胡廣隆，陳亞娟，魏建華,王宏芝，張杰偉

(北京市農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097)

蘭花磷酸肌醇特異性磷脂酶C基因家族生物信息學(xué)分析

胡廣隆，陳亞娟，魏建華,王宏芝*，張杰偉*

(北京市農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097)

【目的】為研究蘭花(Phalaenopsisequestris)中PI-PLC基因家族各成員在蘭花中的生理功能?！痉椒ā坷锰m花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，獲得蘭花PI-PLC基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)、染色體定位和編碼蛋白，經(jīng)過(guò)多重序列比對(duì)進(jìn)行進(jìn)化和分類分析?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明：蘭花基因組中含有3個(gè)PI-PLC家族基因成員，分別含有9～13個(gè)外顯子。TMHMM跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析顯示，蘭花PI-PLC蛋白均不含有跨膜區(qū)；MEME保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，蘭花PI-PLC 蛋白均含有4個(gè)保守的EF、X、Y和C2結(jié)構(gòu)域?！窘Y(jié)論】以上結(jié)果對(duì)解析蘭花PI-PLC蛋白的生物學(xué)功能提供重要的線索。

磷酸肌醇特異性磷脂酶C; 蘭花; 基因家族; 進(jìn)化分析

【研究意義】磷酸肌醇特異性磷脂酶C(phosphoinositide-specific phospholipase C，PI-PLC)是一類能特異性水解4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)的磷脂酶，在其催化下，生成兩個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的第二信使——1,2-二酰甘油(DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)[1-2]。最新的研究表明：在植物細(xì)胞中，脂溶性DAG停留在細(xì)胞膜上，在二酰甘油激酶的作用下生成磷脂酸(phosphatidic acid, PA)，PA與特定的蛋白激酶、脂激酶和NADPH氧化酶等蛋白相互作用[3]；而水溶性IP3進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在一系列磷酸激酶的作用下可以快速轉(zhuǎn)化為IP4、IP5，最終轉(zhuǎn)化為IP6, 促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)中Ca2+內(nèi)流，從而調(diào)節(jié)Ca2+濃度及Ca2+依賴的酶類或Ca2+依賴的通道[1-2]；進(jìn)而調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、非生物脅迫和細(xì)胞死亡等生理過(guò)程[1-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】高等植物中，擬南芥PI-PLC蛋白生物功能解析較為清晰。擬南芥PI-PLC基因家族有9個(gè)成員[4-5]。其中擬南芥AtPLC1(At5g58670)在不依賴ABA的高滲脅迫中發(fā)揮著重要作用[6]；擬南芥AtPLC2(At3g08510)在生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)的雌雄配子體的發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[7]；擬南芥AtPLC3(At4g38530)和AtPLC9(At3g47220)在植株耐熱性方面發(fā)揮著重要作用[1,8]，在擬南芥中過(guò)量表達(dá)擬南芥AtPLC5(At5g58690)引起擬南芥葉片早衰，在煙草中過(guò)量表達(dá)擬南芥AtPLC5(At5g58690)引起煙草點(diǎn)狀死亡[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】蘭科是被子植物門中第三大科，其具有重要的商品特性。2014年11月24日小蘭嶼蝴蝶蘭[Phalaenopsisequestris(Schauer) Rchb.f.]的全基因組以封面文章的形式在Nature Genetics雜志公開(kāi)發(fā)表[10]，為后續(xù)利用生物信息學(xué)分析和鑒定蘭花基因組奠定了序列基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究充分利用蘭花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，著重分析蘭花PI-PLC基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)、染色體定位和編碼蛋白、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)特性及編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域，為克隆蘭花PI-PLC基因(PePLC)提供重要的序列信息，為深入研究PePLC 蛋白的功能奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蘭花PI-PLC基因家族全基因組、cDNA和蛋白序列的獲得

擬南芥(Arabidopsisthaliana)PI-PLC基因及蛋白序列下載自TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arabidopsis.org)，水稻(OryzasativaL. spp.Japonicacv.Nipponbare)PI-PLC基因及蛋白序列下載自RAP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)，蘭花(P.equestris)PI-PLC基因及蛋白序列均下載自P. equestris Genome數(shù)據(jù)庫(kù)(http://orchidbase.itps.ncku.edu.tw/est/P_Equestris_Genome.aspx)。

