徐赟霞，趙良煒，吳艷輝，張麗，崔露文

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天津地區(qū)副溶血弧菌分離株血清型、部分毒力基因的分布和耐藥性調(diào)查

徐赟霞，趙良煒，吳艷輝，張麗，崔露文

（天津市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 300221）

為了解天津市水產(chǎn)品中副溶血弧菌的主要血清型、毒力因子攜帶情況和耐藥性情況。調(diào)查了2015年天津地區(qū)海產(chǎn)品中副溶血弧菌的污染狀況，并分析了不同來(lái)源的副溶血弧菌主要毒力基因、的分布情況及血清分型，對(duì)不同血清型的副溶血弧菌進(jìn)行了耐藥性試驗(yàn)。2015年從天津地區(qū)9個(gè)區(qū)縣采集樣品共計(jì)73份，共分離出38株副溶血弧菌，分離率達(dá)52%，毒力相關(guān)基因分析結(jié)果顯示，基因攜帶率為13.2%，陽(yáng)性率為5.3%；血清分型結(jié)果顯示，共分出O1、O3、O10三個(gè)血清型，其中O1血清型占60%，為主要的血清型；對(duì)不同血清型進(jìn)行了9種藥物的MIC試驗(yàn)，結(jié)果顯示，對(duì)喹諾酮類(lèi)（煙酸諾氟沙星、乳酸諾氟沙星）比較敏感，對(duì)磺胺類(lèi)的磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶鈉、新諾明和氨基糖苷類(lèi)的硫酸新霉素不敏感，對(duì)其他抗生素也產(chǎn)生不同程度的耐藥，不同血清型的副溶血弧菌對(duì)藥物的敏感性沒(méi)有顯著差異，在治療該菌引起的疾病時(shí)可以不考慮血清型。結(jié)果提示，天津地區(qū)海產(chǎn)品副溶血弧菌檢出率較高，部分菌株攜帶毒力基因，研究結(jié)果可為深入研究副溶血弧菌的致病性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

副溶血弧菌；血清型；毒力基因；耐藥性

副溶血弧菌（）是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，是危害海水養(yǎng)殖業(yè)的主要病原菌之一[1]，可引起人類(lèi)急性胃炎、創(chuàng)傷感染和敗血癥[2]。有研究表明，與副溶血弧菌致病力相關(guān)的主要毒力因子主要為溶血素類(lèi)，包括耐熱直接溶血素（thermostable direct hemolysin，TDH）、不耐熱直接溶血素（thermolabile hemolysin，TLH）和TDH-相關(guān)溶血素（TDH-related hemolysin，TRH）[3]。耐熱直接溶血素（TDH）和TDH相關(guān)溶血素（TRH）分別由和基因編碼，它們被認(rèn)為是副溶血弧菌的主要致病因子。以菌體脂多糖O抗原和莢膜K抗原為基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，任何細(xì)菌都存在多種血清型，同種細(xì)菌存在較為廣泛的血清同源性，不僅具有一定的血清流行病學(xué)意義，且對(duì)細(xì)菌疾病的特異免疫診斷與預(yù)防也具有一定的參考價(jià)值。由于海水養(yǎng)殖的衛(wèi)生條件難以控制，大量的抗菌藥物一直用于治療及預(yù)防細(xì)菌性感染，結(jié)果造成水環(huán)境中耐藥微生物的出現(xiàn)、耐藥性的增加及耐藥基因在陸生微生物與人源病原菌的轉(zhuǎn)移傳播。副溶血弧菌對(duì)抗菌藥物也逐漸產(chǎn)生了多種耐藥性，對(duì)我國(guó)食品安全及人類(lèi)健康存在潛在的威脅，所以有必要開(kāi)展副溶血弧菌耐藥情況的調(diào)查。本研究對(duì)2015年從天津9個(gè)區(qū)縣患病的魚(yú)蝦樣品中分離出來(lái)的38株副溶血弧菌進(jìn)行血清分型、毒力基因檢測(cè)和耐藥性調(diào)查，了解天津市海產(chǎn)品中副溶血弧菌的毒力和耐藥性，為該病的防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株

2015年，從天津9個(gè)區(qū)縣海水養(yǎng)殖區(qū)域共采集患病的魚(yú)蝦樣品73份，分離出副溶血弧菌38株，其中，所分離樣品根據(jù)GB4789.7—2013，用堿性蛋白胨水（APW）增菌培養(yǎng)基預(yù)增菌，在 TCBS 選擇性培養(yǎng)基上挑取綠色疑似菌落，采用生化鑒定和16SrRNA相結(jié)合的方法綜合判定是否為副溶血弧菌。副溶血標(biāo)準(zhǔn)菌株CGMCC1.1997購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌株保藏中心（CGMCC）。

