劉波，王慶奎，邢克智，陳成勛

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當(dāng)歸多糖除蛋白質(zhì)前后抗氧化活性比較

劉波，王慶奎，邢克智通信作者，陳成勛

（天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

本試驗(yàn)比較當(dāng)歸多糖除蛋白質(zhì)前后的體外抗氧化活性。采用水提醇沉法制備當(dāng)歸粗多糖（CASP），Sevag法除蛋白后得當(dāng)歸多糖（ASP）。用鐵氰化鉀還原法測(cè)定還原力、Fenton法測(cè)定羥基自由基清除能力，DPPH法測(cè)定自由基清除能力，鄰苯三酚自氧化法測(cè)定超氧陰離子自由基清除能力。結(jié)果表明，CASP和ASP均具有顯著的還原力和自由基清除能力（＜0.05）；同濃度下，CASP的還原能力和自由基清除能力顯著高于ASP（＜0.05）。但CASP和ASP的還原能力和自由基清除能力顯著低于維生素C（＜0.05）。結(jié)果提示，CASP和ASP均具有抗氧化能力，CASP的抗氧化能力高于ASP。

當(dāng)歸；多糖；還原力；自由基清除能力

自由基是近年來(lái)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，所有需氧生物體內(nèi)均可產(chǎn)生自由基，是細(xì)胞進(jìn)行正常代謝的副產(chǎn)物。在正常的生理情況下，生物體內(nèi)自由基處于動(dòng)態(tài)平衡中，適量的自由基能促進(jìn)細(xì)胞增殖，刺激免疫細(xì)胞殺滅細(xì)菌等。一旦機(jī)體受到疾病或外界刺激以及環(huán)境變化，平衡被打破，從而產(chǎn)生過(guò)量自由基，攻擊各種生物分子，引起一系列氧化損傷，如破壞蛋白質(zhì)和糖類(lèi)的結(jié)構(gòu)和功能、降解不飽和脂肪酸、破壞堿基，產(chǎn)生突變，核苷酸損傷等[1]。目前，人工合成的抗氧化劑乙氧基喹啉（EQ）、羥基茴香二丁酯（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）等對(duì)自由基的清除效果很好，但近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)一些化學(xué)合成的抗氧化劑有一定的毒性，比如BHT會(huì)產(chǎn)生致癌物質(zhì)，能夠引發(fā)肝臟肥大、染色體變異等，還可抑制人體呼吸酶的活性[2]，從而引起了人們對(duì)化學(xué)合成的抗氧化劑的不安全感。因此篩選無(wú)毒、高效、營(yíng)養(yǎng)的天然抗氧化劑具有重要的意義。

多糖是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸以外的又一類(lèi)重要信息分子。有專(zhuān)家預(yù)言，“21世紀(jì)將是多糖的時(shí)代”。許多研究表明，多糖能為生物體提供能量，參與機(jī)體的分子識(shí)別、細(xì)胞粘附與細(xì)胞防御等多種機(jī)制，并具有多種重要的生物活性和藥理作用，如抗癌、抗氧化、抗衰老和提高免疫力等，能夠清除自由基，從而減少慢性疾病的發(fā)生[3]。當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸（）的干燥根，是我國(guó)傳統(tǒng)常用“補(bǔ)血”中藥，當(dāng)歸多糖是從植物當(dāng)歸原料中提取的水溶性多糖，是當(dāng)歸的主要活性成分之一[4]。目前，關(guān)于當(dāng)歸多糖在體外抗氧化活性方面的研究已有一些報(bào)道。研究表明，經(jīng)過(guò)硫酸化、磷酸化、乙?；?、甲基化4種化學(xué)修飾后的當(dāng)歸多糖，均能顯著清除DPPH自由基和抑制Fe2+誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系[5]。當(dāng)歸多糖與當(dāng)歸總油配伍能清除DPPH自由基[6]，用纖維素酶和果膠酶破壞細(xì)胞壁后提取的當(dāng)歸多糖能清除超氧陰離子自由基和羥基自由基[7]。雖然除蛋白后的當(dāng)歸多糖對(duì)超氧陰離子自由基、羥基自由基有很強(qiáng)的清除能力[8]，但除蛋白質(zhì)過(guò)程是否影響當(dāng)歸多糖的抗氧化活性尚未見(jiàn)報(bào)道。Sevag法能有效去除多糖中游離的蛋白質(zhì)。蛋白酶法能把與多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)水解下來(lái)，但不少多糖往往是以糖蛋白的形式發(fā)揮其生物活性。因此，本試驗(yàn)采用Sevag法，只去除多糖中游離的蛋白質(zhì)，保留與多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)，比較除蛋白質(zhì)前后當(dāng)歸多糖的抗氧化活性，為當(dāng)歸多糖抗氧化活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

