌群為擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，在腸道微生物中占比約為90%[18]。本研究中擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)占比在88%以上，蒙脫石添加后2個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的總占比沒(méi)有發(fā)生顯著變化，但厚壁菌門(mén)的相對(duì)含量較對(duì)照組有提高趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道，厚壁菌門(mén)與動(dòng)物飼糧消化有關(guān)，對(duì)飼糧養(yǎng)分的消化吸收有幫助作用[19]。有研究指出，酒精性肝損傷模型大鼠糞便中厚壁菌門(mén)的物種豐度顯著降低，迷蹤菌門(mén)的物種豐度明顯提高，反映腸黏膜屏障功能狀況的血清D-乳酸和二胺氧化酶水平顯著提高、腸黏膜叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3表達(dá)降低，提示腸道損傷發(fā)生，而添加益生菌后以上指標(biāo)均恢復(fù)到正常水平[20]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組迷蹤菌門(mén)的相對(duì)含量均有降低，其中0.3 g/kg蒙脫石組達(dá)到顯著水平。此外，0.9 g/kg蒙脫石組WPS_2菌門(mén)相對(duì)含量顯著提高，由于此菌門(mén)在腸道菌群中占比較低，其功能作用研究也鮮有報(bào)道，有待進(jìn)一步探討。以上結(jié)果提示蒙脫石可能與益生菌一樣發(fā)揮改善腸道微生物失衡、修復(fù)腸黏膜屏障功能的作用。

在屬水平上，我們發(fā)現(xiàn)在相對(duì)含量大于0.5%或有顯著差異的菌屬中，試驗(yàn)組中絕大多數(shù)菌屬的物種豐度均高于對(duì)照組，進(jìn)一步說(shuō)明蒙脫石在一定程度上提高了產(chǎn)蛋雞盲腸菌群的豐度和多樣性。與對(duì)照組相比，0.6～1.2 g/kg蒙脫石組中瘤胃球菌屬、多爾氏菌屬和布勞特氏菌屬的相對(duì)含量顯著提高。研究表明，這些菌屬物種豐度的提高與腸道健康密切相關(guān)。郭壯[21]研究指出，瘤胃球菌屬是健康人腸道中共有的少數(shù)細(xì)菌屬之一；Wang等[1]研究發(fā)現(xiàn)小鼠暴露于不同濃度的黃曲霉毒素B1后腸道中瘤胃球菌屬的物種豐度明顯降低。據(jù)報(bào)道，布勞特氏菌屬和多爾氏菌屬均為腸道中有益菌屬，具有產(chǎn)生短鏈脂肪酸的功能，對(duì)于維持腸道上皮細(xì)胞形態(tài)和功能具有一定作用[21]。此外，蒙脫石還提高了腸道中紫單胞菌屬和帕拉普氏菌屬的相對(duì)含量，這2種細(xì)菌屬是腸道內(nèi)具有保護(hù)性功能的菌群。研究發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，潰瘍性結(jié)腸炎患者糞便微生物中紫單胞菌屬的表達(dá)水平降低，并推測(cè)此菌屬的缺失可能與腸道炎癥有關(guān)[22]。高仁元等[23]利用PCR-DGGE技術(shù)研究表明，結(jié)腸癌大鼠糞便菌群中帕拉普氏菌屬的豐度較正常大鼠顯著降低。另外，本試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組中梭桿菌屬的相對(duì)含量有逐步降低的趨勢(shì)。梭桿菌屬是擬桿菌科的一個(gè)菌屬，包含壞死梭桿菌和核梭桿菌等多種致病菌，對(duì)動(dòng)物和人類均具有毒害作用。苗慧芳等[24]研究表明，結(jié)直腸癌患者糞便中梭桿菌屬的豐度明顯高于健康人，提示此菌屬數(shù)量增加可能與腸道疾病有關(guān)。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)蒙脫石降低了腸道中其他少數(shù)細(xì)菌屬的物種豐度，但這些菌屬相對(duì)含量很低，且統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異，或許不能作為評(píng)判蒙脫石是否影響腸道微生物群落豐度和多樣性的標(biāo)志性菌群。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于蒙脫石對(duì)動(dòng)物腸道菌群影響的報(bào)道中，多數(shù)研究人員采用傳統(tǒng)體外培養(yǎng)的方法，只能有限地探討特定幾種微生物的變化，對(duì)眾多厭氧細(xì)菌、未知微生物以及微生物多樣性等均未涉及，因此不能充分評(píng)估蒙脫石對(duì)腸道菌群的作用。本研究應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)探究了蒙脫石對(duì)產(chǎn)蛋雞盲腸菌群多樣性及物種豐度的影響，發(fā)現(xiàn)蒙脫石改變了盲腸微生物中部分菌群的物種豐度。前人的研究也表明，蒙脫石減少了肉雞、仔豬腸道中大腸桿菌、梭菌和沙門(mén)氏菌等有害菌的數(shù)量[7，25-27]；降低了奶牛瘤胃中病原菌——弗氏志賀菌屬的物種豐度[11]；減少了尼羅羅非魚(yú)腸道中氣單胞菌屬、黃桿菌屬和弧菌屬等細(xì)菌屬的百分比，增加了芽孢桿菌屬和棒桿菌屬的百分比[28]。可見(jiàn)，蒙脫石在一定程度上影響了動(dòng)物腸道中微生物的組成及豐度。鑒于瘤胃球菌屬、多爾氏菌屬、布勞特氏菌屬、帕拉普氏菌屬、紫單胞菌屬物種豐度的提高和梭桿菌屬豐度的降低與維持腸道正常功能的相關(guān)性，故可以將這些菌群豐度的變化作為蒙脫石改善腸道微生物失衡、維護(hù)腸道健康的菌群標(biāo)志物。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加0.9 g/kg蒙脫石顯著提高了產(chǎn)蛋末期蛋雞日產(chǎn)蛋量，有利于延長(zhǎng)蛋雞的產(chǎn)蛋周期。