1.2 方法

1.2.1 毒力基因檢測(cè)

1.2.1.1 引物合成

本試驗(yàn)所用引物參照FDA 2004 Bacteriological Analytical Manual Online Chapter 9推薦的引物，由金唯智生物科技有限公司合成（表1）。

表1 PCR反應(yīng)引物對(duì)和預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度列表

1.2.1.2 細(xì)菌基因組提取

參照 Abolmaaty 改良方法[4]提取供試株細(xì)菌基因組DNA。

1.2.1.3 副溶血弧菌主要毒力基因的PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×buffer 2.5 μL；Mg2+（25 mmol/L）1.5 μL；dNTP 2 μL；相應(yīng)引物F（20 um）1 μL，R（20 um）1 μL；ddH2O 16.35 μL；（5 U/μL，TaKaRa）0.15 μL；DNA模板0.5 μL。基因擴(kuò)增反應(yīng)條件見(jiàn)表2。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照記錄結(jié)果。

表2 不同毒力基因的反應(yīng)程序

1.2.2 副溶血弧菌血清分型

副溶血弧菌血清分型按照GB4789.7—2013中所述方法進(jìn)行。所用血清購(gòu)自天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司，在有效期內(nèi)使用。

1.2.3 副溶血弧菌藥物敏感性測(cè)定

1.2.3.1 藥物標(biāo)準(zhǔn)品稀釋

按照表3的方法對(duì)供試9種藥物進(jìn)行溶解，最后定容至50 mL，使藥物終濃度達(dá)到1 mg/mL。

表3 抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法

1.2.3.2 微量稀釋法

按 WHO 推薦的肉湯微量稀釋法進(jìn)行，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）標(biāo)準(zhǔn)[5]。以副溶血弧菌CGMCC1.1997為質(zhì)控菌株，分別測(cè)定硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素、甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺嘧啶鈉、新諾明、磺胺二甲嘧啶、乳酸諾氟沙星、煙酸諾氟沙星9種抗菌藥物對(duì)分離鑒定所得的副溶血弧菌的MIC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血弧菌在我市污染狀況調(diào)查

2015年，共采集來(lái)自天津9個(gè)區(qū)縣海水養(yǎng)殖區(qū)域患病的魚(yú)蝦樣本73份，共分離出副溶血弧菌38株，各個(gè)區(qū)縣的副溶血弧菌檢出率分別為東麗52.9%（9/17），西青77.8%（7/9）、漢沽50.0%（6/12），寶坻50.0%（5/10），靜海50.0%（3/6），大港37.5%（3/8），津南33.3%（3/9），寧河100.0%（1/1），武清100.0%（1/1）。

在38株副溶血弧菌中，5月份分離出1株，6月份分離出3株，7月份分離出17株，8月份分離出10株，9月份分離出7株。

2.2 副溶血弧菌毒力相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)38株副溶血弧菌分離株的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所有菌株均攜帶TLH基因（38/38）（圖1），與相關(guān)報(bào)道的一致[6]，證明該基因具有種的特異性，、基因攜帶率分別為5.3%（2/38）（圖2）和13.2%（5/38）（圖3）。其中攜帶TRH的兩株副溶血弧菌均來(lái)自東麗區(qū)，而攜帶基因的副溶血弧菌，3株來(lái)自津南區(qū)，2株來(lái)自大港區(qū)。

圖1 部分代表性副溶血弧菌分離株tlh基因的PCR檢測(cè)

圖2 副溶血弧菌分離株trh基因的PCR檢測(cè)

圖3 副溶血弧菌分離株tdh基因的PCR檢測(cè)

2.3 副溶血弧菌分離株血清學(xué)分型結(jié)果

對(duì)38株副溶血弧菌分離株進(jìn)行了血清學(xué)分型，結(jié)果分出3個(gè)血清型，分別為O1群占60.5%（23/38），O3群占5.3%（2/38），O10群占26.3%（10/38），有7.9%（3/38）的菌株出現(xiàn)自凝；根據(jù)K多價(jià)血清又分為O1：KⅢ、O1：KⅣ、O1：KⅤ、O3：KⅢ、O10：KⅢ和O10：KⅤ，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 試驗(yàn)菌株的血清學(xué)分布

注：表中KUT表示K抗原未分型

2.4 副溶血弧菌體外抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

采用肉湯微量稀釋法，對(duì)2015年從天津分離出來(lái)的35株不同血清型的副溶血弧菌進(jìn)行了9種抗菌藥物的藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。2015年分離出來(lái)的副溶血弧菌對(duì)喹諾酮類(lèi)（煙酸諾氟沙星、乳酸諾氟沙星）比較敏感，對(duì)磺胺類(lèi)的磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶鈉、新諾明和氨基糖苷類(lèi)的硫酸新霉素不敏感，對(duì)其他抗生素也產(chǎn)生不同程度的耐藥。從地區(qū)上看，只有4個(gè)地區(qū)（寶坻區(qū)、大港區(qū)、津南區(qū)、漢沽區(qū)）對(duì)甲砜霉素敏感，存在著地區(qū)差異，其他抗生素所呈現(xiàn)出來(lái)的敏感程度沒(méi)有顯著差異（表6）。