以水稻(O.sativa)PI-PLC基因家族蛋白質(zhì)序列OsPLC1(Os07g49330)、OsPLC2 (Os03g18010)、OsPLC3(Os12g37560)和OsPLC4 (Os05g03610)為參比序列，利用蘭花P. equestris Genome數(shù)據(jù)庫(kù)分別進(jìn)行BlastP檢索，檢索結(jié)果的全序列E值大于e-8的舍去，再利用NCBI提供的在線CDS 軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)預(yù)測(cè)這些蛋白有無(wú)PI-PLC 結(jié)構(gòu)域，存在PI-PLC 結(jié)構(gòu)域的蛋白序列屬于PI-PLC基因家族。

1.2 蘭花PI-PLC基因家族結(jié)構(gòu)分析

利用P.equestrisGenome數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取蘭花(P.equestris)中PI-PLC基因家族成員的基因注釋，根據(jù)各成員的內(nèi)含子和外顯子的大小和數(shù)目，用手繪制其各自基因結(jié)構(gòu)示意圖。

1.3 蘭花PI-PLC基因家族二級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)工具對(duì)PI-PLC 基因家族各成員編碼蛋白的氨基酸相似性進(jìn)行分析[11]，利用在線二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對(duì)蘭花(P.equestris)PI-PLC蛋白的α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[12]。利用在線軟件TMHMM Server v. 2. 0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對(duì)蘭花(P.equestris)PI-PLC蛋白的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析[13]。

1.4 蘭花PI-PLC基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析

應(yīng)用在線軟件MEME(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)對(duì)擬南芥、水稻和蘭花(P.equestris)PI-PLC蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析[14]。

1.5 蘭花PI-PLC蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

應(yīng)用在線三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件Swiss-Model (https://swissmodel.expasy.org/) ，選取其自動(dòng)建模功能對(duì)蘭花(P.equestris)PI-PLC蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行同源建模分析[15]。

1.6 蘭花PI-PLC蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

通過(guò)Clustal X(2.0)[16]軟件對(duì)擬南芥、水稻和蘭花(P.equestris)的PI-PLC蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，使用MEGA 6.0[17]軟件將序列比對(duì)結(jié)果采用Neighborjoining法(bootstrap值設(shè)為1000)生成PI-PLC蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘭花PI-PLC 基因家族成員的鑒定和命名

根據(jù)水稻中已經(jīng)鑒別出來(lái)的4個(gè)PI-PLC蛋白序列，分別利用P.equestrisGenome數(shù)據(jù)庫(kù)提供的Blast 程序中進(jìn)行BlastP，得到8個(gè)蘭花(P.equestris)候選PI-PLC基因。利用保守域在線預(yù)測(cè)軟件CDS進(jìn)行驗(yàn)證PI-PLC保守結(jié)構(gòu)域的存在，初步確定了蘭花(P.equestris)中含有3個(gè)PI-PLC基因。根據(jù)蘭花(P.equestris)PI-PLC基因在染色體上的定位分別命名為PePLC1-3，其分別含有9～13個(gè)外顯子(圖1)，各成員的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度、氨基酸長(zhǎng)度、染色體定位和外顯子個(gè)數(shù)等詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

2.2 蘭花PI-PLC 基因家族結(jié)構(gòu)分析

利用在線Clustal Omega對(duì)PI-PLC基因家族各成員編碼蛋白的氨基酸相似性進(jìn)行分析，分析表明，蘭花PePLC1蛋白和PePLC3蛋白相似性最高，為70.07 %，蘭花PePLC2蛋白和PePLC3蛋白相似性最低，為59.52 %(表2)。利用在線二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件SOPMA 對(duì)蘭花PI-PLC基因家族各成員編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。分析表明：蘭花PI-PLC蛋白中無(wú)規(guī)則卷曲的比例最高(33.81 %～37.50 %)，其次為α-螺旋(30.48 %～33.39 %)，再次為β-折疊(20.16 %～23.02 %)，β-轉(zhuǎn)角最低(9.53 %～12.70 %)(表3)。利用在線軟件TMHMM Server v. 2. 0對(duì)蘭花PI-PLC蛋白的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：蘭花PI-PLC蛋白均不含有跨膜區(qū)(圖2)。

表1 蘭花PI-PLC基因家族的基本特征

圖1 蘭花PI-PLC基因家族結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Gene structure of the orchid PI-PLC gene family