② 飼喂蒙脫石后，產(chǎn)蛋雞盲腸微生物Beta多樣性一定程度上提高，部分菌群的物種豐度發(fā)生變化。在門(mén)水平上，蒙脫石有提高厚壁菌門(mén)物種豐度的趨勢(shì)，0.3 g/kg蒙脫石組迷蹤菌門(mén)豐度顯著降低；在屬水平上，0.6～1.2 g/kg蒙脫石組中瘤胃球菌屬、多爾氏菌屬、布勞特氏菌屬和帕拉普氏菌屬的物種豐度提高，梭桿菌屬的物種豐度有逐步降低的趨勢(shì)。

③ 腸道中這些菌屬豐度的變化與腸道健康密切相關(guān)，提示這些菌屬可能是蒙脫石維持腸道微生物屏障的標(biāo)志性菌群，且可能對(duì)改善產(chǎn)蛋雞的生產(chǎn)性能有一定作用。

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*Corresponding author, professor, E-mail: quxy99@126.com

EffectsofMontmorilloniteonPerformanceandCecalMicrofloraofLayingHens

CHEN Jifa1,2PENG Canyang1,2QU Xiangyong1,2*JI Fang3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 2.HunanCo-InnovationCenterofAnimalProductionSafety,Changsha410128,China; 3.AmlanInternational,ChicagoIL60611,USA)

This study was conducted to investigate the effects of montmorillonite on performance and cecal microflora of laying hens. Four hundred and eighty Brown Lohmann hens (75 weeks old) were randomly assigned to 5 groups, each of which comprised 8 replicates of 12 hens per replicate. Hens in the control group were fed a basal diet, and hens in experimental groups were fed the basal diets supplemented with 0.3, 0.6, 0.9 and 1.2 g/kg montmorillonite, respectively. The adjustment period lasted for 7 days, and the experimental period lasted for 70 days. The results showed as follows: 1) compared with the control group, the daily egg production of hens in 0.9 g/kg montmorillonite group was significantly increased (P<0.05), and feed to egg ratio in experimental groups tended to be higher (P=0.073) than that in the control group during 1 to 5 weeks of the experiment. 2) The quantities of effective sequences and good sequences observed in 0.3, 0.9 and 1.2 g/kg montmorillonite groups were more than those in the control group (P>0.05). 3) The Beta diversity was improved in the experimental groups. The Shannon index in experimental groups tended to be higher than that in the control group (P=0.096), and the Simpson index tended to be lower than that in the control group (P=0.095). 4) At the phylum level, compared with the control group, the relative contents of Firmicutes, Proteobacteria and Spirochaetes in the experimental groups were numerically increased (P>0.05); the relative content of WPS_2 in 0.6 g/kg montmorillonite group was significantly increased (P<0.05), and the Elusimicrobia relative content in 0.3 g/kg montmorillonite group was significantly decreased compared with the control group (P<0.05). At the genus level, compared with the control group, theRuminococcusrelative content in the experimental groups was significantly increased (P<0.05), and theParabacteroidesrelative content in experimental groups tended to be higher than that in the control group (P=0.067); the relative contents ofDoreaandBlautiain 0.6 and 1.2 g/kg montmorillonite groups were significantly increased (P<0.05); theParaprevotellarelative content in 0.6 g/kg montmorillonite group was significantly increased (P<0.05). 5) The cluster analysis at the genus level showed low similarity of intestinal microflora between the experimental groups and the control group. In conclusion, the bacterial diversity and species abundance of cecal microbiota of laying hens can be partially influenced by montmorillonite, and dietary supplementation with 0.9 g/kg montmorillonite tends to improve the egg production of laying hens.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(11)：4026-4035]

montmorillonite; performance; intestinal microbiota; high-throughput sequencing; laying hens

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.11.024

S831

A

1006-267X(2017)11-4026-10

2017-04-26

湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心專項(xiàng)資金(CICAPS)；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目(13098)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CX2016B299)

陳繼發(fā)(1992—)，男，湖南邵陽(yáng)人，博士研究生，研究方向?yàn)榧仪轄I(yíng)養(yǎng)與健康養(yǎng)殖。E-mail: jifachen66@yeah.net

*通信作者:曲湘勇，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: quxy99@126.com

(責(zé)任編輯 田艷明)