王相生 孫亞寧, 阮崇美 張全偉 張 勇* 胡驍飛

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

玉米赤霉烯酮降解酶在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)及其對母豬繁殖性能的影響

王相生1孫亞寧1,2阮崇美1張全偉3張 勇1*胡驍飛2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

本試驗(yàn)旨在建立玉米赤霉烯酮(ZEN)降解酶基因ZEN-jjm在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)體系，確定其產(chǎn)物的生物降解活性及對母豬繁殖性能的作用?？寺EN-jjm基因，經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后連接至pHT01表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析ZEN-jjm蛋白表達(dá)水平。高效液相色譜法(HPLC)檢測表達(dá)的ZEN-jjm蛋白降解ZEN的活性。通過對母豬的繁殖性能的評價，確定ZEN降解酶降解ZEN對母豬繁殖性能的影響。雙酶切和測序結(jié)果表明：ZEN-jjm成功插入pHT01中，SDS-PAGE表明獲得1株高效表達(dá)目的蛋白的重組枯草芽孢桿菌，其大小約為29 ku。HPLC結(jié)果表明表達(dá)的ZEN-jjm蛋白能有效地降解ZEN；表達(dá)的ZEN-jjm蛋白能顯著緩解ZEN對繁殖母豬的毒害作用(P<0.05)。綜上：1)本研究成功構(gòu)建了表達(dá)ZEN-jjm在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)載體，并在枯草芽孢桿菌中得到了表達(dá)。2)表達(dá)的ZEN-jjm蛋白具有降解ZEN的生物活性。3)在飼糧中添加ZEN-jjm蛋白能顯著降低ZEN對母豬能繁殖性能的危害。

玉米赤霉烯酮；ZEN-jjm基因；枯草芽孢桿菌；母豬

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)作為世界上污染糧食最廣泛的真菌毒素之一，對其危害性的研究很多，且由于ZEN具有雌激素作用，主要作用于生殖系統(tǒng)，因此對妊娠期的動物危害最大[1-3]。有研究表明母豬長期采食3～5 mg/kg ZEN污染的全價配合飼糧，在妊娠期會引起流產(chǎn)、死胎和畸胎；后備母豬出現(xiàn)假發(fā)情，外陰腫脹、紅腫，子宮受損出血以及不發(fā)情的癥狀，從而給規(guī)模化豬場造成不可估量的損失[4]。因此研究有效清除ZEN的方法已經(jīng)成為畜牧行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)，并且對食品和飼料安全也具有重要的意義。目前針對飼料及其原料中ZEN的脫毒方法主要有物理脫毒法、化學(xué)脫毒法和生物脫毒法。但是傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法都存在著勞動量大、試劑應(yīng)用的可行性差，而且對營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是小分子營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、藥物具有破環(huán)作用，并且由于清除不徹底，很容易造成二次污染。

有研究表明，有益的芽孢桿菌類微生物在吸附和降解霉菌毒素和ZEN、黃曲霉毒素都發(fā)揮了重要作用，尤其對ZEN的降解效果更加明顯[5-6]。由于酶制劑的專一性、高效性，因此其可將ZEN徹底分解而不會有ZEN素毒性物質(zhì)殘留。據(jù)報道，在畢赤酵母等真菌中分離得到的內(nèi)酯水解酶，主要的作用就是分解ZEN毒素(基因標(biāo)示為zhd101)，分離得到的內(nèi)酯水解酶經(jīng)過活性檢測可將ZEN標(biāo)準(zhǔn)品徹底分解[7]。zhd101是粉紅螺旋聚孢霉中的一個編碼泛解酸內(nèi)酯水解酶的基因，近幾年關(guān)于zhd101基因研究為數(shù)不多，Bakutis等[8]和Kakeya等[9]分別在大腸埃希菌和裂殖酵母中通過分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)出zhd101，程波財?shù)萚10]從粉紅螺旋聚孢霉中克隆到類似zhd101的ZEN降解酶基因(ZEN-jjm)，通過基因克隆、載體構(gòu)建等技術(shù)在原核生物中表達(dá)得到了ZEN降解酶。總結(jié)前人的研究工作，發(fā)現(xiàn)在以下幾個方面需要進(jìn)一步完善：一是ZEN-jjm在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)研究相對匱乏，二是ZEN降解酶在動物試驗(yàn)中對母豬繁殖性能的影響評價尚未見報道。因此，本試驗(yàn)重新構(gòu)建了ZEN-jjm在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)體系，以確定表達(dá)的ZEN降解酶是否具有降解ZEN的生物活性和降低對母豬繁殖性能危害的作用。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

