帥 良，廖玲燕，韓冬梅，吳振先

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.賀州學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院/食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西 賀州 542899；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹(shù)研究所，廣東 廣州 510640)

龍眼中性轉(zhuǎn)化酶基因(DlNI)的克隆及分析

帥 良1,2，廖玲燕2，韓冬梅3*，吳振先1*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.賀州學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院/食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西 賀州 542899；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹(shù)研究所，廣東 廣州 510640)

【目的】中性轉(zhuǎn)化酶是果實(shí)蔗糖代謝關(guān)鍵酶之一，克隆中性轉(zhuǎn)化酶基因?qū)τ诮沂君堁酃麑?shí)糖代謝具有重要的意義。【方法】以‘石硤’龍眼試材，采用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)成功克隆了3個(gè)龍眼中性轉(zhuǎn)化酶基因全長(zhǎng)cDNA序列?！窘Y(jié)果】3個(gè)龍眼中性轉(zhuǎn)化酶基因全長(zhǎng)cDNA序列分別命名為DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3，NCBI登錄號(hào)為KP769773、KP769774和KP769775，其中DlNI-1全長(zhǎng)2090 bp，編碼589個(gè)氨基酸，比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與木薯(82 %)的中性轉(zhuǎn)化酶基因的氨基酸序列同源性最高；DlNI-2全長(zhǎng)2558 bp，編碼709個(gè)氨基酸，比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與克萊門(mén)柚(80 %)的中性轉(zhuǎn)化酶基因的氨基酸序列同源性最高；DlNI-3全長(zhǎng)2444 bp，編碼805個(gè)氨基酸，比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與克萊門(mén)柚(80 %)的中性轉(zhuǎn)化酶基因的氨基酸序列同源性最高。3個(gè)龍眼中性轉(zhuǎn)化酶基因的氨基酸序列都具有中性轉(zhuǎn)化酶的12個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，并且都具有2個(gè)催化殘基，推測(cè)其蛋白都屬于α類，且都定位于細(xì)胞器中。3個(gè)基因在不同組織中表達(dá)量具有較大差異，其中DlNI-1和DlNI-2在葉片中都具有較高的表達(dá)量，而DlNI-3在果皮組織中具有最高的表達(dá)量。【結(jié)論】成功克隆了3個(gè)龍眼中性轉(zhuǎn)化酶基因，為后期深入研究中性轉(zhuǎn)化酶基因結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

龍眼；中性轉(zhuǎn)化酶；基因克??；表達(dá)

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為“石硤”龍眼(DimocarpuslonganLour.‘Shixia’)，采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所種質(zhì)資源圃。組織特異性表達(dá)樣品分別使用“石硤”的根、莖、葉、花、幼果、成熟果實(shí)的果皮和果肉。其中根、莖、葉、幼果的采摘時(shí)間為龍眼果實(shí)謝花后30 d。

本實(shí)驗(yàn)中所用的Amp、X-gal、IPTG、氯化鈉、氯化鈣、四硼酸鈉、硼酸、磷酸鈉、LB培養(yǎng)基等試劑購(gòu)自上海生物工程有限公司；RNAOUT試劑盒購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；瓊脂糖、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、TaKaRa PCR Amplification kit、PMD 20-T Vector kit、TaKaRa 3’-Full RACE Core Set Ver.2.0和TaKaRa Gel DNA Purification Kit Ver2.0等購(gòu)自TaKaRa公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Life公司；SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒購(gòu)自Clontech公司；熒光定量試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成 龍眼不同組織總RNA的提取采用RNAOUT試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作要求進(jìn)行。去基因組DNA后，以總RNA為模板合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄采用M-MLV (Life)，引物采用Oligo(dT)15Primer (TaKaRa)。cDNA的合成反應(yīng)體系按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。反應(yīng)體系于PCR儀中進(jìn)行如下反應(yīng)程序：37 ℃ 80 min，70 ℃ 15 min。得到的cDNA于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 龍眼DlNI基因的中間片段克隆 依據(jù)GenBank上已經(jīng)報(bào)道的其它物種的中性轉(zhuǎn)化酶基因序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物P1和P2(表1)。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段，切膠，回收，連接轉(zhuǎn)化，測(cè)序。通過(guò)去載體分析所擴(kuò)增的片段。

