廖旺姣，鄒東霞，黃乃秀，吳耀軍，覃世杰，蔣曉萍

(1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院/廣西特色經(jīng)濟林培育與利用重點實驗室，廣西 南寧 530002；2.廣西國有六萬林場，廣西 玉林 537000)

一種八角炭疽病新病原鑒定

廖旺姣1，鄒東霞1，黃乃秀1，吳耀軍1，覃世杰2，蔣曉萍2

(1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院/廣西特色經(jīng)濟林培育與利用重點實驗室，廣西 南寧 530002；2.廣西國有六萬林場，廣西 玉林 537000)

【目的】通過研究八角炭疽病病原菌，為防治八角炭疽病提供病原學(xué)基礎(chǔ)?！痉椒ā繉Σ勺詮V西玉林、崇左、河池、百色、防城港等市八角炭疽病樣本，進行單孢分離，致病性測定，采用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合病原菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、微管蛋白(TUB2)、肌動蛋白(ACT)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GPDH)多基因分子系統(tǒng)學(xué)的方法對分離菌株進行鑒定?！窘Y(jié)果】菌株在PDA培養(yǎng)基25 ℃暗培養(yǎng)7 d后，菌落呈圓形，灰白色至灰黑色，分生孢子無色單細胞，圓柱狀，頂端鈍圓，基部平截，光滑，大小為(17.09±1.11)μm×(5.26±0.55)μm，分生孢子附著孢近橢圓形，淺褐色，邊緣光滑完整，大小為(7.72±0.77)μm×(5.45±0.68)μm；病原菌ITS 、TUB2、ACT和GPDH四基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，供試菌株與包括模式菌株在內(nèi)的哈銳炭疽菌(ColletotrichumhoriiWeir&Johnst)聚在同一進化分支上。【結(jié)論】確定八角炭疽病病原菌為哈銳炭疽菌(Colletotrichumhorii)，其為八角炭疽病一種新的病原。

八角；炭疽??；哈銳炭疽菌；病原菌鑒定

【研究意義】八角(Illiciumverum)別名八角茴香、大茴香、大料等,是我國南方歷史悠久的珍貴經(jīng)濟林樹種之一, 主要分布在廣西、云南、廣東、福建、貴州等少數(shù)幾個省區(qū)。八角樹經(jīng)濟價值高, 是重要的香料、調(diào)味料, 可入藥，也是化工主要原料之一[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，目前廣西栽培面積約26×104hm2, 產(chǎn)量和面積均占全國90 % 以上。炭疽病是危害八角葉片的重要病害，能引起大量落葉、造成大規(guī)模葉片提早脫落，嚴重影響八角產(chǎn)量及品質(zhì)。近年來，由于八角純林面積不斷擴大及經(jīng)營管理粗放，炭疽病發(fā)生面積及嚴重度呈上升趨勢，采用原有的防治方法已經(jīng)不能有效的防治病害。因此，對八角炭疽病病原重新進行研究，對八角炭疽病精準防治技術(shù)研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】據(jù)報道，2003年廣西八角炭疽病危害非常嚴重，為有效防控該病害，吳耀軍等[1]開展了相關(guān)的研究，鑒定出八角炭疽病病原菌為球炭疽菌Colletotrichumcoccodes(Wall) Hughes。黃思良等[2]對球炭疽菌生物學(xué)特性進行了研究。黃乃秀等[3]和廖明等[4]對球炭疽菌進行室內(nèi)毒力測定。為防控八角炭疽病提供有效參考依據(jù)，實際運用有效降低八角炭疽病發(fā)生率，提高八角的產(chǎn)量和質(zhì)量?！颈狙芯壳腥朦c】結(jié)合本研究團隊前期主要依據(jù)形態(tài)學(xué)特征鑒定八角炭疽病病原[1]工作的基礎(chǔ)上，首次采用多基因分子系統(tǒng)學(xué)分析法對八角炭疽病菌進行遺傳本質(zhì)分析，再結(jié)合形態(tài)特征明確其種類?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對采集的八角炭疽病供試菌株，選擇核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、微管蛋白(TUB2)、肌動蛋白(ACT)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GPDH)等多基因中哪幾個基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行分子系統(tǒng)學(xué)分析，結(jié)合形態(tài)特征對供試菌株進行鑒定，明確八角炭疽病病原菌分類地位[5]。