含基因的質(zhì)粒由北京奧科鼎盛生物科技有限公司構(gòu)建并保存，枯草芽孢桿菌表達(dá)載體、大腸桿菌DH5α、枯草芽孢桿菌株均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司保存。

1.1.2 試劑

PCR擴(kuò)增試劑盒、低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)記、DNA標(biāo)記、RNA酶抑制劑、焦碳酸二乙酯、蒸餾水、緩沖液、感受態(tài)制備試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒、蛋白胨、DNA膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ和NotⅠ)以及Pfu DNA聚合酶購于北京奧科鼎盛生物科技有限公司。

1.1.3 儀器

PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf，德國)、電轉(zhuǎn)化儀(BioRad，美國)、高速離心機(jī)(Eppendorf，德國)、高效液相色譜儀(Agilent，德國)和儀器凝膠成像分析儀(BioRad，美國)。

1.1.4 試驗(yàn)動物及材料

試驗(yàn)?zāi)肛i由廣州從化種豬場提供。ZEN標(biāo)樣購于Sigma公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計及酶切位點(diǎn)設(shè)計

根據(jù)已知ZEN-jjm基因全長序列，設(shè)計基因全長擴(kuò)增引物，由Oligo 6引物設(shè)計軟件設(shè)計，序列為上游引物：5′-ATGCGCACTCGCAGCACAAT-3′，引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物：5′-TCAAAGATGCTTCTGCGTAGTTTCC-3′，引入NotⅠ酶切位點(diǎn)。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2.2ZEN-jjm基因的PCR擴(kuò)增

用北京天根公司2×Pfu PCR MasterMix，以從mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，目的基因全長序列約750 bp，反應(yīng)體系為25 μL。引物及其試劑均由北京天根生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)程序：94 ℃，3 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.3 PCR體系配制及結(jié)果檢測：

反應(yīng)體系：1 μL cDNA，1 μL上游引物(10 μmol/L)，1 μL下游引物(10 μmol/L)，12.5 μL 2×Pfu PCR MasterMix，ddH2O補(bǔ)至25 μL。

結(jié)果檢測：反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳凝膠結(jié)束后切膠，用質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。

1.2.4 重組表達(dá)載體pHT01-zhd101的構(gòu)建

純化后的PCR產(chǎn)物和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pHT01用EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，便于外源基因的插入。如果在這些酶切位點(diǎn)以外有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)記基因的失活，而影響篩選試劑盒回收目的片段。經(jīng)過酶切后取適量的目的基因片段。選擇的基因片段和載體片段用T4連接酶于22 ℃連接3 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，無菌操作和保持低溫，且培養(yǎng)物處于對數(shù)生長期。在含100 mg/mL氨芐青霉素的LB平板上篩選重組子，挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒，用PCR法和EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切法進(jìn)行鑒定。

1.2.5 基因測序及比對分析

將PCR和酶切鑒定正確的克隆樣本送往北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行DNA測序，經(jīng)測序結(jié)果比對，插入的片段序列完全正確，可用于下一步蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.6 枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

選用生長培養(yǎng)基制備枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，方法參考文獻(xiàn)[10]。

1.2.7 枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化

將重組質(zhì)粒pHT01-ZEN-jjm轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取2個克隆樣進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。

1.2.8 重組枯草芽孢桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)

將轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)6 h，離心收集菌體上清，加入上樣緩沖液進(jìn)行煮沸變性。吸取10 μL上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

1.2.9 檢測ZEN降解酶活性

取重組枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)表達(dá)的上清液，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行ZEN降解酶效價的降解實(shí)驗(yàn)，在重組枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)表達(dá)的上清液中加入ZEN溶液(ZEN系標(biāo)準(zhǔn)品由北京奧科鼎盛生物科技有限公司提供，終濃度為1 g/mL)，以未表達(dá)的培養(yǎng)上清液為陰性對照，分別于30%比例進(jìn)行降解，降解時間為9 h，然后進(jìn)行高效液相色譜檢測ZEN殘留。