表5 天津地區(qū)海產(chǎn)品不同血清型的VP分離株耐藥性檢測(cè)結(jié)果

表6 2015年天津地區(qū)海產(chǎn)品VP分離株耐藥性檢測(cè)結(jié)果

3 討論

本研究結(jié)果顯示，天津地區(qū)副溶血弧菌分離率為52%，低于國(guó)內(nèi)外報(bào)道中的68.12%和78.6%[7-8]，檢出率與樣品類(lèi)型有關(guān)，一般貝類(lèi)、蝦、蟹檢出率較高，而魚(yú)的分離率較低[9]。試驗(yàn)調(diào)查收集的樣品主要為養(yǎng)殖季節(jié)患病的魚(yú)和蝦，故分離率比報(bào)道的要低。從地區(qū)分布來(lái)看，除了薊縣，其他幾個(gè)地區(qū)都分離出副溶血弧菌，說(shuō)明副溶血弧菌在我市分布比較廣泛。薊縣養(yǎng)殖水源來(lái)自北部山區(qū)積存的雨水，鹽度常年較低，低鹽度的養(yǎng)殖水體不利于副溶血弧菌的生存，故未分離獲得副溶血弧菌。趙峰等[10]對(duì)我國(guó)東部沿海城市貝類(lèi)中副溶血弧菌的分布情況及其血清型和分子特征進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)貝類(lèi)中季節(jié)分布明顯，夏季顯著高于其他季節(jié)（＜0.05），這與本試驗(yàn)調(diào)查結(jié)果顯示的7～9月份分離率較其他月份高的結(jié)果相一致，我市2013-2014年副溶血弧菌的分離情況也是7-9月份的分離率較其他月份高，說(shuō)明高溫天氣利于細(xì)菌在海產(chǎn)品中增殖。

在38株副溶血弧菌海產(chǎn)品相關(guān)分離株中，TDH陽(yáng)性攜帶率為13.2%，有5.3%的菌株攜帶TRH基因，沒(méi)有菌株同時(shí)攜帶這兩種基因，攜帶率與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的基本一致[8，11]，說(shuō)明天津地區(qū)副溶血弧菌廣泛存在且具有一定的毒力基因攜帶率。

38株副溶血弧菌主要分為3個(gè)血清型，分別為O1（60.5%）、O3（5.3%）和O10（26.3%），還有7.9%的菌株出現(xiàn)了自凝，與國(guó)內(nèi)有關(guān)報(bào)道在外環(huán)境及水產(chǎn)品等檢測(cè)的菌株以O(shè)1、O4、O5為主的結(jié)果不太一致[12-13]，O1群占60.5%，為主要的血清型，但是O10群也占有相當(dāng)一部分比例，這說(shuō)明我市水產(chǎn)品中攜帶的副溶血弧菌血清型具有多樣性，且與其他地區(qū)血清型分布存在差異。正確的血清學(xué)分型可為我市副溶血弧菌流行病學(xué)調(diào)查和臨床用藥提供依據(jù)，有利于我市預(yù)防和控制由該菌引起的疾病。

細(xì)菌的藥物敏感性測(cè)定，特別是最低抑菌濃度測(cè)定對(duì)指導(dǎo)臨床選用最有效的抗生素和最佳給藥方案具有重要意義，同時(shí)還可對(duì)細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)菌株對(duì)磺胺類(lèi)的磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶鈉、新諾明和氨基糖苷類(lèi)的硫酸新霉素不敏感，在使用其進(jìn)行治療時(shí)要考慮療效，或者選取其他藥物作為替代品。同時(shí)觀(guān)察到不同血清型的副溶血弧菌對(duì)上述藥物的敏感性沒(méi)有顯著差異，在治療該菌引起的疾病時(shí)可以不考慮血清型；從地區(qū)上看，只有四個(gè)地區(qū)對(duì)甲砜霉素敏感，存在地區(qū)差異性，其他抗生素所呈現(xiàn)出來(lái)的敏感程度沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明副溶血弧菌的耐藥性在我市還是比較一致，在實(shí)際使用過(guò)程中還要綜合考慮發(fā)病動(dòng)物的生活環(huán)境與人為因素的影響。

綜上所述，本研究為天津地區(qū)副溶血弧菌的流行情況及毒力基因分布情況提供了參考依據(jù)，也為衛(wèi)生機(jī)構(gòu)和海產(chǎn)品養(yǎng)殖生產(chǎn)者進(jìn)行安全評(píng)估、合理用藥并且建立有效的預(yù)防機(jī)制提供參考。

[1] 王璐華，寧喜斌. 副溶血性弧菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立與應(yīng)用探討[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（增刊）：263－267.

