丁向彬，張蔚然，張俊星，王軼敏，劉新峰，郭宏

?

lncRNA-HZ5對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化的調(diào)控作用研究

丁向彬，張蔚然，張俊星，王軼敏，劉新峰，郭宏

（天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

為探究lncRNA對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化過程的影響，選取前期測序結(jié)果中在牛肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化前后差異表達且表達豐度較高的lncRNA-HZ5進行成肌分化調(diào)控研究，利用qRT-PCR技術(shù)對其在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化前后的表達變化進行檢測，然后設(shè)計合成lncRNA-HZ5的siRNA，轉(zhuǎn)染牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，抑制lncRNA-HZ5表達，之后將肌衛(wèi)星細(xì)胞進行成肌分化誘導(dǎo)，通過肌管形成狀態(tài)和MHC表達水平檢測分析lncRNA-HZ5表達水平改變對肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化過程的影響。結(jié)果表明：lncRNA-HZ5在成肌分化前后的表達存在顯著差異，干擾lncRNA-HZ5表達后的肌衛(wèi)星細(xì)胞經(jīng)成肌分化誘導(dǎo)，肌管數(shù)量及MHC的表達量均顯著高于對照組，說明下調(diào)lncRNA-HZ5表達可以顯著促進肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化過程。本研究結(jié)果表明，lncRNA-HZ5可以負(fù)調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化過程。

lncRNA-HZ5；牛；骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞；成肌分化

肌肉的生長發(fā)育過程受遺傳因素及各種調(diào)控因子共同影響。大量研究表明，非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA）在肌肉發(fā)育過程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。Long non-coding RNA（lncRNA）是一類長度大于200 nt的非編碼RNA。已有研究表明，lncRNA具有調(diào)控特定生理和病理學(xué)過程的生物功能，部分lncRNA參與了X染色體的失活、基因印記、細(xì)胞多能性維持和細(xì)胞衰亡等重要生命活動[1-5]。研究表明，lncRNA在肌肉發(fā)育和肌細(xì)胞增殖與分化中均發(fā)揮了關(guān)鍵性調(diào)控作用[6-7]。目前，大多數(shù)lncRNA的功能尚不明確，且缺乏在牛肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化中相關(guān)lncRNA的研究報道。鑒于這種情況，筆者在前期研究中通過RNA-seq技術(shù)，對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化過程中差異表達的lncRNA進行了篩選，本研究從這些差異表達lncRNA出發(fā)，選取測序結(jié)果中表達豐度較高、分化前后差異倍數(shù)較大的lncRNA-HZ5進行成肌分化調(diào)控研究，探究lncRNA-HZ5在牛肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化中的作用，以便更深入地了解lncRNA在牛肌肉發(fā)育和肌細(xì)胞增殖分化過程中的調(diào)控作用，為肉牛分子育種和肌損傷修復(fù)研究提供參考。

1 材料

1.1 試劑

lncRNA-HZ5的siRNA由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成；Opti-MEM? Medium、TRIzol、胎牛血清（FBS）、馬血清（HS）購自Life Technologies Corporation；X-tremeGENE Transfection Reagent購自Roche公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自Thermo scientific公司；膠原酶Ⅱ購自Sigma Aldrich Corporation；0.25%胰蛋白酶溶液、RIPA buffer購自北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑購自Takara biotechnology Corporation；All-in-OneTMqPCR Mix購自GeneCopoeia；鼠抗MHC抗體購自美國DSHB；鼠抗GAPDH、HRP標(biāo)記的goat anti-mouse IgG二抗抗體購自北京中杉金橋公司；高靈敏ECL發(fā)光試劑購自上海生物工程有限公司。

1.2 儀器

細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋電機公司）；倒置顯微鏡（德國Leica）；Light Cycler? 96實時熒光定量PCR儀（LightCycler 96）（瑞士Roche公司）；PowerPac Basic電泳儀、Mini-Protean Tetra、MiniTyans-Blot Cell、電泳凝膠成像系統(tǒng)ChemiDoc XRS＋（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化

牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)和成肌誘導(dǎo)分化參照本實驗室已建立的方法進行[8-10]。采用膠原酶和胰酶聯(lián)合消化法分離肌衛(wèi)星細(xì)胞，將5月齡牛胎兒的后肢肌肉用眼科剪充分剪碎，用5 mL 0.2%膠原酶II在37 ℃水浴鍋中消化1 h，0.25%胰酶消化30 min，將上述混合液依次過100目、200目和400目細(xì)胞篩，離心收集細(xì)胞后用培養(yǎng)基重懸，接種到培養(yǎng)皿中，在含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%融合時，加入含有2%馬血清的DMEM培養(yǎng)基進行體外成肌誘導(dǎo)分化。

2.2 lncRNA-HZ5染色體定位分析

登陸Ensembl數(shù)據(jù)庫（http://asia.ensembl.org/ index.html），將lncRNA-HZ5序列與牛全基因組序列進行比對，分析lncRNA-HZ5在染色體上的位置。

2.3 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化前后lncRNA- HZ5表達的qRT-PCR檢測

為驗證測序結(jié)果的可靠性，提取未分化牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和分化后肌管的RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過qRT-PCR技術(shù)檢測肌衛(wèi)星細(xì)胞分化前后lncRNA-HZ5的表達變化。RNA反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR檢測根據(jù)本實驗室已建立的方法進行[8,10]。GAPDH作為lncRNA-HZ5 qRT-PCR檢測內(nèi)參，qRT-PCR引物見表1。

表1 lncRNA-HZ5 qRT-PCR檢測引物序列

2.4 lncRNA-HZ5 siRNA設(shè)計及干擾效果檢測

設(shè)計合成lncRNA-HZ5的siRNA，將其與陰性對照按照說明書推薦濃度50 nmol/L分別轉(zhuǎn)染牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。將牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分別接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用生長培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長密度為70%～80%時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染，并在轉(zhuǎn)染前1天將培養(yǎng)基更換成無抗生素的生長培養(yǎng)基。根據(jù)試劑說明書推薦濃度，在進行轉(zhuǎn)染時，先將培養(yǎng)基更換成無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，將lncRNA-HZ5 siRNA及陰性對照分別混合于50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中，同時將1 μL羅氏轉(zhuǎn)染試劑混合于50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，分別靜置5 min，將含lncRNA-HZ5 siRNA及陰性對照的50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基分別加入到含羅氏轉(zhuǎn)染試劑的Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕柔混勻后，混合液靜置20 min，將混合液均勻滴加到35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，滴加混合液體積以達到相應(yīng)的終濃度為準(zhǔn)。轉(zhuǎn)染lncRNA-HZ5 siRNA及陰性對照24 h后，通過qRT-PCR技術(shù)檢測干擾lncRNA-HZ5表達后肌衛(wèi)星細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-HZ5的表達變化，操作方法同2.3。

2.5 肌管形成狀態(tài)觀察及MHC蛋白水平的Western Blot檢測

在35 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，轉(zhuǎn)染lncRNA-HZ5的siRNA-3，24 h后將培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，對肌衛(wèi)星細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化，倒置顯微鏡觀察肌管形成狀態(tài)，Western Blot檢測肌球蛋白重鏈（MHC）蛋白表達水平。利用RIPA蛋白裂解液裂解并收集轉(zhuǎn)染lncRNA-HZ5 siRNA及陰性對照的全蛋白質(zhì)，蛋白含量測定及Western Blot操作參照本實驗室已建立的方法進行[8,10]。在進行蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳試驗時，蛋白上樣量為40 μg，上樣蛋白分別與鼠抗MHC一抗（1∶100）和 鼠抗GAPDH一抗（1∶500）在4 ℃條件下孵育過夜，然后與用TBST稀釋二抗（HRP標(biāo)記的goat anti-mouse IgG二抗）在室溫下孵育1 h，將膜在室溫下暴露于增強化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑中2 min。使用Image Lab 5.0軟件（Bio-Rad）進行條帶強度的檢測和定量。通過將目的條帶的灰度除以來自相同樣品上的相同印跡上的內(nèi)參蛋白灰度，將條帶歸一化。

