陳 超，張宇君，趙麗麗*，王普昶，申 記，唐華江

(1.貴州大學 動物科學學院草業(yè)科學系，貴州 貴陽 550025；2 貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006；3 貴州省印江土家族苗族自治縣農(nóng)牧科技局飼草飼料工作站，貴州 印江 555200)

高粱屬牧草分子指紋圖譜構(gòu)建及遺傳聚類分析

陳 超1，張宇君1，趙麗麗1*，王普昶2，申 記3，唐華江1

(1.貴州大學 動物科學學院草業(yè)科學系，貴州 貴陽 550025；2 貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006；3 貴州省印江土家族苗族自治縣農(nóng)牧科技局飼草飼料工作站，貴州 印江 555200)

【目的】為建立快速有效的高粱屬牧草品種鑒定分析方法?！痉椒ā坎捎没贒NA混池的ISSR分子標記技術，遵循多態(tài)性高、穩(wěn)定性強的原則，構(gòu)建高粱(Sorghumbicolor)、甜高粱(Sorghumdochna)、蘇丹草(SorghumSudanense)、高丹草(Sorghumbicolor×S.sudanense)4個高粱屬牧草共12個品種的數(shù)字指紋，并進行鑒定分析和聚類分析?！窘Y(jié)果】利用DNA混池技術從110個ISSR引物中篩選出13個多態(tài)性高、重復性好的擴增引物，計算出12個高粱屬牧草品種的遺傳相似系數(shù)在0.6867～0.9036。當Gs為0.786 時，12個品種可以聚為4類，第一類群包括6個高丹草品種和2個高粱品種；第二類群為2個甜高粱品種；第三類群為蘇丹草品種超級丹；第四類群為蘇丹草品種布魯賽。根據(jù)引物擴增位點的特異性，挑選出3條核心引物(引物S37結(jié)合S35和S50)，構(gòu)建出能區(qū)分12個高粱屬牧草品種的ISSR數(shù)字指紋?！窘Y(jié)論】利用ISSR分子標記技術能有效鑒定高粱屬牧草品種的純度、真?zhèn)?，揭示品種間遺傳差異。

高粱屬牧草；ISSR；數(shù)字指紋；聚類分析

【研究意義】高粱屬(SorghumMoench)隸屬于禾本科須芒草族(Andropogoneae，Poaceae)，一年生或多年生C4植物[1-4]，其種類繁多，大多數(shù)可以作為糧食、飼料和工業(yè)原料等，具有錄取較高的經(jīng)濟價值[5-6]。其中飼用高粱(S.bicolor)、甜高粱(S.dochna)、蘇丹草(S.Sudanense)和高丹草(S.bicolor×S.sudanense)具有較強的分蘗和再生能力，草質(zhì)柔軟，消化率高，營養(yǎng)價值好，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中作為飼料得到廣泛應用[7]。貴州自提出發(fā)展生態(tài)畜牧業(yè)以來，對優(yōu)良高粱屬牧草品種需求量日益提高[8]。相關科研人員開展了高粱屬牧草品種引種適應性研究，指出高粱屬牧草不同種甚至不同品種間由于種性差異，在生長特性和適應性方面存在較大差異，而種子外部形態(tài)差異較小，難以識別[5]。在市場上存在以次充好，用劣質(zhì)品種冒充優(yōu)勢品種欺騙消費者的狀況，常給農(nóng)民帶來較大經(jīng)濟損失[9]。因此，建立準確快捷的品種鑒定方法對規(guī)范種子市場迫切且必要。【前人研究進展】韓天文等利用酯酶同工酶電泳圖譜鑒別了我國審定登記的5個蘇丹草品種[10]。方雪恩以高粱屬植物的種子為試驗材料，基于醇溶蛋白A-PAGE建立了鑒定5種高粱屬植物方法[11]?！颈狙芯壳腥朦c】傳統(tǒng)的種子鑒定主要采用種子形態(tài)學鑒定、化學鑒定、幼苗特征鑒定等，存在鑒定周期長，易受環(huán)境條件影響，結(jié)果不夠準確等問題，不利于種子及時銷售[12-13]。ISSR(Inter Simple Sequence Repeat)技術可靈敏地揭示2個親緣關系十分相近個體之間的遺傳變異，已經(jīng)在作物、觀賞植物、牧草種間和種下的分類中取得較好結(jié)果[14-18]?！緮M解決的關鍵問題】以引種的12個不同高粱屬牧草品種為研究對象，應用基于DNA混池的ISSR分子標記技術構(gòu)建高粱屬牧草分子指紋圖譜，旨在建立一種快速、準確、經(jīng)濟的品種鑒定方法，為高粱屬牧草優(yōu)良品種保護提供依據(jù)。并分析供試高粱屬牧草品種的遺傳背景，分析不同品種之間的親緣關系，為進一步培育適應地區(qū)生產(chǎn)利用的高粱屬牧草新品種提供理論依據(jù)。

