李姝江，彭嬌洋，朱涵明月，劉 倩，王詩(shī)瑋，朱天輝*，黃祖惠，吳繼云，張 霞

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川 成都 611130；2.大邑縣農(nóng)林局，四川 成都 611330)

萊氏野村菌(Nomuraea rileyi)固液雙相發(fā)酵配方研究

李姝江1，彭嬌洋1，朱涵明月1，劉 倩1，王詩(shī)瑋1，朱天輝1*，黃祖惠2，吳繼云2，張 霞2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川 成都 611130；2.大邑縣農(nóng)林局，四川 成都 611330)

萊氏野村菌(Nomuraearileyi)通過基礎(chǔ)培養(yǎng)基基質(zhì)、碳、氮、維生素篩選，玉米(50 g)、葡萄糖(1.5 g)、水解酪蛋白(1.5 g)、抗壞血酸(0.5 mg)、水50 mL為最佳固體培養(yǎng)基質(zhì)(培養(yǎng)10 d)，產(chǎn)孢量達(dá)4.78×1010cfu·mL-1。以SMY為液體培養(yǎng)基質(zhì)，萊氏野村菌最適發(fā)酵條件：1.0×108cfu·mL-1接種濃度，25℃、pH=6、全天光照、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，菌絲干重為690.2 mg。固體發(fā)酵為復(fù)合粉炮生產(chǎn)提供基礎(chǔ)配方，液體發(fā)酵縮短時(shí)間后可作為固體培養(yǎng)生產(chǎn)萊氏野村菌菌粉的二級(jí)種子，發(fā)酵產(chǎn)品為杜仲夢(mèng)尼夜蛾粉炮防治重要生物制劑。

萊氏野村菌；發(fā)酵；培養(yǎng)基；杜仲夢(mèng)尼夜蛾

萊氏野村菌Nomuraearileyi(Farlow) Samsonn于1883年被首次報(bào)道，F(xiàn)arlow研究了該菌并依照其孢子梗形態(tài)命名，稱其為萊氏葡萄孢(BotrytisrileyiFarlow)[1,2]。1974年Kish等[3]人正式對(duì)其命名為萊氏野村菌(Nomuraearileyi)，并將其作為野村菌屬的模式種，得到人們的普遍認(rèn)可而沿用至今。萊氏野村菌侵入寄主昆蟲的病理過程包括：寄主識(shí)別、機(jī)械破壞、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、代謝干擾、毒素分泌及寄主組織結(jié)構(gòu)破壞等幾個(gè)部分，是一個(gè)非常復(fù)雜的雙向生理生化過程[4]。該菌曾在人工條件下成功引起大豆田夜蛾流行病，在國(guó)外已經(jīng)廣泛應(yīng)用于田間夜蛾科害蟲的防治[5,6]。陸續(xù)又有將萊氏野村菌用于高粱棉鈴蟲[7,8]、苜蓿綠夜蛾[9]等的防治。我國(guó)在1996年首次報(bào)道使用萊氏野村菌孢子懸浮液在田間控制棉鈴蟲，蟲口密度顯著下降[10]。