1.2.10 ZEN降解酶降解ZEN對母豬繁殖性能的影響評價

試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計，選擇體重約為200 kg的60頭已經(jīng)妊娠90 d的長×大二元雜交母豬，根據(jù)胎次相近、體重接近健康的妊娠母豬分為3組，每組20頭，1個限位欄飼養(yǎng)1頭母豬。試驗(yàn)分組見表1。試驗(yàn)飼糧參考NRC(2012)標(biāo)準(zhǔn)中妊娠母豬營養(yǎng)需要配制。采用粉狀玉米-豆粕-魚粉型普通全價配合飼糧，基礎(chǔ)飼糧營養(yǎng)水平為消化能13.00 MJ/kg、粗蛋白質(zhì)15.63%、賴氨酸0.67%、鈣0.87%、總磷0.67%、有效磷0.42%和食鹽0.40%。經(jīng)高效液相色譜檢測其ZEN的含量為267 μg/kg，符合國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加1.5 mg/kg ZEN和1.5 mg/kg ZEN+100 mg/kg ZEN降解酶的飼糧。試驗(yàn)豬場按照常規(guī)飼養(yǎng)管理進(jìn)行，每日07:00和17:00飼喂飼糧，自由飲水，防疫等保健措施按照正常運(yùn)行。每天飼喂量為2.5 kg/d，各組飼喂量一致，試驗(yàn)期間母豬自由飲水，在懷孕母豬分娩的當(dāng)天采食量為零，其他飼養(yǎng)管理與保健措施遵循試驗(yàn)豬場的日常管理制度；每天記錄母豬健康狀況。

表1 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)期懷孕母豬測定的相關(guān)繁殖生產(chǎn)性能當(dāng)妊娠母豬在分娩的12 h之內(nèi)完成，試驗(yàn)組和對照組的試驗(yàn)人員記錄每頭母豬的每窩總產(chǎn)仔數(shù)、每窩活產(chǎn)仔數(shù)、每窩死胎數(shù)、每窩木乃伊胎數(shù)，并且在統(tǒng)計窩重數(shù)據(jù)后再稱重每頭仔豬的個體初生重等。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1ZEN-jjm基因的PCR擴(kuò)增

ZEN-jjm基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和分離，其電泳圖譜如圖1，ZEN-jjm基因片段的PCR產(chǎn)物大小是一條長約800 bp的條帶，與NCBI中的目的基因片段大小相符。

圖1 ZEN-jjm基因的PCR電泳圖

2.2pHT01-ZEN-jjm重組表達(dá)載體構(gòu)建和鑒定

電泳圖譜如圖2，挑選的3個克隆樣經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后有2個克隆切出了與目的基因(約800 bp)大小相一致的條帶，經(jīng)測序比對分析表明，成功構(gòu)建了pHT01-ZEN-jjm表達(dá)載體。

圖2 pHT01-ZEN-jjm重組表達(dá)載體的EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切分析電泳圖

2.3ZEN-jjm蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)篩選

篩選結(jié)果如圖3，2株重組枯草芽孢桿菌表達(dá)的蛋白與預(yù)期蛋白分子質(zhì)量大小相當(dāng)(約為29 ku)。

圖3 ZEN-jjm蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析

2.4ZEN降解酶降解ZEN活性檢測

樣品經(jīng)高效液相色譜法檢測結(jié)果如表2，經(jīng)過ZEN污染的玉米在表達(dá)后的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清共同在培養(yǎng)箱中孵育30 min后，ZEN降解效果如表2，降解率接近70%，經(jīng)過90 min的酶解，被污染的玉米中幾乎檢測不到ZEN的殘留，降解率達(dá)到了92%以上。說明表達(dá)的ZEN降解酶能有效地降解ZEN，具有生產(chǎn)使用成本低，使用安全的特點(diǎn)。

表2 高效液相色譜檢測經(jīng)ZEN降解酶降解后樣品中的ZEN殘留

2.5ZEN降解酶降解ZEN對母豬繁殖性能的影響評價

由表3可知，飼喂添加1.5 mg/kg ZEN的飼糧后，妊娠期母豬分娩的死胎數(shù)和弱仔數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，且總產(chǎn)仔數(shù)和仔豬初生重與

對照組相比也出現(xiàn)降低(P>0.05)；與試驗(yàn)1組相比，飼喂添加1.5 mg/kg ZEN+100 mg/kg ZEN降解酶的飼糧可顯著降低ZEN造成的死胎數(shù)和弱仔豬數(shù)(P<0.05)。