國(guó)家水資源監(jiān)控能力建設(shè)。項(xiàng)目建設(shè)全面推進(jìn)。積極開(kāi)展三大監(jiān)控體系建設(shè)，完成中央、流域、省級(jí)水資源監(jiān)控管理三級(jí)信息平臺(tái)和水資源管理業(yè)務(wù)三級(jí)通用軟件開(kāi)發(fā)；加強(qiáng)建設(shè)管理，完成制度體系建設(shè)；搭建技術(shù)框架，各地編制技術(shù)方案通過(guò)審查。

1.2.3 龍眼DlNI基因的3’-RACE克隆和5’-RACE克隆 根據(jù)所得到的片段序列，利用Primer Premier 5.0軟件，參照TaKaRa 3’-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒和Clontech SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit要求設(shè)計(jì)3’-RACE(P3、P4、P5、P6、P7、P8)和5’-RACE(P9、P10、P11)引物(表1)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增，目的基因片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定、測(cè)序及結(jié)果分析同上。

1.2.4 龍眼DlNI基因全長(zhǎng)的獲得及ORF驗(yàn)證 將上述獲得的3’RACE和5’RACE結(jié)果序列和片段序列采用ContigExpress軟件進(jìn)行拼接，獲得DlNI基因全長(zhǎng)cDNA序列，通過(guò)使用NCBI的Blast和SIB的翻譯工具(Translate tool)(http://web.expasy.org/translate/)進(jìn)行序列分析，找出基因全長(zhǎng)序列的開(kāi)放閱讀框(ORF)，設(shè)計(jì)ORF序列引物(P12和P13、P14和P15、P16和P17)，對(duì)ORF序列進(jìn)行克隆，檢測(cè)，以確定所拼接的序列為正確的基因序列(表1)。

1.2.5 龍眼DlNI基因的生物信息學(xué)分析 使用NCBI上的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)工具查找基因的ORF；使用SIB(Swiss Institute of Bioinformatics)的(Translate tool)(http://web.expasy.org/translate/)對(duì)ORF進(jìn)行翻譯；蛋白質(zhì)分子量及理化性質(zhì)分析采用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)工具分析；使用NCBI上的Blastn和Blastx對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析；同源性及序列多重比較分析使用Clustal X 1.83軟件并用GeneDoc軟件進(jìn)行美化編輯；運(yùn)用MEGA 5軟件中的Neighbor-Joining(鄰位相連法，NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)并進(jìn)行編輯。

表1 龍眼中性轉(zhuǎn)化酶基因克隆與表達(dá)分析中使用的引物

1.2.6 Real-time定量RT-PCR(RT-qPCR) 使用BatchPrimer3在線引物設(shè)計(jì)工具，進(jìn)行RT-qPCR的引物序列設(shè)計(jì)(P18和P19、P20和P21、P22和P23、P24和P25、P26和P27)。RT-qPCR使用熒光染料為SYBR Green I Master(Roche)，儀器為Roche Lightcycler?480，使用384孔模塊。10 μl擴(kuò)增體系：cDNA模板1 μl，5 μM的上游引物和下游引物各0.5 μl，SYBR Green I Master(Roche)5 μl，ddH2O 3 μl。使用DlActin和DlEF-1a基因作為雙內(nèi)參進(jìn)行RT-qPCR分析[19-20]。并用相對(duì)定量軟件對(duì)PCR結(jié)果的熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析、定量。相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用2-△△CT法，由Roche Lightcycler?480軟件系統(tǒng)自動(dòng)分析得出結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理與作圖

使用Microsoft Office 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，使用Origin 8.5作圖，并使用Adobe Illustrator CS6軟件進(jìn)行圖形美化和編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍眼總RNA的提取