國(guó)外的發(fā)酵工藝多采用液體深層發(fā)酵，我國(guó)除液體發(fā)酵之外，還探索出一套通過固體淺層發(fā)酵方式進(jìn)行大規(guī)模開放式生產(chǎn)的工藝[11]。通過發(fā)酵技術(shù)研究各類微生物產(chǎn)物的發(fā)酵規(guī)律并加以利用，改進(jìn)工藝水平并提高生產(chǎn)效率，大幅提升生物農(nóng)藥的產(chǎn)量、質(zhì)量將不再是難題。發(fā)酵參數(shù)對(duì)微生物菌絲生長(zhǎng)量和產(chǎn)孢量都有極大影響，大多數(shù)蟲生真菌在25℃[12]下生長(zhǎng)最好，菌絲生長(zhǎng)量和分生孢子產(chǎn)量最高的pH與自然pH相近[13]，培養(yǎng)基中碳氮源種類的選擇可以顯著促進(jìn)蟲生真菌微循環(huán)產(chǎn)孢[14]，孔瓊等[15]研究維生素在萊氏野村菌生長(zhǎng)中的作用，發(fā)現(xiàn)對(duì)其菌落產(chǎn)孢有明顯的促進(jìn)作用的維生素有生物素、煙酸和抗壞血酸3種。國(guó)內(nèi)關(guān)于杜仲夢(mèng)尼夜蛾取食杜仲葉片導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)林損失慘重的報(bào)道屢見不鮮，但有效的無公害防治方法尚少。前期試驗(yàn)證明，萊氏野村菌對(duì)杜仲夢(mèng)尼夜蛾有明顯控制作用，因此，相關(guān)發(fā)酵條件優(yōu)化為該菌投入生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：萊氏野村菌(Nomuraearileyi)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供，分離于大邑縣杜仲種植基地罹病的夢(mèng)尼夜蛾蟲尸。

培養(yǎng)基質(zhì)：高粱、大米、大豆、玉米、小麥、各種碳、氮源、SMY 培養(yǎng)基(麥芽糖 4%，蛋白胨 1%，酵母粉 1%)。

儀器與設(shè)備：高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、振蕩培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、血球計(jì)數(shù)板。

菌種活化：采用PPDA培養(yǎng)基(1 L PDA中添加蛋白胨10 g)進(jìn)行擴(kuò)繁。25℃下培養(yǎng)10 d，備用。

菌懸液的制備：用滅菌的0.05%Tween-80洗脫P(yáng)PDA斜面上生長(zhǎng)的分生孢子，將洗脫液置于漩渦振蕩器內(nèi)充分振蕩均勻，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子濃度。

1.2 萊氏野村菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基質(zhì)篩選

為探索適宜生產(chǎn)萊氏野村菌分生孢子的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，在前人的研究基礎(chǔ)上，利用單因素試驗(yàn)對(duì)大豆、小麥、高粱、大米等材料進(jìn)行篩選，并優(yōu)化發(fā)酵條件。

高粱、大米、大豆、玉米、小麥各取50 g，加50 mL水分別煮沸，濕度為手握基質(zhì)時(shí)掌心有水印而無水滴出，用三角瓶分裝。高壓滅菌后接種上述液體發(fā)酵孢子懸浮液，接種3.63×108cfu·mL-1的孢子懸浮液20 mL，置于25℃下光照培養(yǎng)10 d后取出，計(jì)算其孢子含量。每個(gè)基質(zhì)設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

1.2.2 不同碳源對(duì)萊氏野村菌生長(zhǎng)的影響

在上述試驗(yàn)篩選出的最佳培養(yǎng)基質(zhì)(50 g)中分別添加 1.5 g(50 mL溶解)的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、木糖、甘露醇和可溶性淀粉，配制成含不同碳源的培養(yǎng)基，以無碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，配制成含不同碳源的培養(yǎng)基，研究不同碳源對(duì)萊氏野村菌生長(zhǎng)的影響，接種3.63×108cfu·mL-1的孢子懸浮液20 mL，之后置于25℃下光照培養(yǎng)10 d后取出，計(jì)算其孢子含量。每組試驗(yàn)重復(fù)5次，試驗(yàn)結(jié)果為5次重復(fù)的平均值。

1.2.3 不同氮源對(duì)萊氏野村菌生長(zhǎng)的影響

在上述試驗(yàn)篩選出的最佳培養(yǎng)基質(zhì)(50 g)中分別添加 1.5 g(50 mL溶解)的酵母浸粉、尿素、牛肉蛋白胨、硝酸鈉、硝酸鉀、水解酪蛋白、胰蛋白胨和硝酸銨，將他們作為生長(zhǎng)所需的氮源，以無氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，配制成含不同氮源的培養(yǎng)基，研究不同氮源對(duì)萊氏野村菌生長(zhǎng)的影響，接種3.63×108cfu·mL-1的孢子懸浮液20 mL，之后置于25℃下光照培養(yǎng)10 d后取出，計(jì)算其孢子含量。每組試驗(yàn)重復(fù)5次，試驗(yàn)結(jié)果為5次重復(fù)的平均值。