表3 ZEN以及ZEN降解酶對母豬妊娠期繁殖性能的影響

3 討 論

ZEN不僅作為食品安全中的重大隱患[11]，而且對畜牧業(yè)尤其是獸醫(yī)產(chǎn)科疾病影響巨大，礦物質(zhì)(如蒙脫石、硅鋁酸鹽、酵母細(xì)胞壁提取物等)在吸附和微生物(芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌等)在降解ZEN等發(fā)揮了重要作用[3]。Bakutis等[8]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母等(酵母細(xì)胞壁提取物)的主要成分是低聚葡聚糖類產(chǎn)品，能較好地吸附清除ZEN。Kakeya等[9]發(fā)現(xiàn)粉紅螺旋聚孢霉(Clonostachysrosea)有2種類型的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，即帚狀分生孢子梗和輪枝狀分生孢子梗，主要依靠其所分泌的胞外降解酶類，經(jīng)過分離純化能降低ZEN在生殖系統(tǒng)的毒性。ZEN對線粒體代謝、等離子體膜透性和前列腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期有影響。在100和0.3 nm的濃度中，ZEN導(dǎo)致線粒體的氧化活性下降，乳酸脫氫酶釋放，凋亡誘導(dǎo)和G0/G1階段的細(xì)胞數(shù)目增加[12]。ZEN是一類2,4-二羥基苯甲酸的內(nèi)酯化合物，破壞其酯環(huán)可去除ZEN的毒性，把ZEN降解為沒有類雌激素毒性的表達(dá)產(chǎn)物[9]。

Takahashi-Ando等[13]的研究結(jié)果表明，經(jīng)過基因克隆、載體構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)的ZEN內(nèi)酯水解酶zhd101，在37～45 ℃的水浴鍋內(nèi)，把含有ZEN標(biāo)準(zhǔn)品的溶液pH調(diào)整為10.5時，具有很強(qiáng)的降解ZEN毒性的活性，而且該反應(yīng)是一種不可逆滅活。內(nèi)酯水解酶zhd101對5種同源ZEN有效，但是對5種同源的ZEN降解效果不完全一致[14]。Molnar等[14]經(jīng)過了大量的實(shí)驗(yàn)室研究，發(fā)布了一種新的酵母菌株——毛孢子菌屬，可以使ZEN降解為二氧化碳和其他無毒ZEN代謝產(chǎn)物，這能否應(yīng)用在畜禽、水產(chǎn)等動物的全價配合飼料中做為ZEN的脫毒劑使用，還需生產(chǎn)一線的確切驗(yàn)證。Mokoena等[15]報道了經(jīng)過96 h的液體生物發(fā)酵，乳酸菌在發(fā)酵過程中也可以顯著地降解谷物如玉米、豆粕、大麥、麩皮等原料中68%～75%的ZEN。在本試驗(yàn)中我們用pHT01表達(dá)載體降解ZEN的蛋白酶，因?yàn)榭莶菅挎邨U菌自身蛋白干擾少，而且枯草芽孢桿菌生長環(huán)境多樣，可利用的營養(yǎng)物質(zhì)種類十分豐富，其自身含有豐富的產(chǎn)酶系統(tǒng)，具備目的蛋白表達(dá)量高的應(yīng)用潛力，并保持生物活性等優(yōu)點(diǎn)[16]，使ZEN降解酶的使用更加安全，是更有效和更低成本地降解ZEN毒素的方法。

有研究表明ZEN中毒對豬類的健康影響較大，引起生殖器官功能性的變化。Minervini等[17]從斷奶后32日齡開始給小仔豬飼喂含9 mg/kg ZEN的飼糧，30 d后經(jīng)過檢測，仔豬的繁殖系統(tǒng)出現(xiàn)了異常，具體表現(xiàn)為卵母細(xì)胞不能正常成熟，而且有的仔豬的染色體出現(xiàn)異常現(xiàn)象。Jadamus等[18]連續(xù)3個繁殖周期給妊娠的經(jīng)產(chǎn)母豬飼喂含180 g/kg ZEN的全價配合飼糧，斷奶后的母豬表現(xiàn)為返情率升高，懷孕期的母豬流產(chǎn)率明顯升高；在第1個繁殖周期，表現(xiàn)出提早發(fā)情的異常現(xiàn)象。Jan Obremski等[19]給懷孕期的母豬飼喂0.2和0.4 mg/kg BW ZEN，飼喂為期1周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加ZEN組的母豬出現(xiàn)卵泡閉鎖，甚至有的母豬出現(xiàn)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重的出現(xiàn)了子宮和輸卵管細(xì)胞增殖。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，飼糧中含有微量的ZEN(1.5 mg/kg)就可以能顯著降低母豬健康活胎的數(shù)量和并顯著提高弱仔豬發(fā)生率。這與飼糧中低劑量ZEN及其代謝產(chǎn)物擾亂內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響動物的發(fā)情周期、排卵與胚胎附植有關(guān)[19-20]。但是，添加ZEN降解酶后，試驗(yàn)2組的總產(chǎn)仔數(shù)、死胎數(shù)、弱仔數(shù)、仔豬初生重等并沒有出現(xiàn)明顯的負(fù)面效應(yīng)，表明ZEN降解酶能夠有效地降解ZEN對母豬生產(chǎn)性能和繁殖性能的多種毒害作用。