如圖1所示，圖中28S和18S兩條rRNA條帶完整清晰，且沒(méi)有明顯的拖帶現(xiàn)象，28S條帶比18S條帶要亮，說(shuō)明RNA完整性較好，未發(fā)生降解。經(jīng)測(cè)定提取的龍眼各組織混合總RNA的OD260/OD280比值均在1.8 ～ 2.0，OD260/OD230比值均高于2.0，說(shuō)明提取的龍眼總RNA的質(zhì)量較高，純度和完整性較好，可以用于基因克隆和熒光定量表達(dá)等后續(xù)分子生物學(xué)相關(guān)試驗(yàn)。

圖1 龍眼總RNA的電泳圖Fig.1 Electrophoresis pattern of total RNA of longan

2.2 龍眼糖代謝相關(guān)基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增

以龍眼不同組織混合cDNA為模板，使用P1和P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條長(zhǎng)度為400 bp左右的片段(圖2A)，切膠，回收，連接，轉(zhuǎn)化后送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，本次擴(kuò)增成功獲得了3條長(zhǎng)度為363 bp的龍眼NI基因序列，分別命名為DlNI-1，DlNI-2和DlNI-3。

根據(jù)測(cè)序得到的DlNI-1、DlNI-2、DlNI-3基因片段序列，設(shè)計(jì)3’RACE(P3、P4、P5、P6、P7、P8)引物(表1)，按照TaKaRa 3’-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒內(nèi)的PCR條件進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)后均得到與目的片段相符的特異性片段，DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3的3’RACE第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物約600、700和600 bp(圖2B)，這些片段大小基本與預(yù)期相符合，切膠，回收，連接，轉(zhuǎn)化后送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分析表明，所獲得的3’末端序列與擴(kuò)增的片段序列有相應(yīng)的高度重復(fù)的片段，說(shuō)明各基因的3’末端序列擴(kuò)增成功。

根據(jù)測(cè)序得到的糖代謝相關(guān)基因片段DlNI-1、DlNI-2、DlNI-3的序列，設(shè)計(jì)5’RACE(P9、P10、P11)引物(表1)，按照Clontech SMARTTMRACE cDNAAmplification Kit試劑盒內(nèi)PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測(cè)后均得到相應(yīng)的與目的片段相符的特異性片段，DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3的5’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物約1500、1700和1700 bp左右(圖2C)，這些片段大小基本與預(yù)期相符合，切膠，回收，連接，轉(zhuǎn)化后送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分析表明，所獲得的5’末端序列與擴(kuò)增的片段序列有相應(yīng)的高度重復(fù)的片段，說(shuō)明各基因的5’末端序列擴(kuò)增成功。

M：DL2000；A：中間片段擴(kuò)增結(jié)果；B：3’端片段擴(kuò)增結(jié)果；C：5’端片段擴(kuò)增結(jié)果；D：ORF序列擴(kuò)增結(jié)果M: DL2000; A: Intermediate fragment; B: 3’ RACE result; C: 5’ RACE result; D: PCR product of ORF圖2 龍眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因序列擴(kuò)增Fig.2 PCR product of DlNI-1, DlNI-2 and DlNI-3 gene from longan

根據(jù)擴(kuò)增的糖代謝相關(guān)基因片段以及3’RACE和5’RACE結(jié)果，使用ContigExpress軟件對(duì)片段序列進(jìn)行拼接，分別獲得各基因全長(zhǎng)cDNA序列，再使用NCBI上的ORF Finder對(duì)序列ORF進(jìn)行查找，根據(jù)ORF序列設(shè)計(jì)ORF全長(zhǎng)(P12和P13、P14和P15、P16和P17)引物(表1)，驗(yàn)證拼接全長(zhǎng)序列的準(zhǔn)確性，使用LATaq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)后均發(fā)現(xiàn)與預(yù)測(cè)片段大小相一致的條帶，DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3的ORF擴(kuò)增產(chǎn)物約1900、2300和2100 bp左右(圖2D)，切膠，回收，連接，轉(zhuǎn)化后送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果去載體后經(jīng)Blast比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，各基因條帶的ORF序列都正確，結(jié)果表明成功獲得了DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因全長(zhǎng)cDNA序列。