1 材料與方法

1.1 病害樣本采集

2015年從廣西玉林、崇左、河池、百色、防城港等市采集八角炭疽病樣本各1份。

1.2 炭疽菌的分離及致病性測定

參考方中達[6]的方法采用單孢分離法對病原菌進行分離，分離菌株在馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(PCA)斜面培養(yǎng)5～7 d。將其斜面培養(yǎng)物置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。選擇菌絲生長迅速、茂密，產(chǎn)孢量大的編號為GXYL1、GXCZ1、GXHC1、GXBS1、和GXFC1為供試菌株，菌株致病性測定參考吳耀軍等[1]的方法。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)特征觀察 將分離純化的菌株置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基25 ℃暗培養(yǎng), 逐日觀察, 記錄病原菌的培養(yǎng)性狀, 培養(yǎng)10 d, 挑取子實體鏡檢、觀察, 拍攝并測量病菌的形態(tài)及分生孢子大小[7-10]。分生孢子附著孢誘導(dǎo)參照楊友聯(lián)[8]的方法。

1.3.2 基因序列的測定及多基因系統(tǒng)分析 病原菌DNA提取、基因選擇及目的片段擴增與測序參考朱英芝等[9]的方法、反應(yīng)體系及條件。PCR產(chǎn)物送至上海立菲生物技術(shù)公司廣州測序部測序。病原菌多基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建參考朱英芝等[9]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病癥狀

主要危害葉片。葉片感病初期，出現(xiàn)水漬狀、褐色小病斑，后擴展成圓形或不規(guī)則形水漬狀大斑，后期病斑中部變?yōu)榛野咨?，密生許多小黑點，即病原菌分生孢子盤(圖1-A)。病害發(fā)生嚴重時，引起大量葉片提前脫落。

A 八角炭疽病發(fā)病癥狀；B 接種發(fā)病癥狀；C分生孢子；D 分生孢子附著孢A: Symptoms of leaf anthracnose; B: Symptoms of inoculation; C: Conidia from culture; D: Conidial appressoria圖1 八角炭疽病Fig.1 Illicium verum Anthracnose

The tree is rooted with C.cliviae(strains: CORCG2 and CORCX9)圖2 基于ITS、TUB2、ACT 和 GPDH基因序列構(gòu)建的炭疽菌系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree inferred from combined partial ITS, TUB2, ACT and GPDH sequences data of Colletotrichum

2.2 病原菌分離與致病性測定

從上述5個市采集的八角炭疽病害樣進行分離培養(yǎng)，獲得90株炭疽菌，菌落形態(tài)特征基本一致。選擇代表菌株進行致病性測定，接種2 d后接種點開始變褐色，逐漸形成暗綠色水漬狀圓斑，而后逐漸變成淡褐色，病斑逐漸擴大成圓形或不規(guī)則形，后期病斑中央呈灰白色，產(chǎn)生黑色小顆粒，發(fā)病癥狀與自然感病癥狀相似(圖1-B)。依據(jù)柯赫氏法則，對接種發(fā)病后的壞死部位再次進行病菌的分離，均能獲得與原分離菌株形態(tài)一致的病原菌，確定五個供試菌株均為八角炭疽病的致病菌[6]。