1.2.4 不同維生素對(duì)萊氏野村菌生長(zhǎng)的影響

在上述試驗(yàn)篩選出的最佳培養(yǎng)基質(zhì)(50 g)中，分別加入0.5 mg(50 mL溶解)的抗壞血酸、硫胺素、吡哆醇、核黃素、生物素，以不加任何維生素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照，配制成含不同維生素的培養(yǎng)基，研究不同維生素對(duì)萊氏野村菌生長(zhǎng)的影響，接種3.63×108cfu·mL-1的孢子懸浮液20 mL，之后置于25℃下光照培養(yǎng)10 d后取出，計(jì)算其孢子含量。每組試驗(yàn)重復(fù)5次，試驗(yàn)結(jié)果為5次重復(fù)的平均值。

單因素試驗(yàn)選出的最適因子進(jìn)行配比同上述試驗(yàn)條件測(cè)定其產(chǎn)孢量。

1.3 萊氏野村菌的液體發(fā)酵參數(shù)篩選

1.3.1 pH對(duì)菌絲干重的影響

將配備好的SMY培養(yǎng)基各150 mL放在250 mL的三角瓶中，高壓滅菌后用NaOH和HCL將SMY液體培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至4、5、6、7、8、9、10，之后分別接種1 mL菌懸液，接種濃度為1.0×l07cfu·mL-1，放在培養(yǎng)溫度為28℃的震蕩培養(yǎng)箱里搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。 7 d后，將培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾，把過濾后的菌絲放在60℃的烘箱里烘干2 h后稱取菌絲干重。

1.3.2 接種濃度對(duì)菌絲干重的影響

將配備好的SMY培養(yǎng)基各150 mL放在250 mL的三角瓶中，高壓滅菌后分別接種1 mL的菌懸液,接種濃度分別為1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108l、1.0×109cfu·mL-1。放在培養(yǎng)溫度為28℃搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1的振蕩培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH值為自然，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。7 d后測(cè)處理后的菌絲干重。

1.3.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲干重的影響

將配備好的SMY培養(yǎng)基各150 mL放在250 mL的三角瓶中，接種1 mL的菌懸液。接種濃度為1.0×108cfu·mL-1，轉(zhuǎn)速設(shè)置分別為60 r·min-1、100 r·min-1、140 r·min-1、180 r·min-1、220 r·min-1，放在培養(yǎng)溫度為28℃的振蕩培養(yǎng)基里培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH值為自然。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，7 d后測(cè)處理后的菌絲干重。

1.3.4 溫度對(duì)菌絲干重的影響

將配備好的SMY培養(yǎng)基各150 mL放在250 mL的三角瓶中，高壓滅菌后，分別接種1 mL的菌懸液,接種濃度為1.0×108cfu·mL-1，振蕩培養(yǎng)箱溫度分別設(shè)置為10℃、15℃、20℃、25℃、30℃，培養(yǎng)基pH值為自然，光照時(shí)間為12L/12D，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，7 d后測(cè)發(fā)酵液的菌絲干重。

1.3.5 光照對(duì)菌絲干重的影響

將配備好的SMY培養(yǎng)基各150 mL放在250 mL的三角瓶中，高壓滅菌后，分別接種1 mL的菌懸液，接種濃度為1.0×108cfu·mL-1，振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)溫度為28℃，光照條件設(shè)置為0L(光照):24D(黑暗)、6L:18D、12L:12D、18L:6D、24L:0D，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)， 7 d后測(cè)發(fā)酵液的菌絲干重。

單因素試驗(yàn)選出的最佳條件進(jìn)行配比在SMY培養(yǎng)基上測(cè)定其菌絲干重。

1.4 數(shù)據(jù)分析

固體發(fā)酵采用血球計(jì)數(shù)板對(duì)孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，液體發(fā)酵稱取菌絲干重，將所獲得數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析檢驗(yàn)差異顯著性，EXCEL軟件為輔助統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體發(fā)酵配方優(yōu)化