4 結(jié) 論

ZEN可以引起母豬妊娠期繁殖性能的降低，低劑量ZEN(1.5 mg/kg)污染就可以能顯著降低母豬活胎的數(shù)量和并顯著提高弱仔豬發(fā)生率，對母豬的繁殖性能產(chǎn)生毒害作用。

本試驗(yàn)中用基因表達(dá)合成zhd101基因的轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌能把高濃度的ZEN(1.5 mg/kg)去除。從母豬的總產(chǎn)仔數(shù)、死胎數(shù)、弱仔數(shù)、仔豬出生重的指標(biāo)評價，表明構(gòu)建的ZEN降解酶能夠有效地降解ZEN對母豬妊娠期生產(chǎn)性能和繁殖性能的毒害作用。

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*Corresponding author, professor, E-mail: zhangyong@gsau.edu.cn

ExpressionofZearalenoneDegradingEnzymeinBacillussubilisandItsEffectsonReproductivePerformanceofSows

WANG Xiangsheng1SUN Yaning1,2RUAN Chongmei1ZHANG Quanwei3ZHANG Yong1*HU Xiaofei2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgricultureUniversity,Lanzhou730070,China; 2.HenanAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofAnimalImmunologyoftheMinistryofAgriculture,Zhengzhou450002,China; 3.CollegeofLifeScienceandTechnology,GansuAgricultureUniversity,Lanzhou730070,China)

The purpose of this study was to establish an expressing system of zearalenone (ZEN) degrading enzyme gene (ZEN-jjm) inBacillussubtilis, and to determine the biodegradation activity and effect of its expression product on reproductive performance of sows. TheZEN-jjmgene was cloned and the recombinant expression plasmid was constructed by ligation clonedZEN-jjmandpHT01 vector digested with EcoRⅠand NotⅠ enzymes, and then transformed intoBacillussubilis. Expression of ZEN-jjm protein inBacillussubiliswas analyzed by dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). And the degrading activity of ZEN-jjm protein was determined by high performance liquid chromatography (HPLC). The effects of ZEN degrading enzyme on reproductive performance of sows were evaluated. The results of double enzyme digestion and DNA sequencing demonstrated thatZEN-jjmwas inserted intopHT01. The SDS-PAGE showed that oneBacillussubilisstrain with high-level expression was obtained, and the size of the expressed protein was about 29 ku. The HPLC result illustrated that the expressed ZEN-jjm protein could effectively degrade ZEN. The evaluation results of reproductive performance of sows indicated that the expressed ZEN-jjm protein could significantly relieve the toxicity for sows caused by ZEN (P<0.05). In conclusion: 1) theZEN-jjmexpression vector is successfully constructed and the ZEN-jjm protein is expressed inBacillussubtilisin this study. 2) The expressed ZEN-jjm protein has the biological activity of degrading ZEN. 3) ZEN-jjm protein can significantly reduce the harm of ZEN on reproductive performance of sows when it is added in the feed.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(11)：4019-4025]

zearalenone;ZEN-jjmgene;Bacillussubilis; sows

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.11.023

S816

A

1006-267X(2017)11-4019-07

2017-04-11

“十二五”國家科技支撐計劃“畜禽產(chǎn)品安全監(jiān)控和檢測技術(shù)研究與示范”(2014BAD13B05)

王相生(1972—)，男，河南濮陽人，博士研究生，從事臨床獸醫(yī)學(xué)產(chǎn)科方向的研究。E-mail: wxs201302@163.com

*通信作者:張 勇，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: zhangyong@gsau.edu.cn

(責(zé)任編輯 田艷明)