2.3 龍眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因的序列分析

圖3顯示，DlNI-1基因序列全長(zhǎng)2090 bp，包括一個(gè)長(zhǎng)度為96 bp的5’UTR和224 bp的3’UTR，ORF長(zhǎng)度為1770 bp，編碼589個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為66.40 kDa，等電點(diǎn)為6.18，蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為47.87，脂溶指數(shù)為89.61，其疏水性平均值為﹣0.187，表明該蛋白為親水不穩(wěn)定脂溶蛋白，NCBI的登錄號(hào)為KP769773，經(jīng)Blastn比對(duì)后發(fā)現(xiàn)與甜橙(XM_006471320.1和XM_006471319.1)和克萊門(mén)柚(XM_006424241.1)的NI基因核苷酸序列同源性最高，都高達(dá)89 %，BlastX比對(duì)結(jié)果顯示，與木薯(XP_007024490.1)、蓖麻(XP_002529075.1)和甜橙(XP_006471382.1)的NI基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性最高，分別為82 %，81 %和76 %。

DlNI-2基因序列全長(zhǎng)2558 bp，包括一個(gè)長(zhǎng)度為113 bp的5’UTR和315 bp的3’UTR，ORF長(zhǎng)度為2130 bp，編碼709個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為79.91 kDa，等電點(diǎn)為7.92，蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為38.03，脂溶指數(shù)為85.64，其疏水性平均值為﹣0.114，表明該蛋白為親水穩(wěn)定脂溶蛋白，NCBI的登錄號(hào)為KP769774，經(jīng)Blastn比對(duì)后發(fā)現(xiàn)與甜橙(XM_006472173.1)和克萊門(mén)柚(XM_006433502.1)的NI基因核苷酸序列同源性最高，都高達(dá)87 %，BlastX比對(duì)結(jié)果顯示，與克萊門(mén)柚(XP_006433565.1)和甜橙(XP_006472236.1、KDO81624.1)的NI基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性最高，都高達(dá)80 %。

DlNI-3基因序列全長(zhǎng)2444 bp，包括一個(gè)長(zhǎng)度為259 bp的5’UTR和148 bp的3’UTR，ORF長(zhǎng)度為2037 bp，編碼678個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為76.09 kDa，等電點(diǎn)為5.77，蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為35.94，脂溶指數(shù)為90.28，其疏水性平均值為-0.205，表明該蛋白為親水穩(wěn)定脂溶蛋白，NCBI的登錄號(hào)為KP769775，經(jīng)Blastn比對(duì)后發(fā)現(xiàn)與甜橙(XM_006488730.1)和克萊門(mén)柚(XM_006419242.1)的NI基因核苷酸序列同源性最高，都高達(dá)84 %，BlastX比對(duì)結(jié)果顯示，與克萊門(mén)柚(XP_006419305.1)和甜橙(XP_006488793.1)的NI基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性最高，都高達(dá)80 %。

下劃線表示保守區(qū)；箭頭表示催化殘基Underline indicate the motifs; Arrows show the catalytic residues圖3 眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Alignment of DlNI-1，DlNI-2 and DlNI-3 amino acid sequences

2.4 龍眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因的多序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析

龍眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，DlNI-1的氨基酸序列與DlNI-2和DlNI-3的氨基酸序列一致性為74 %和65 %，DlNI-2的氨基酸序列與DlNI-3的氨基酸序列一致性為68 %，同時(shí)這3個(gè)基因的氨基酸序列都具有中性轉(zhuǎn)化酶的12個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，并且都具有兩個(gè)催化殘基[21]。

為進(jìn)一步分析龍眼中性轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列的進(jìn)化關(guān)系，本試驗(yàn)從擬南芥中挑選At1g22650、At1g35580、At1g56560、At1g72000、At3g05820、AT3G06500、At4g09510、AT4G34860和At5g22510共9個(gè)中性轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列[22]，從水稻中挑選BAH00142、BAH00419、BAG89564和BAG95698 4個(gè)中性轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列[21, 23]，和龍眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