2.1.1 不同固體基質(zhì)對(duì)萊氏野村菌產(chǎn)孢量的影響

產(chǎn)孢量結(jié)果表明，以玉米作為固體基質(zhì)產(chǎn)孢量最大，達(dá)到(16.40±2.76)×109cfu·mL-1，大米和高粱次之，大豆最低，除玉米外，其余基質(zhì)產(chǎn)孢量差異不顯著。玉米與其他基質(zhì)間差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)(表1)，綜合比較五種固體基質(zhì)對(duì)萊氏野村菌產(chǎn)孢量的影響，選擇玉米作為固體基質(zhì)進(jìn)一步研究。

表1 不同固體基質(zhì)培養(yǎng)萊氏野村菌的產(chǎn)孢量

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD，同列中不同字母表示差異顯著(LSD，P<0.05)。

2.1.2 不同碳源對(duì)萊氏野村菌產(chǎn)孢量的影響

比較供試的幾種碳源對(duì)菌落產(chǎn)孢量的影響(表2)，以葡萄糖為碳源的產(chǎn)孢量最大，達(dá)(17.60±1.65)×109cfu·mL-1；與其他糖類差異顯著(P<0.05)；其次是麥芽糖，產(chǎn)孢量為(12.47±0.50)×109cfu·mL-1。余下幾個(gè)碳源種類，蔗糖、果糖、可溶性淀粉、甘露醇、木糖與對(duì)照組差異不顯著，其中可溶性淀粉、甘露醇、木糖相較于對(duì)照組，產(chǎn)孢量較低。

表2不同碳源固體培養(yǎng)基培養(yǎng)萊氏野村菌的產(chǎn)孢量

C源產(chǎn)孢量(×109cfu·mL-1)葡萄糖17.60±1.65a麥芽糖12.47±0.50b蔗糖11.73±5.50bc果糖11.47±3.67bc無添加(對(duì)照)8.23±0.06bc可溶性淀粉8.04±0.34bc甘露醇7.93±2.66c木糖6.95±0.30c

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD，同列中不同字母表示差異顯著(LSD，P<0.05)。

2.1.3 不同氮源對(duì)萊氏野村菌產(chǎn)孢量的影響

氮源對(duì)于萊氏野村菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)孢影響表明(表3)，與對(duì)照組相比，水解酪蛋白和胰蛋白胨對(duì)菌株的產(chǎn)胞有明顯的促進(jìn)作用，產(chǎn)孢量以水解酪蛋白最大，達(dá)(36.97±0.47)×109cfu·mL-1，胰蛋白胨次之，達(dá)(35.17±0.95)×109cfu·mL-1，兩者差異并不顯著，且均與其他氮源差異性顯著(P<0.05)，余下氮源中，以硝酸鈉、牛肉膏蛋白胨、酵母浸粉、硝酸銨與對(duì)照組無顯著差異；硝酸鉀與脲產(chǎn)孢量較對(duì)照組較差，有一定抑制作用，其中氮源為脲的固體培養(yǎng)基上，始終未見菌落形成。

表3不同氮源固體基質(zhì)培養(yǎng)萊氏野村菌的產(chǎn)孢量

N源產(chǎn)孢量(×109cfu·mL-1)水解酪蛋白36.97±0.47a胰蛋白胨35.17±0.95a無添加(對(duì)照)14.13±5.61b硝酸鈉13.80±2.59b牛肉膏蛋白胨13.77±2.05b酵母浸粉12.90±2.75bc硝酸銨11.37±2.55bc硝酸鉀7.99±5.39c脲0.00±0.00d

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD，同列中不同字母表示差異顯著(LSD，P<0.05)。