2.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)資料分析以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±）表示，通過檢驗比較試驗組與對照組差異，＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 lncRNA-HZ5染色體定位分析

結(jié)合前期RNA-seq結(jié)果，從肌衛(wèi)星細(xì)胞分化前后差異表達的lncRNA中選取表達豐度較高、分化前后差異倍數(shù)較大的lncRNA-HZ5進行研究。lncRNA-HZ5的測序長度為4 853 bp，將lncRNA- HZ5的序列在Ensembl數(shù)據(jù)庫進行檢索，發(fā)現(xiàn)lncRNA-HZ5位于8號染色體（圖1）。

圖1 lncRNA-HZ5的染色體定位分析

3.2 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化前后lncRNA- HZ5表達檢測

為驗證測序結(jié)果的可靠性，本研究提取未分化牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞及分化后肌管的RNA，通過qRT-PCR檢測分化前后lncRNA-HZ5的表達變化，試驗結(jié)果見圖2。

圖2 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化前后lncRNA-HZ5表達的qRT-PCR檢測

（注：MSCs為未分化肌衛(wèi)星細(xì)胞；myotube為分化后肌管；**與未分化肌衛(wèi)星細(xì)胞比較，＜0.01）

由圖2可知，與未分化肌衛(wèi)星細(xì)胞相比，分化后肌管中l(wèi)ncRNA-HZ5的表達量極顯著升高，上調(diào)了17倍。試驗結(jié)果表明，lncRNA-HZ5在肌衛(wèi)星細(xì)胞分化前后差異表達倍數(shù)較高，提示它們可能在牛肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

3.3 lncRNA-HZ5 siRNA設(shè)計及干擾效果檢測

根據(jù)lncRNA-HZ5堿基序列，采用siRNA設(shè)計軟件設(shè)計出5條siRNA（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、siRNA-5），將lncRNA-HZ5的上述5條siRNA分別采用脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，采用qRT-PCR方法檢測lncRNA-HZ5的表達，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，siRNA-1和siRNA-3對lncRNA-HZ5的表達具有明顯的干擾作用，顯著降低了lncRNA-HZ5的表達水平（＜0.05），可以用于lncRNA-HZ5的表達調(diào)控研究。

圖3 lncRNA-HZ5siRNA設(shè)計及干擾效果檢測

（注：轉(zhuǎn)染lncRNA-HZ5 siRNA 24 h后qRT-PCR檢測lncRNA-HZ5的表達變化，*與對照組比較，0.05）。

3.4 干擾lncRNA-HZ5表達對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化的影響

為檢驗lncRNA-HZ5表達水平改變對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化的影響，本研究將lncRNA- HZ5的干擾RNA siRNA-3轉(zhuǎn)染牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，24 h后將培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，對肌衛(wèi)星細(xì)胞進行成肌分化誘導(dǎo)。結(jié)果表明，與對照相比，轉(zhuǎn)染了siRNA-3的肌衛(wèi)星細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化48 h后，形成的肌管數(shù)量較多，并且較粗壯（圖4 A）。Western blot檢測表明，干擾lncRNA- HZ5表達后MHC的表達水平要顯著高于對照組（圖4B）。試驗結(jié)果表明，下調(diào)lncRNA-HZ5能夠促進肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化，說明lncRNA-HZ5可以負(fù)調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化過程。

圖4 干擾lncRNA-HZ5對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化的調(diào)控作用