由進(jìn)化樹(shù)結(jié)果可知，中性轉(zhuǎn)化酶可以明顯的分為α和β兩大類[13, 21]，其中α類的中性轉(zhuǎn)化酶主要定位于細(xì)胞器中，而β類的中性轉(zhuǎn)化酶則定位于非細(xì)胞器中，而α類又可以分為兩大類，一類定位于線粒體中，另一類則在定位于質(zhì)體中[23]。本試驗(yàn)克隆的3個(gè)龍眼中性轉(zhuǎn)化酶蛋白推測(cè)都屬于α類，即都定位于細(xì)胞器中，其中龍眼DlNI-1與擬南芥At5g22510的進(jìn)化關(guān)系較近，可能定位于質(zhì)體中，而DlNI-2和DlNI-3分別與At1g56560和AT3G06500進(jìn)化關(guān)系較近，可能定位于線粒體中(圖4)。

2.5 龍眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因的不同組織特異性表達(dá)分析

龍眼不同組織中DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因的表達(dá)量相差較大，DlNI-1基因在葉片中具有最大的表達(dá)量，其次為花、幼果、根、果皮和果肉，表達(dá)量最小的為莖中(圖5 A)；DlNI-2基因在葉片中具有最大的表達(dá)量，其次為花、果皮、幼果、根和莖，表達(dá)量最小的為果肉中(圖5 B)；DlNI-3基因在果皮中具有最大的表達(dá)量，其次為葉片、根、花和幼果中，而在果肉中表達(dá)量較低，在莖中幾乎不表達(dá)(圖5 C)。由此可知DlNI-1和DlNI-2基因可能在調(diào)節(jié)葉片組織中蔗糖含量的高低起作用，而DlNI-3基因在果皮組織中起調(diào)節(jié)果皮蔗糖含量。

圖4 龍眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic analysis of DlNI-1, DlNI-2 and DlNI-3 and other plant NI amino acid sequences

圖5 龍眼DlNI-1(A)、DlNI-2(B)和DlNI-3(C)基因在不同組織中的表達(dá)Fig.5 DlNI-1 (A), DlNI-2 (B) and DlNI-3 (C) gene expression in different tissues of longan

3 討論與結(jié)論

中性轉(zhuǎn)化酶最基本的功能是分解蔗糖成為葡萄糖和果糖，相比于在酸性轉(zhuǎn)化酶上的研究成果，目前對(duì)中性轉(zhuǎn)化酶的功能了解還較少，主要原因是因?yàn)橹行赞D(zhuǎn)化酶蛋白具有不穩(wěn)定性和低活性的特點(diǎn)[5, 24]。隨著近年來(lái)對(duì)其研究的深入，發(fā)現(xiàn)中性轉(zhuǎn)化酶在影響擬南芥?zhèn)雀L(zhǎng)，百脈根花粉形成及開(kāi)花的過(guò)程中起主要作用[25-26]。通過(guò)RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)成功克隆了3個(gè)龍眼中性轉(zhuǎn)化酶基因全長(zhǎng)cDNA序列，分別命名為DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3，NCBI登錄號(hào)為KP769773、KP769774和KP769775。其中DlNI-1全長(zhǎng)2090 bp，編碼589個(gè)氨基酸，氨基酸序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與木薯和蓖麻的中性轉(zhuǎn)化酶基因的氨基酸序列同源性最高；DlNI-2全長(zhǎng)2558 bp，編碼709個(gè)氨基酸，氨基酸序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與甜橙和克萊門(mén)柚的中性轉(zhuǎn)化酶基因的氨基酸序列同源性最高；DlNI-3全長(zhǎng)2444 bp，編碼805個(gè)氨基酸，氨基酸序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與甜橙和克萊門(mén)柚的中性轉(zhuǎn)化酶基因的氨基酸序列同源性最高。同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)中性轉(zhuǎn)化酶基因都具有12個(gè)中性/堿性轉(zhuǎn)化酶所特有的保守域，這些保守域具體功能還不是很清楚[21, 24]，進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，所有的中性轉(zhuǎn)化酶基因可以分類α和β兩大類[13, 21]，其中α類的中性轉(zhuǎn)化酶主要定位于細(xì)胞器中，而β類的中性轉(zhuǎn)化酶則在非細(xì)胞器中，其中α類又可以分為兩大類，一類在定位于線粒體中，而另一類則定位于質(zhì)體中[23]。分析發(fā)現(xiàn)龍眼DlNI-1可能定位于質(zhì)體中，而DlNI-2和DlNI-3分別可能定位于線粒體中。不同組織特異性表達(dá)結(jié)果顯示，DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3 3個(gè)基因在不同組織中表達(dá)量具有較大差異，其中DlNI-1和DlNI-2在葉片中都具有較高的表達(dá)量，這與在番茄[14]和大豆[27]中對(duì)中性轉(zhuǎn)化酶的研究結(jié)果一致。DlNI-1和DlNI-2在花中的表達(dá)量也較高，可能是由于植物進(jìn)入生殖生長(zhǎng)時(shí)期，庫(kù)器官生長(zhǎng)發(fā)育，不斷催化蔗糖水解為葡萄糖和果糖，對(duì)能量物質(zhì)需求過(guò)大所導(dǎo)致。而DlNI-3在果皮組織中具有最高的表達(dá)量，其次為根、葉片中，而在莖中幾乎不表達(dá)，由此可知DlNI-3在龍眼根生長(zhǎng)中不起作用，而在調(diào)節(jié)龍眼果皮中碳水化合物含量多少起主要作用。