[2]石曉路，王藝，扈慶華，等. 深圳地區(qū)2002-2008年副溶血弧菌分子特征研究[J]. 中華流行病學(xué)雜志，2013，34（6）：609-613.

[3] DePaola A，Ulaszek J，Kaysner CA，et al. Molecular，serological，and virulence characteristics of Vibrio parahaemolyticus isolated from environmental，food，and clinical sources in North America and Asia[J].，2003，69（7）：3999-4005.

[4] Abolmaaty A，Vu C，Oliver J，et al. Development of a new lysis solution for releasing genomic DNA from bacterial cells for DNA amplification by polymerase chain reaction[J].，2000，101（400）：181?189.

[5] National Committee for Clinical labaratory standands. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing：M100-S15[S]. Wayne：NCCLS，2005：1-159.

[6] Bej AK，Patterson D P，Brasher C W，et al. Detection of total and hemolysin-producingshellfish using multiplex PCR amplification of tlh tdh and trh[J].，1999，36（3）：215-225.

[7] 江海洋，李磊，莫慶寶，等. 連云港市食用貝類(lèi)副溶血性弧菌污染狀況調(diào)查[J]. 職業(yè)與健康，2008，24（20）：2128?2130.

[8] Yang Z Q，Jiao X A，Zhou X H，et al. Isolation and molecular characterization offrom fresh，low-temperature preserved，dried，and salted seafood products in two coastal areas of eastern China[J].，2008，125（3）：279?285.

[9] 金培婕，吳蓓蓓，王淑娜，等. 浙江沿海地區(qū)海產(chǎn)品及環(huán)境中副溶血弧菌的分離與主要毒力基因分析[J]. 微生物學(xué)學(xué)報(bào)，2009，36（7）：962-967.

[10]趙峰，周德慶，于維森，等. 東部沿海貝類(lèi)中副溶血弧菌的分布及特征[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30（5）：711-715.

[11] Nishibuchi M，Kaper J B. Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus：a virulence gene acquired by a marine bacterium[J].，1995，63（6）：2093-2099.

[12] 張俊彥，梅玲玲，朱敏，等. 301份海水產(chǎn)品副溶血性弧菌定量檢測(cè)分析[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17（3）：509-510.

[13] 潘幸福. 盤(pán)山群島海產(chǎn)品和外環(huán)境副溶血弧菌帶菌調(diào)查及血清分型[J]. 流行病學(xué)雜志，1990，11（5）：25-28.

責(zé)任編輯：張愛(ài)婷

Identification of Serotype, Main Virulence Factors and Investigation of Drug-resistant ofStrains from Tianjin

XU Yun-xia, ZHAO Liang-wei, WU Yan-hui, ZHANG Li, CUI Lu-wen

（Tianjin Diseases Prevention and Control Center of Aquatic Animals, Tianjin 300221, China）

To investigate the serotype, toxic genes and antibiotics resistance offrom the seafoods in Tianjin. Several aquatic species and enviroments were examined for presence ofin Tianjin of 2015, and some virulence-related genes such as,and serotype were investigated from the isolates, the drug-resistant test was carried out to the different serum type strains of V.P. In 2015, 73 samples from 9 districts and countries were collected from Tianjin, and a total of 38 strains ofwere isolated. The isolation rate about 52% the genes,existed in 13.2% and 5.2% respectively from 38 isolates; The results of serum typing showed that O1, O3 and O10 were separated, and including serotype O1 accounting for 60% of the major serotype. MIC test was carried out on 9 kinds of drugs with different serum type, the result showed that.was sensitived to quinolones (nicotinic acid norfloxacin Injection, norfloxacin lactate), and non-sensitived tosulfadimidine, sulfadiazine sodium, sulfamethoxazole and neomycin sulphate, and other antibiotics also have different degrees of resistance, There was no significant difference between the sensitivity of.in different serotypes of drugs, in the treatment of diseases caused by the strains could not be considered serotype. This study reveals the significant prevalence of.in seafoods with high diversity of virulence genes. Representativeisolates could be used to provide basic data for the further study of the pathogenicity of.

; serotype; virulence factors; drug-resistant

1008-5394（2017）03-0055-04

S43

A

2016-12-14

徐赟霞（1983-），女，天津市人，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物疾病方向。聯(lián)系電話(huà)：022-88251062。