當(dāng)歸購(gòu)于本地中草藥市場(chǎng)，產(chǎn)地甘肅。將自然風(fēng)干的當(dāng)歸先去除當(dāng)歸中的脂溶性物質(zhì)，用78%乙醇浸泡7 d，料液比為1∶10，經(jīng)常攪拌。將78%乙醇浸泡后的當(dāng)歸用水提醇沉法[9]提取CASP。提取后的當(dāng)歸粗多糖采用Sevag法除蛋白[10]。即將當(dāng)歸粗多糖提取液與Sevag試劑（氯仿∶正丁醇＝4∶1）按3∶1比例混合，磁力攪拌45 min，4 500 r/min離心10 min。離心后溶液分為3層，上層為多糖溶液，中層為蛋白質(zhì)，底層為有機(jī)溶劑。取多糖溶液重復(fù)上述步驟，直到蛋白質(zhì)層消失，將多糖溶液冷凍干燥后，即得ASP。

1.2 方法

1.2.1 還原力的測(cè)定

采用鐵氰化鉀還原法[11]檢測(cè)。向反應(yīng)體系中分別加入2、4、8、16、32 mg/ mL CASP、ASP和VC，離心（3 000 r/min，10 min），取上清液0.5 mL，加入0.5 mL蒸餾水和0.1 mL 0.1% FeCl3溶液，混合均勻，10 min后測(cè)定700 nm的吸光值。

1.2.2 對(duì)羥基自由基（·OH）清除率的測(cè)定

采用Fenton法[12]，向反應(yīng)體系中分別加入2、4、8、16、32 mg/mL CASP、ASP和VC，搖勻后在37 ℃水中溫育30 min，測(cè)定510 nm處的吸光度，平行測(cè)定3次，計(jì)算清除率。

1.2.3 對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定

采用DPPH法[13]分別吸取2、4、6、8、10 mg/mL CASP、ASP和VC2 mL，加入0.02 mmol/L的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）乙醇溶液2 mL，漩渦混勻器混勻，在室溫黑暗處放置30 min。以無(wú)水乙醇調(diào)零，測(cè)定517 nm處的吸光值（樣品）。同時(shí)，測(cè)定樣品溶液2 mL與乙醇2 mL混合液在517 nm處的吸光值（對(duì)照），再測(cè)定2 mL DPPH溶液與2 mL乙醇在517 nm處的吸光值（空白）。

DPPH自由基清除率（%）＝[1－（樣品－對(duì)照）/空白]×100%

1.2.4 對(duì)超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化方法[14]并作適當(dāng)調(diào)整，向反應(yīng)體系中分別加入2、4、8、16、32、64 mg/mL CASP、ASP和VC1 mL，加入4.5 mL 0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HC1緩沖液、4.2 mL雙蒸水，漩渦混勻后置于水浴鍋中（25 ℃，20 min），取出后立即加入25 ℃預(yù)熱過(guò)的7.0 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL。漩渦混勻后，以10 mmol/L鹽酸調(diào)零，測(cè)定其在325 nm處的吸光值，每隔30 s讀取325，共測(cè)定5 min。以吸光值為因變量，時(shí)間為自變量，作325隨時(shí)間變化的回歸方程，斜率即為鄰苯三酚自氧化速率，以蒸餾水代替樣品為空白對(duì)照的自氧化速率為。

清除率計(jì)算公式為：清除率（%）＝（-）/×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPASS 18.0做單因素方差分析，差異顯著的（＜0.05）用Duncan’s法做多重比較。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，＝3。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原能力的測(cè)定

由表1可以看出，CASP和ASP的還原能力隨濃度的升高而顯著增強(qiáng)。同一濃度下，CASP的還原能力顯著高于ASP，但二者的還原能力均顯著低于VC。

表1 CASP、ASP和Vc的還原能力（OD700 nm）

注：同列數(shù)據(jù)帶有不同小寫(xiě)字母的，表示差異顯著（＜0.05）；同行數(shù)據(jù)帶有不同大寫(xiě)字母的，表示差異顯著（＜0.05），下同

2.2 對(duì)羥基自由基（·OH）清除率的測(cè)定

由表2可以看出，CASP和ASP對(duì)·OH的清除能力隨多糖濃度的升高而顯著增強(qiáng)。同一濃度下，CASP的清除·OH能力顯著高于ASP，但二者的清除·OH能力均顯著低于VC。

表2 CASP、ASP和Vc對(duì)·OH的清除率

2.3 對(duì)超氧陰離子自由基（O·）清除率的測(cè)定

表3 CASP、ASP和Vc對(duì)O·的清除率

2.4 對(duì)DPPH自由基（DPPH·）清除率的測(cè)定

由表4可以看出，CASP和ASP對(duì)DPPH·的清除能力隨濃度的升高而顯著增強(qiáng)。在10 mg/mL濃度下，CASP和ASP相比，清除DPPH·能力不顯著，其他濃度下，CASP的清除DPPH·能力顯著高于ASP，但二者的清除DPPH·能力均顯著低于VC。