2.1.4 不同維生素對(duì)萊氏野村菌產(chǎn)孢量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4)顯示，在培養(yǎng)基中分別添加6種維生素，對(duì)萊氏野村菌的產(chǎn)孢量，除了硫胺素對(duì)該菌的產(chǎn)孢有一定抑制作用外，其余維生素都對(duì)其有一定的促進(jìn)作用，其中，以抗壞血酸對(duì)其促進(jìn)作用最大，產(chǎn)孢量達(dá)(11.29±5.68)×109cfu·mL-1，但與對(duì)照組無顯著差異。

表4不同維生素固體基質(zhì)培養(yǎng)萊氏野村菌的產(chǎn)孢量

維生素產(chǎn)孢量(×109cfu·mL-1)抗壞血酸11.29±5.68a核黃素11.15±2.64a吡哆醇11.07±2.98a生物素10.52±3.55a無添加(對(duì)照)8.38±0.14a硫胺素6.72±2.13a

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD，同列中不同字母表示差異顯著(LSD，P<0.05)。

由此可見，玉米(50 g)、葡萄糖(1.5 g)、水解酪蛋白(1.5 g)、抗壞血酸(0.5 mg)、水50 mL為最佳固體培養(yǎng)基質(zhì)(培養(yǎng)10 d)，產(chǎn)孢量達(dá)4.78×1010cfu·mL-1。

2.2 液體發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 接種濃度對(duì)菌絲干重的影響

從表5可以看出接種的菌株懸液濃度在1.0×108cfu·mL-1時(shí)能夠得到最多的菌絲干重，但是與濃度1.0×107與1.0×109得到的菌絲干重沒有顯著性差異，故后續(xù)選擇濃度為1.0×108cfu·mL-1為最佳接種濃度繼續(xù)后續(xù)研究。

表5 接種濃度對(duì)菌絲干重的影響

注：經(jīng)Duncan多重比較，不同的大寫字母代表在P<0.01水平差異極顯著；不同的小寫字母代表在P<0.05水平差異顯著。

2.2.2 pH對(duì)菌絲干重的影響

從表6可以看出，pH對(duì)萊氏野村菌液體發(fā)酵菌絲干重影響很大，當(dāng)pH=6時(shí)得到菌絲干重最大。pH 5和pH 7 時(shí)菌絲的干重差別不大，但是與前者差異顯著，pH=4和9、10差異明顯，由此可以看出， 適合菌種生長(zhǎng)的pH在5～7之間，最佳的pH值為6。

表6 pH對(duì)菌絲干重的影響

注：經(jīng)Duncan多重比較，不同的大寫字母代表在P<0.01水平差異極顯著；不同的小寫字母代表在P<0.05水平差異顯著。

2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲干重的影響

搖床轉(zhuǎn)速可影響液體菌種在發(fā)酵過程中氧氣的供給。 表7可以看出轉(zhuǎn)速對(duì)該菌株的產(chǎn)孢有明顯影響，在低轉(zhuǎn)速(60 r·min-1)時(shí)候菌絲生長(zhǎng)比較緩慢,搖床在180 r·min-1時(shí)菌絲的產(chǎn)量最高，供氧量適宜。

表7 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲干重的影響

注：經(jīng)Duncan多重比較，不同的大寫字母代表在P<0.01水平差異極顯著；不同的小寫字母代表在P<0.05水平差異顯著。

2.2.4 溫度對(duì)菌絲干重的影響

溫度是研究蟲生真菌生長(zhǎng)的重要因素之一。 在不同的溫度條件下，菌株在液體發(fā)酵中菌絲干重情況不同。 從表8可以看出，菌株在10-30℃，溫度過低或者過高，菌株的產(chǎn)孢有著明顯的不同。25℃能得到菌絲干重最大，30℃時(shí)得到的菌絲干重最低，10℃明顯沒有菌絲產(chǎn)生，說明了溫度是影響菌株液體發(fā)酵的很重要條件。

表8 溫度對(duì)菌絲干重的影響

注：經(jīng)Duncan多重比較，不同的大寫字母代表在P<0.01水平差異極顯著；不同的小寫字母代表在P<0.05水平差異顯著。

2.2.5 光照對(duì)菌株菌絲干重的影響

表9可以看出24D時(shí)菌絲干重最少，24L有較多的干物質(zhì)積累，說明連續(xù)的光照促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)。