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CloningandSequenceAnalysisofNeutralInvertaseGene(DlNI)fromLonganFruit

SHUAI Liang1,2, LIAO Ling-yan2, HAN Dong-mei3*, WU Zhen-xian1*

(1.College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangdong Guangzhou 510642, China; 2.College of Food and Biological Engineering/Institute of Food Science and Engineering Technology, Hezhou University, Guangxi Hezhou 542899, China; 3.Institute of Fruit Tree Research, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangdong Guangzhou 510640, China)

【Objective】Neutral invertase was a key enzyme of fruit sucrose metabolism, and cloning neutral invertase gene sequences had a significance for sugar metabolism. 【Method】TakenDimocarpuslongan‘Shixia’ cultivar as tested materials, the whole lengths of its three neutral invertase gene cDNA were cloned and sequenced by RT-PCR and RACE. 【Result】Three neutral invertase gene cDNAs named asDlNI-1,DlNI-2 andDlNI-3, the NCBI numbers were KP769773, KP769774 and KP769775, of which theDlNI-1 gene consisted of 2090 bp encoding a polypeptide of 589 amino acids, which had the highest homology with theManihotesculentacrantz(82 %) through the NCBI blastx; TheDlNI-2 gene consists of 2558 bp encoding a polypeptide of 709 amino acids, which had the highest homology with theCitrusclementina(80 %) through the NCBI blastx; TheDlNI-3 gene consists of 2444 bp encoding a polypeptide of 805 amino acids, which had the highest homology with theCitrusclementine(80 %) through the NCBI blastx. Amino acids of three longan neutral invertase gene sequence had 12 highly conservative domain structure and two catalytic residues, it was concluded that the three neutral invertase protein belonged to α class and located in organelles. The expression level of three neutral invertase genes had bigger difference in different tissues, theDlNI-1 andDlNI-2 had the highest expression level in leaves, but theDlNI-3 had the highest expression in pericarp. 【Conclusion】Three longan neutral invertase gene were cloned, which would provide references for the investigation of the relation between structure and function of neutral invertase gene.

Dimocarpuslongan; Neutral invertase; Gene cloning; Expression

1001-4829(2017)10-2202-08

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.008

2016-07-20

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(荔枝龍眼CARS-33-14)資助；廣東省揚(yáng)帆計(jì)劃項(xiàng)目(2014YT02H013)

帥 良(1986-)，男，江西新干人，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮，E-mail:shuailiang1212@163.com；*為通訊作者：韓冬梅，E-mail: handm2009@qq.com；吳振先，E-mail:litchi2008@126.com。

S667.2

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(責(zé)任編輯 陳 虹)