使用在線保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)軟件MEME 對(duì)擬南芥、水稻和蘭花PI-PLC基因家族保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明擬南芥、水稻和蘭花PI-PLC基因家族包含4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。其中，基序1為EF結(jié)構(gòu)域，相似度為8.0e-594；基序2和基序3 分別是X 和Y結(jié)構(gòu)域(共同組成PI-PLC蛋白催化結(jié)構(gòu)域)，相似度為分別為5.7e-509和3.9e-348；基序4為C2結(jié)構(gòu)域，相似度為3.2e-371(圖3)。無(wú)論在單子葉植物水稻和蘭花中，還是在雙子葉植物擬南芥中，PI-PLC基因家族均含有EF、X、Y和C2 4個(gè)結(jié)構(gòu)域，這表明PI-PLC蛋白在進(jìn)化過(guò)程中存在高度保守的結(jié)構(gòu)域(圖3)。

圖2 蘭花PI-PLC蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of transmembrane structure of PI-PLC proteins in Orchid

PI-PLC家族PePLC2PePLC3PePLC165.2970.07PePLC259.52

表3 蘭花PI-PLC蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息

圖3 擬南芥、水稻和蘭花的PI-PLC家族基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域分布Fig.3 Distribution of conserved motifs in Arabidopsis, rice and orchid PI-PLC proteins

圖4 蘭花3條PI-PLC蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Tertiary structure of 3 orchid PI-PLC proteins

蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)是在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上借助各種次級(jí)鍵卷曲折疊成特定的球狀分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，本研究采用Swiss-Model對(duì)蘭花PI-PLC蛋白進(jìn)行同源建模，圖4表明：蘭花PI-PLC蛋白最終形成的三級(jí)結(jié)構(gòu)在空間結(jié)構(gòu)非常相似，然而無(wú)規(guī)則卷曲的比例最高，暗示不同蘭花PI-PLC蛋白在生物學(xué)功能上存在很高的保守性，不過(guò)特定的PI-PLC蛋白在特定的環(huán)境及時(shí)空中又具有各自的特異性。

2.3 蘭花PI-PLC 家族蛋白相似性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用進(jìn)化樹(shù)分析軟件MEGA 6.0 對(duì)9個(gè)擬南芥PI-PLC蛋白、4個(gè)水稻PI-PLC蛋白、3個(gè)蘭花PI-PLC蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示：這16

個(gè)PI-PLC蛋白并沒(méi)有完全按照物種聚類在一起，而是混合分布在一起。PI-PLC蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)基本上按照單子葉植物和雙子葉植物聚類在一起，推測(cè)PI-PLC蛋白在單子葉植物和雙子葉植物中具有各自特異的生物學(xué)功能，暗示PI-PLC蛋白在植物進(jìn)化過(guò)程中可能具有不同的進(jìn)化過(guò)程。水稻OsPLC4與擬南芥AtPLC1(At5g58670)和AtPLC3(At4g38530)聚類在一起，暗示水稻OsPLC4可能具有與雙子葉植物擬南芥AtPLC1(At5g58670)和AtPLC3(At4g38530)相似的進(jìn)化過(guò)程和生物學(xué)功能(圖5)。蘭花PePLC1～3和水稻的OsPLC1～3聚類在一起，暗示他們具有相似的生物學(xué)功能(圖5)。

圖5 擬南芥、水稻和蘭花的PI-PLC蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree for Arabidopsis, rice and orchid PI-PLC proteins

3 討 論

PI-PLC是磷酸肌醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一類關(guān)鍵水解酶，研究表明：植物PI-PLC參與了生物脅迫、非生物脅迫、調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架等多個(gè)生理過(guò)程[1-9,18-20]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PI-PLC基因家族已經(jīng)陸續(xù)在擬南芥[4]、水稻[5]、番茄[21]中鑒定，但蘭花PI-PLC基因家族尚未鑒定。本研究鑒定蘭花PI-PLC基因家族含有3個(gè)成員，而已鑒定的擬南芥、水稻和番茄PI-PLC基因家族分別含有9個(gè)、4個(gè)和6個(gè)成員，這說(shuō)明在進(jìn)化過(guò)程中，PI-PLC基因可能經(jīng)歷了不斷發(fā)生譜系的特異擴(kuò)張和拷貝丟失。蘭花PI-PLC基因家族的3個(gè)成員分別含有9～13個(gè)外顯子，均不含有跨膜區(qū)，均含有EF、X、Y和C2 4個(gè)結(jié)構(gòu)域，這表明不同物種PI-PLC基因家族中重要結(jié)構(gòu)域的高度保守性。推測(cè)他們?cè)谥参镏T多生理過(guò)程中發(fā)揮相似的作用。而不同物種中含有的成員數(shù)目各不相同，推測(cè)他們?cè)谔囟ǖ臅r(shí)空和組織響應(yīng)不同的刺激從而精細(xì)調(diào)節(jié)各生理過(guò)程。