2.3 病原菌形態(tài)特征

在PDA培養(yǎng)基上，供試菌株菌落呈灰白色至灰黑色，絨毛狀，邊緣整齊，氣生菌絲發(fā)達，未見菌核及剛毛。菌落生長速率為11.66～13.89 mm/d [mean±SD =(12.43±0.84)mm/d,n=6]。培養(yǎng)后期產(chǎn)生桔紅色分生孢子堆，分生孢子為無色單細胞，圓柱狀，光滑，頂端鈍圓，基部平截，具有1～2個油球，大小為(17.09±1.11)μm×(5.26±0.55)μm (mean±SD ，n=100) (圖1-C)。分生抱子附著孢近橢圓形，淺褐色，邊緣完整，大小為(7.72±0.77)μm×(5.45±0.68)μm (mean±SD，n=20) (圖1-D)。形態(tài)特征符合炭疽菌屬真菌，因此，確定供試菌株為Colletotrichumspp.[7-10]。

2.4 多基因序列分析

將菌株GXYL1、GXCZ1、GXHC1、GXBS1和GXFC1的ITS、TUB2、ACT和GPDH基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，下載相關(guān)序列，構(gòu)建上述4個基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，22個菌株共形成8個明顯分支，相同種類炭疽菌均聚在同一分支，各分支之間都具有較高的支持率。5株供試菌株與哈銳炭疽菌C.horii模式菌株(ICMP 10492)聚在一起，進化距離最近，與球炭疽菌C.coccodes等其它炭疽菌形成明顯分支(圖2)。因此，多基因系統(tǒng)學(xué)分析結(jié)果確定八角炭疽病病原為哈銳炭疽菌C.horii。

3 討 論

本研究將從八角分離到的炭疽菌鑒定為哈銳炭疽菌C.horii。這是首次在八角上發(fā)現(xiàn)由該菌引起的病害，與吳耀軍等[1]報道的球炭疽菌C.coccodes不相同。2種病原菌感病癥狀相似，分生孢子形狀相近。2種病原菌分生孢子均為圓柱狀，頂端鈍圓，基部平截。，哈銳炭疽菌分生孢子大小平均值為17.09 μm×5.26 μm，球炭疽菌則為17.00 μm×5.98 μm[1]，兩者大小非常相近，從形態(tài)上比較難區(qū)分兩種病原菌。引入多基因聯(lián)合分析能有效地提高炭疽菌的準確識別率[5]，因此，本研究采用ITS、TUB2、ACT和GPDH多基因序列進行聯(lián)合分析，明確本試驗分離獲得病原是哈銳炭疽菌C.horii，有效區(qū)分球炭疽菌C.coccodes。

哈銳炭疽菌C.horii最早在柿樹(DiospyroskakiThunb)上有報道[10]，最初命名為柿盤長孢菌GloeosporiumkakiHori[11-12]，膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides[13]，基于分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)的差異，Weir[14]將柿樹炭疽病菌的表位型重新界定為柿盤長孢菌G.kakiHori，分類學(xué)上將其歸類為哈銳炭疽菌C.horii，是C.gloeosporioidessensu lato復(fù)合種的成員之一[15]。至此，張敬澤等報道的浙江無核柿炭疽病菌重新定義為C.horii[13]。此外，山東的次郎甜柿炭疽病菌亦為C.horii[15]。本研究從八角炭疽病分離獲得的五個菌株多基因序列與柿樹炭疽病菌C.horii(菌株ICPM 10492和C1069.2)聚在同一分支上，說明2種寄主上獲得的病原相同。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，對廣西八角主產(chǎn)區(qū)玉林、崇左、河池、百色、防城港等市采集的炭疽病菌進行形態(tài)學(xué)結(jié)合多基因分子系統(tǒng)學(xué)分析法，明確上述各市獲得八角炭疽病病原菌均為哈銳炭疽菌C.horii，這是廣西八角炭疽病一種新病原。

[1]吳耀軍，陸志華，黃乃秀，等. 八角炭疽病病原的研究[J]. 廣西林業(yè)科學(xué)，2003，32(3)：118-120.

[2]黃思良，廖 明，岑貞陸，等. 八角炭疽病菌生物學(xué)特性的初步研究[J]. 中國森林病蟲，2006，25(1)：1-4.