表9 光照對(duì)菌絲干重的影響

注：經(jīng)Duncan多重比較，不同的大寫字母代表在P<0.01水平差異極顯著；不同的小寫字母代表在P<0.05水平差異顯著。

綜上，SMY培養(yǎng)基最適發(fā)酵條件：1.0×108cfu·mL-1接種濃度，25℃、pH=6、全光照、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，菌絲干重為690.2 mg。

3 結(jié)論與討論

固體發(fā)酵配方優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明：不同的固體培養(yǎng)基質(zhì)以及不同營(yíng)養(yǎng)種類對(duì)萊氏野村菌的產(chǎn)孢量影響明顯。玉米為菌產(chǎn)孢的最佳固體培養(yǎng)基基質(zhì)，與他人研究結(jié)果為大豆最好不同，可能與大豆的煮沸程度，豆子的種類等有關(guān)[16]；玉米粒來源廣、價(jià)格相對(duì)便宜，是一種適于萊氏野村菌固體發(fā)酵的基質(zhì)，但培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，工藝還有待提高。葡萄糖為該菌產(chǎn)孢的最佳碳源，其菌落產(chǎn)孢量最高；水解酪蛋白和胰蛋白胨為萊氏野村菌產(chǎn)孢的最佳氮源，所選維生素中，對(duì)萊氏野村菌產(chǎn)孢無顯著影響，其中硫胺素較對(duì)照組產(chǎn)孢量偏低，有一定抑制作用。固體發(fā)酵為復(fù)合粉炮生產(chǎn)提供基礎(chǔ)配方。

液體發(fā)酵參數(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明：萊氏野村菌菌株在SMY培養(yǎng)基中，pH=6為菌絲生長(zhǎng)的最適宜pH，振蕩箱的轉(zhuǎn)速在180 r·min-1時(shí)，融氧適宜，培養(yǎng)溫度在25℃，光照設(shè)置為全天光照能促進(jìn)菌絲干物質(zhì)積累；在實(shí)際生產(chǎn)發(fā)酵中，接種菌懸液的濃度可控制在1.0×108cfu·mL-1左右。液體發(fā)酵主要采取先發(fā)酵生產(chǎn)后提取回收產(chǎn)物的工藝，在回收時(shí)采用離心濃縮等方式容易導(dǎo)致大量有效成分隨濾液遺棄，提取物毒力水平有所降低，只能通過深層發(fā)酵提高質(zhì)量，相應(yīng)又延長(zhǎng)了發(fā)酵時(shí)間，降低了發(fā)酵效率[17]。此外，我國(guó)目前的干燥設(shè)備較落后，回收效率及回收質(zhì)量都不理想。想要打破這種惡性循環(huán)，還有待進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)，或開發(fā)新設(shè)備輔助提高液體發(fā)酵的效率。結(jié)合來看，本研究液體發(fā)酵縮短時(shí)間后可作為固體培養(yǎng)生產(chǎn)萊氏野村菌菌粉的二級(jí)種子。

[1] 黃勃,李世貴,李春如,等.柱孢綠僵菌和綠色野村菌分類地位的研究[J].菌物學(xué)報(bào),2004,23(1):33～37.

[2] Leslie P,Kish Robert A,Samson George E.et al.The genusNomuraeaMaublanc[J].Journal of Invertebrate Patholoev,1974,24(2):154～158.

[3] 蒲蟄龍,李增智.昆蟲真菌學(xué)[M].合肥:安徽科學(xué)技術(shù)出版社,1996.

[4] 涂增.萊氏野村菌(Nomuraearileyi)菌株(Nr-cq0310)的研究[D].西南大學(xué)碩士學(xué)位論文,2007.

[5] Ignoffo CM,Garcia C,Hostetter DL.Natural and induced epizootics ofNomuraearileyiin soybean caterpillars[J].Environmental Entomology,1976,5:935～936.