表4 CASP、ASP和Vc對(duì)DPPH.的清除率

3 討論與結(jié)論

水煮醇沉法提取的植物多糖中往往含有蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)會(huì)對(duì)多糖的活性檢測(cè)和結(jié)構(gòu)解析造成干擾。目前植物多糖常用的除蛋白方法有Sevag法、蛋白酶法、三氯乙酸法等[21]。Sevag法除蛋白是利用蛋白質(zhì)在氯仿中變性的特點(diǎn)，使多糖與蛋白質(zhì)分層，其操作簡(jiǎn)單，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)無(wú)影響；三氯乙酸法利用三氯乙酸可沉淀蛋白而提煉蛋白，但由于三氯乙酸酸性較強(qiáng)，在脫蛋白過(guò)程中可能會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)[22]；而蛋白酶法除蛋白質(zhì)比較徹底，在水解游離蛋白質(zhì)的同時(shí)，也會(huì)水解下與多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)，破壞多糖的原有結(jié)構(gòu)。用Sevag法除蛋白質(zhì)后，當(dāng)歸多糖中仍含少量蛋白質(zhì)[9]，說(shuō)明當(dāng)歸多糖可能是與蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白多糖。為避免當(dāng)歸多糖因除蛋白而造成原有結(jié)構(gòu)的破壞，本試驗(yàn)采用Sevag法除蛋白。

此外，除蛋白質(zhì)對(duì)多糖的抗氧化活性有影響。如去除婆羅子（）多糖[23]、黑牛肝菌（）多糖[24]、桔梗（）多糖[25]中的蛋白質(zhì)后，抗氧化活性降低。而將銀耳（）多糖[26]中的蛋白質(zhì)去除后，多糖的抗氧化活性顯著增強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，將當(dāng)歸多糖中的蛋白質(zhì)去除后，多糖的抗氧化活性顯著降低。筆者認(rèn)為，造成當(dāng)歸多糖除蛋白質(zhì)后抗氧化活性降低的原因可能有：（1）本試驗(yàn)先用無(wú)水乙醇浸泡當(dāng)歸，去除當(dāng)歸中大部分的脂溶性物質(zhì)和色素，再用水煮醇沉法提取的CASP溶液呈淺棕色，說(shuō)明CASP中還存在部分色素。用Sevag法除蛋白質(zhì)后，當(dāng)歸多糖溶液幾乎無(wú)色，說(shuō)明色素物質(zhì)也已去除。因此，CASP中存在的少量色素是否對(duì)抗氧化活性有影響，有待下一步驗(yàn)證。（2）本試驗(yàn)提取的CASP中含有21.22%的蛋白質(zhì)，而用Sevag法除蛋白質(zhì)后，ASP中蛋白質(zhì)為2.12%[9]，說(shuō)明CASP中含有19.10%的游離蛋白質(zhì)。這部分游離蛋白質(zhì)是否對(duì)當(dāng)歸多糖的抗氧化活性有影響，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究表明，CASP和ASP有較強(qiáng)的還原能力和自由基清除能力，顯示出較強(qiáng)的抗氧化活性，CASP的抗氧化活性顯著高于ASP。

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責(zé)任編輯：張愛(ài)婷

Compare of Antioxidant Activity ofPolysaccharide before and after Protein Removing

LIU Bo, WANG Qing-kui, XING Ke-zhiCorresponding Author, CHEN Cheng-xun

（Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

This paper compared the antioxidant activity ofpolysaccharide（ASP）before and after protein removing. Crudepolysaccharide（CASP）was extracted with hot water and precipitated with ethanol. The ASP was obtained by removing protein from CASP by Sevag method. Ferricyanide reduction method, fenton method, DPPH method, and adjacent benzene three phenol autoxidation method were adopted to assay the reduction ability and free radical-scavenging activity. The results showed that CASP and ASP exhibited significant reduction ability and free radical-scavenging activity（＜0.05）. Within the same concentration, the reduction ability and free radical-scavenging activity of CASP were higher than those of ASP（＜0.05）. However, the reduction ability and free radical-scavenging activity of CASP and ASP were feebler than those of ascorbic acid（＜0.05）. These results indicate that CASP and ASP exhibited antioxidant ability, the antioxidant ability of CASP was stronger than that of ASP.

; polysaccharide; reduction ability; free radical-scavenging activity

1008-5394（2017）03-0046-04

R284.2

A

2016-12-05

國(guó)家自然科學(xué)基金（面上）項(xiàng)目“當(dāng)歸多糖對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(yú)非特異性免疫和抗氧化機(jī)理的研究”（31270456）；天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目201704專(zhuān)題（無(wú)編號(hào)）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目“肉桂醛提高半滑舌鰨免疫力機(jī)理研究”（15JCZDJC33600）

劉波（1992-），男，天津?qū)幒尤?，碩士在讀，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖方向研究。E-mail：274230345@qq.com。

邢克智（1956-），男，天津市人，教授，學(xué)士，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖方向研究。E-mail：kzxing6668@126.com。