[3]黃乃秀，吳耀軍，黃華艷，等. 八角炭疽病菌的室內(nèi)藥效試驗[J]. 廣西林業(yè)科學(xué)，2004， 33(4)：180-181.

[4]廖 明， 黃思良，岑貞陸，等. 八角炭疽病的化控試驗[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，36(4)：365-368.

[5]楊友聯(lián), 劉永翔, 劉作易. 炭疽菌屬真菌分類學(xué)研究進展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(1):152-157.

[6]方中達. 植病研究方法[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1998:122-143.

[7]陸家云. 植物病原真菌學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001: 454-459.

[8]楊友聯(lián). 中國貴州、云南、廣西炭疽菌屬真菌多基因分子系統(tǒng)學(xué)研究 [D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010：1-110.

[9]朱英芝，廖旺姣，鄒東霞，等. 廣西油茶炭疽病病原菌鑒定及生物學(xué)特性[J]. 植物保護學(xué)報，2015，42(3)：382-389.

[10]Xie L, Zhang J Z Cai L, et al. Biology ofColletotrichumhorii, the causal agent of persimmon anthracnose [J]. Mycology, 2010, 1(4): 242-253.

[11]杜社妮,白崗栓,張樹軍,等. 柿炭疽病鑒別與防治[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(13): 6805-6806.

[12]Hyde K D, Cai L, Cannon P F, et al.Colletotrichum-names in current use [J]. Fungal Diversity, 2009, 39: 147-182.

[13]張敬澤, 徐 同, 何黎平. 浙江無核柿炭疽病菌鑒定及附著胞形成過程中的核相變化[J]. 菌物學(xué)報, 2005, 23(4): 446-456.

[14]Weir B S, Johnston P R. Characterisation and neotypification ofGloeosporiumkakiHori asColletotrichumhoriinom nov [J]. Mycotaxon, 2010, 111: 209-219.

[15]余賢美， 侯長明， 王 潔，等. 次郞甜柿炭疽病菌的分離鑒定及其rDNA-ITS序列分析[J].經(jīng)濟林研究, 2014, 32(1): 45-50.

PathogenIdentificationofNewAnthracnoseofIlliciumverum

LIAO Wang-jiao1, ZOU Dong-xia1, HUANG Nai-xiu1, WU Yao-jun1, QIN Shi-jie2, JIANG Xiao-ping2

(1. Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Special Non-wood Forest Cultivation and Utilization, Guangxi Nanning 530002, China；2. Guangxi Liuwan State Forest Farm, Guangxi Yulin 537000, China)

【Objective】To provide the etialogical foundation for the control ofIlliciumverumanthracnose, the pathogen ofIlliciumverumanthracnose was identified. 【Method】The pathogens collected from Yulin, Chongzuo, Hechi, Baise and Fangchenggang city of Guangxi Zhuang Autonomous Region were isolated by unit-cell separation and incubation, tested for their pathogenicity, and identified through morphological studied and multi-gene phylogenetic analysis of ITS, TUB2, ACT and GPDH. 【Result】The strains on PDA were colorless at first, and then turned grey and grey-black after seven-days incubation at 25 ℃. Their conidia were colorless and single-celled, oblong, both blunt ends and averaged (17.09±1.11)μm×(5.26±0.55)μm. Conidial appressoria were ellipse, brown, smooth, complete and averaged (7.72±0.77)μm×(5.45±0.68)μm. Multiple-gene phylogenetic analyses indicated that these isolates were grouped in the same clade includingColletotrichumhoriiWeir&Johnst.【Conclusion】The strains were identified asC.horii. This is a new pathogen ofIlliciumverumAnthracnose.

Illiciumverum; Anthracnose;Colletotrichumhorii; Pathogen identification

1001-4829(2017)10-2242-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.014

2017-06-21

廣西林業(yè)科技項目(桂林科字[2013]第15號)

廖旺姣(1980-)，女，廣西靈川人，碩士，工程師，主要從事林木病害研究，E-mal: liaowangjiao@126.com。

S573

A

(責(zé)任編輯 陳 格)