[6] Ambethgar V,Logannathan M.Incidence of green muscardine fungus,Nomuraearileyi(Farlow) Samson on Spodoptera litura (Fab.) in soybean,Glycine max(L.) Merrill from Tamil Nadu(India)[J].Journal of Entomological Research,1998,22(2):195～196.

[7] Hugar PS,Hegde M.Occurrence ofNomuraearileyi(Farlow) Samson onHelicoverpaarmigerainfesting sorghum[J].Insect Environment,1996,2(2):44～45.

[8] Devi PSV.Soil treatment withNomuraearileyi:a promising technique for the control ofSpodopteralituraon groundnut[J].Bioconturol.Science and Technology,1995,5(3):361～364.

[9] Ignoffo CM.The fungusNomuraearileyias a microbial insecticide.In:Microbial control of pests and plant diseases[M].In:Burges H D,ed.London & New York,Academic Press,1981:513～538.

[10] 陸永躍,尹楚道.萊氏野村菌對(duì)棉鈴蟲致病力及田間控制作用初步研究[J].植物保護(hù),1998,24(4):14～17.

[11] 范瑛閣,曹遠(yuǎn)銀.微生物源農(nóng)藥的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,33(7):1266～1268.

[12] Fargues J,Robert PH.Persistence of the conidiospores of the entomopathogenic hyphomycetesBeauveriabassiana(Bals.) Vuill..Metarhizumanisopliae (Metsch.)Sor.,Nomuraearileyi(F.) Samason andPaecilomycesfumoso-roseusWize in the soil.in controlled conditions[J].Agronnmie,1985,5(1):73～79.

[13] Im DJ,Lee MH,Aguda RM.Effect of nutrients and pH on the growth and sporulation of four entomogenous hypomycetes fungi(Deuteromycotina)[J].Korean Journal of Applied Entomology,1988,27(1):41～46.

[14] 馮冬梅.萊氏野村菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢條件的探索[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1989,2(2):57～62.

[15] 樊美珍,黃勃,王建樹,等.幾種蟲生真菌附著胞的熒光顯微及掃描電鏡觀察[J].菌物系統(tǒng),1999,18 (3):249 ～253.

[16] Holdom DG,Klashorst G,van de Klashorst G,et al.Inexpensive culture media and methods forNomuraearileyi[J].Journal of Invertebrate Pathology,1986,48(2):246～248.

[17] 朱昌雄,楊懷文.我國(guó)生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的熱點(diǎn)問題分析與建議[J].現(xiàn)代工業(yè),2005,25(12):1～5.

OptimizationofSolid-liquidBiphasicFermentConstitutionofNomuraearileyi

LI Shu-jiang1PENG Jiao-yang1ZHU Hanmingyue1LIU Qian1WANG Shi-wei1ZHU Tian-hui1*HUANG Zu-hui2WU Ji-yun2ZHANG Xia2

(1.College of Forestry,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China；2.Dayi County Bureau of Agriculture and Forestry,Chengdu 611330,China)

Screening by substrates of basic medium,C,N,and vitamin,the formula of corn(50 g),glucose(1.5 g),casamino acids(1.5 g),ascorbic acid(0.5 mg),H2O(50 mL) was optimal medium substrates(cultivation for 10 d) forNomuraearileyi,the sporulation quantity was 4.78×1010cfu·mL-1.Taking SMY as the liquid medium,the optimal fermentation conditions ofN.rileyiwere as below:1.0×108cfu·mL-1of inoculated concentration,25 ℃,pH6,full light,180 r·min-1of shaking culturing for 7 days,and 690.2 mg of mycelia.The solid fermentation provided the basic formula for producing compound powder,and shortened time of liquid fermentation could be used as secondary generation for producingN.rileyipowder of solid fermentation.The fermented product is the important biological preparation of controlOrthosiasongi.

Nomuraearileyi,Fermentation,Medium,Orthosiasongi

2017-07-03

李姝江(1983-)，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事林木病蟲害及其防治方面的研究。

朱天輝(1963-)，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事林木病蟲害及其防治方面的研究。

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.05.007

S763.3

A

1003-5508(2017)05-0033-05