（注：A為轉(zhuǎn)染siRNA-3后牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化過程的影響；B為轉(zhuǎn)染siRNA-3后對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化后肌球蛋白重鏈（MHC）表達水平的影響；*與對照組比較，0.05）

4 討論

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的非編碼RNA分子，可以在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種層面上調(diào)控基因的表達[11]。1ncRNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能。2002年，Okazaki等人在小鼠的全長cDNA測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了lncRNA[12]，隨后越來越多有生物功能的lncRNAs被報道[13-14]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，動物轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)鑒定出了數(shù)以萬計的lncRNA[15]。越來越多的研究表明，lncRNAs具有調(diào)控特定生理和病理學(xué)過程的生物功能[1-5]。在肌肉發(fā)育方面，Mueller 等利用芯片技術(shù)分析了小鼠成肌細(xì)胞和分化后肌管中的lncRNA，在肌管中發(fā)現(xiàn) 9 個上調(diào) 10 倍的 lncRNA，其中肌肉特異性表達的 MUNC 位于上游 5 kb 處，下調(diào) MUNC 可以抑制成肌分化，體內(nèi)敲除 MUNC引起小鼠肌肉再生障礙，表明 MUNC與肌細(xì)胞發(fā)育分化具有密切的相關(guān)性[16]；Ballarino等通過分析小鼠成肌細(xì)胞增殖和分化時期的轉(zhuǎn)錄本，發(fā)現(xiàn) lnc-31在增殖期C2C12細(xì)胞中高表達，成肌分化后明顯下調(diào)，lnc-31的表達參與維持成肌細(xì)胞的增殖，并可以抑制細(xì)胞分化[17]。已有研究結(jié)果說明，在成肌分化過程中，lncRNA確實發(fā)揮了重要調(diào)控作用。

到目前為止，絕大部分lncRNA功能仍是未知的，只有小部分的lncRNA功能被研究。骨骼肌的生長發(fā)育是一個受多種調(diào)節(jié)因子和信號通路共同調(diào)控的極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，肌衛(wèi)星細(xì)胞在肌肉生長發(fā)育和肌肉損傷修復(fù)中都發(fā)揮了重要作用。目前，在牛肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化中相關(guān)長鏈非編碼RNA的相關(guān)研究鮮見報道，在前期研究中，課題組通過RNA-seq技術(shù)對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化過程中差異表達的lncRNA進行了鑒定，本研究從這些差異表達lncRNA中選擇表達豐度較高的lncRNA-HZ5進行成肌分化調(diào)控研究。首先，使用qRT-PCR檢測了肌衛(wèi)星細(xì)胞分化前后lncRNA-HZ5的表達變化，結(jié)果表明，lncRNA-HZ5在肌衛(wèi)星細(xì)胞分化前后確實存在差異表達，且差異倍數(shù)較大，提示它可能在牛肌肉分化過程中發(fā)揮了調(diào)控作用。為探究lncRNA-HZ5對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化的作用，本研究設(shè)計出lncRNA- HZ5的siRNA，轉(zhuǎn)染肌衛(wèi)星細(xì)胞干擾lncRNA-HZ5的表達，試驗結(jié)果表明，抑制lncRNA-HZ5的表達可以促進牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化過程，說明lncRNA-HZ5可以負(fù)調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化過程。本研究結(jié)果可以為牛肌肉發(fā)育和肌細(xì)胞增殖分化中的lncRNA調(diào)控機制研究提供參考。

[1] Lee J T. Gracefully ageing at 50，X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control[J].，2011，12: 815-826.

[2] Mattick J S. RNA regulation: a new genetics[J].，2004，5: 316-323.

[3] Amaral P P，Mattick J S. Noncoding RNA in development[J].，2008，19: 454-492.

[4] Taft R J，Pheasant M，Mattick J S. The relationship between non-protein-coding DNA and eukaryotic complexity[J].，2007，29: 288-299.