進(jìn)化分析表明，蘭花PePLC1～3和水稻的OsPLC1～3聚類在一起，暗示他們可能具有相似的生物學(xué)功能(圖5)。其中蘭花PePLC1、PePLC2和水稻OsPLC1、OsPLC2，蘭花PePLC3和OsPLC3同源性較高。與水稻OsPLC2同源性最高的秈稻OsIPI-PLC1(OryzasativaL. Spp.indicaS.Katocv.yuanfengzao)參與了水稻抗病的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[22]，水稻OsPLC2和OsPLC3均被證明具有典型的PI-PLC生物學(xué)功能，且均定位于質(zhì)膜上，OsPLC3正向調(diào)節(jié)水稻的耐鹽性[23]。據(jù)此推測(cè)蘭花PePLC1和PePLC2可能參與蘭花的抗病過(guò)程，PePLC3可能參與蘭花的耐鹽過(guò)程。

蘭花PePLC1和PePLC2、水稻OsPLC1和OsPLC2、擬南芥AtPLC1(At5g58670)和AtPLC3(At4g38530)、AtPLC2(At3g08510)和AtPLC7(At3g55940)、AtPLC8(At3g47290)和AtPLC9(At3g47220)高度同源(圖5)，研究表明：AtPLC1(At5g58670)響應(yīng)了干旱、鹽脅迫、低溫脅迫[24]和ABA的次級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[25]。AtPLC3(At4g38530)不僅參與了擬南芥的開(kāi)花過(guò)程，而且參與了擬南芥的耐熱反應(yīng)[1,8]。表明聚類在一起的同源基因可能具有不同的生物學(xué)功能，因此不能簡(jiǎn)單推測(cè)PePLC1和PePLC2參與蘭花的抗病過(guò)程。蘭花PePLC各成員特定的生物學(xué)功能還需要從蘭花中克隆后逐一解析其功能。

4 結(jié) 論

蘭花基因組中鑒定出3個(gè)PI-PLC家族基因成員，含有9～13個(gè)外顯子。蘭花PePLCs蛋白均不含跨膜區(qū)、均含有4個(gè)高度保守的(EF、X、Y和C2)結(jié)構(gòu)域。

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BioinformaticsAnalysisofPhosphoinositide-specificPhospholipaseCGeneFamilyinOrchid[Phalaenopsisequestris(Schauer)Rchb.f.]

HU Guang-long, CHEN Ya-juan, WEI Jian-hua, WANG Hong-zhi*, ZHANG Jie-wei*

(Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing Key Laboratory of Agricultural Genetic Resources and Biotechnology, Beijing 100097, China)

【Objective】The study aims to study the function ofPhalaenopsisequestrisPI-PLCgene family members in Orchid. 【Method】On the basis of orchid genome database and bioinformatics analysis, we obtained orchidPI-PLCgene family structure and their positions on chromosome and duplication information. 【Result】The results showed that 3PePLCgenes existed in the orchid genome, contained 9-13 extrons. TMHMM results showed that all PePLC proteins don’t contain transmembrane structure. Multiple alignment and motif display results indicated that all PePLC proteins contain four conserved domains (EF, X, Y and C2). 【Conclusion】The results would provide the important clues for functional studies of orchid PI-PLC proteins.

PI-PLC;Phalaenopsisequestris; Gene family; Phylogeny analysis

1001-4829(2017)10-2218-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.010

2016-12-29

北京市科技計(jì)劃(Z171100001517011)；北京市農(nóng)林科學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目(QNJJ201416)；北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)(KJCX20170203)

胡廣隆(1981-)，男，助理研究員，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)，E-mail：532476467@qq.com，*為通訊作者：王宏芝，副研究員，研究方向?yàn)榱帜痉肿由飳W(xué)，E-mail：wanghongzhi@baafs.net.cn，張杰偉，副研究員，研究方向?yàn)橹参锟鼓嫔砼c分子生物學(xué)，E-mail：jwzhang919@163.com。

S682.31

A

(責(zé)任編輯 李 潔)