[5] Wapinski O，Chang H Y. Long noncoding RNAs and human disease[J].，2011，21: 354-361.

[6] Watanabe T，Sato T，Amano T，et al.，a non-coding RNA，is required for normal growth and skeletal developmentin mice[J].，2008，237（12）：3738-3748.

[7] Cesana M，Cacchiarelli D，Legnini I，et al. A Long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA[J].，2011，147（2）：358-369.

[8] Zhang W R，Zhang H N，Wang Y M，et al. miR-143 regulates proliferation and differentiation of bovineskeletal muscle satellite cells by targeting IGFBP5[J].，2017，53（3）：265-271.

[9] 王軼敏，代陽，劉新峰，等. 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離鑒定和誘導(dǎo)分化[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（7）：142-147.

[10] Dai Y，Wang Y M，Zhang W R，et al. The role of microRNA-1 and microRNA-206 in the proliferation and differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells[J].，2016，52（1）：27-34.

[11] Mercer T R，Dinger M E，Mattick J S. Long non-coding RNAs: insights into functions[J].，2009，10（3）：155-159.

[12] Okazaki Y，F(xiàn)uruno M，Kasukawa T，et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60，770 full-length cDNAs[J].，2002，420（6915）：563-573.

[13] Sleutels F，Zwart R，Barlow D P. The non-coding Air RNA is required for silencing autosomal imprinted genes[J].，2002，415：810-813.

[14] Willingham A T，Orth A P，Batalov S，et al. A strategy for probing the function of noncoding RNAs finds a repressor of NFAT[J].，2005，309: 1570-1573.

[15] Cabili M N，Trapnell C，Goff L，et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses[J].，2011，25: 1915-1927.

[16] Mueller A C，Cichewicz M A，Dey B K，et al. MUNC，a long noncoding RNA that facilitates the function ofin skeletal myogenesis[J].，2015，35（3）：498-513.

[17] Ballarino M，Cazzella V，D'Andrea D. Novel Long noncoding RNAs（lncRNAs）in myogenesis: a miR-31 overlapping lncRNA transcript controls myoblast differentiation[J].，2015，35（4）：728-736.

責(zé)任編輯：宗淑萍

Effects of lncRNA-HZ5 on Myogenic Differentiation Process of Bovine Skeletal Muscle Satellite Cells

DING Xiang-bin, ZHANG Wei-ran, ZHANG Jun-xing, WANG Yi-min, LIU Xin-feng, GUO Hong

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to investigate the effects of lncRNA in the myogenic differentiation process of bovine skeletal muscle satellite cells, a highly and differentially expressed lncRNA（lncRNA-HZ5）detected by RNA-seq technique was selected for further research. The expression changes of lncRNA-HZ5 during bovine muscle satellite cells myogenic differentiation process were identified by qRT-PCR. The expression of lncRNA-HZ5 in muscle satellite cells were down regulated by siRNA, then the cells were transferred to differentiation medium, the myogenic process were evaluated by myotube formation and MHC expression levels. The results showed that the expression of lncRNA-HZ5 were significantly changed during bovine muscle satellite cells myogenic differentiation process. The myotube number and MHC expression levels of siRNA transferred group were significantly higher than that of control group. It was found that inhibition of lncRNA-HZ5 expression using siRNA can promoting the myogenic differentiation process of bovine skeletal muscle satellite cells.

lncRNA-HZ5; bovine; skeletal muscle satellite cells; myogenic differentiation

1008-5394（2017）03-0064-05

S823

A

2017-05-05

國家自然科學(xué)基金資助項目“牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化相關(guān)miRNAs的鑒定和功能研究”（31201021）；天津市“131”創(chuàng)新型人才培養(yǎng)計劃第二層次人選資助計劃項目（無編號）

丁向彬（1978-），男，河南南陽人，副教授，博士，研究方向為動物細(xì)胞工程與繁殖生物技術(shù)。E-mail：xiangbinding@163.com。