表1 12個高粱屬牧草品種的編號及名稱

1 材料與方法

1.1 供試材料

引種的12個高粱屬牧草品種(表1)由百綠國際草業(yè)有限公司、北京正道生態(tài)科技有限公司等提供，種植于貴州大學農(nóng)場實驗地。以種植當年各品種的幼嫩葉片為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取及DNA混池構(gòu)建 參照羅永聰?shù)萚19]的取樣方法。每個品種隨機選擇20個單株，各單株收集等量嫩葉裝入自封袋中，冷藏帶回實驗室。采用天根植物基因組提取試劑盒提取高粱屬牧草DNA，用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取結(jié)果。使用微量分光光度計測量DNA樣品濃度3次，取其平均值，用ddH2O將所有DNA樣品濃度調(diào)至100 ng/μl，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ISSR引物的篩選 所用引物均委托上海生物工程技術有限公司合成。采用DNA混池與ISSR引物進行擴增反應，通過3次反復檢測，從110個ISSR引物中篩選出13個重復性好、條帶多且清晰度高、多態(tài)性良好的引物(表2)。

1.2.3 PCR擴增體系 PCR反應體系為20 μl：DNA模版1 μl，2×TaqMaster Mix 10 μl，引物1 μl，ddH2O 8 μl。

1.2.4 反應程序 設置49、50、51、52、53和54 ℃共6個溫度梯度，摸索13個ISSR引物最適退火溫度。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，退火50 s，72 ℃延伸1 min，設置35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增后的PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以1和0分別代表某個等位基因位點擴增DNA條帶的有無，并將ISSR圖譜轉(zhuǎn)換為由1和0組成的字符串，構(gòu)建DNA數(shù)字指紋。在PopGene3.2軟件中假定哈迪-溫伯格平衡條件下計算平均遺傳相似系數(shù)，用NTSYS2.0軟件進行聚類分析[20]。

表2 13個ISSR引物序列和退火溫度

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR體系摸索

2.1.1 基因組DNA提取 從將提取的DNA用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(圖1)看出，DNA條帶集中，整齊明亮無拖尾，可用于下一步試驗。

M為DL 2000 marker，A～L分別為12個高粱屬牧草品種DNA提取結(jié)果M, Dl2000 marker; A-L, DNA extracted from 12 varieties respectively圖1 基因組DNA的提取檢測結(jié)果Fig.1 Detection results of genome DNA extraction

Z1～Z6依次代表49～54 ℃的退火溫度Z1-Z6 represents annealing temperature from 49 ℃to 54 ℃ successively圖2 引物S122最適退火溫度摸索結(jié)果Fig.2 Optimum annealing temperature of S122 primer

2.1.2 最適退火溫度的優(yōu)化 13個ISSR引物的最適退火溫度詳見表2。以引物S122退火溫度摸索結(jié)果(圖2)為例，Z4(52 ℃)與Z5(53 ℃)條帶明亮清晰，Z6(54 ℃)擴增條帶不清晰，Z1(49 ℃)、Z2(50 ℃)和Z3(51 ℃)處理條帶出現(xiàn)離散分布，確定引物S122的最適退火溫度為52 ℃。

2.2 高粱屬牧草ISSR數(shù)字指紋構(gòu)建

利用13個ISSR引物擴增獲得高粱屬牧草品種的多態(tài)性圖譜，其中未發(fā)現(xiàn)能鑒別12個品種的單個ISSR引物。由圖3可知，擴增帶型主要分為三類，其中高丹草C(F8421)和J(斯威特)，甜高粱D(青貯大師)與高粱K(26837)擴增出的帶型相同，屬于第一類帶型；高丹草B(甜蜜蜜)、E(F8423)和G(超級糠王)，蘇丹草A(布魯賽)，以及甜高粱H(大力士)擴增的帶型相同，屬于第二類帶型；蘇丹草F(超級丹)、高丹草I(22050)和高粱L(金鷹)擴增出的帶型相同，屬于第三類帶型。結(jié)合引物S35的擴增結(jié)果，將甜高粱D(青貯大師)從第一類帶型中區(qū)分出來，將高丹草B(甜蜜蜜)和E(F8423)分別從第二類帶型中區(qū)分出來，將高丹草I(22050)從第三類帶型中區(qū)分出來。進一步結(jié)合引物S50的擴增結(jié)果，將高丹草C(F8421)和高粱K(26837)分別從第一類帶型中區(qū)分出來，將蘇丹草A(布魯賽)、高丹草G(超級糠王)和甜高粱H(大力士)分別從第三類帶型中區(qū)分出來。因此，在引物S37的基礎上結(jié)合S35和S50引物(圖4～5)，將ISSR圖譜轉(zhuǎn)換為由1和0組成的字符串后，形成了每個品種各自獨立的數(shù)字指紋，構(gòu)建出能區(qū)別12個高粱屬牧草品種的ISSR數(shù)字指紋(表3)。

圖3 引物S37在12個高粱屬牧草品種中擴增結(jié)果Fig.3 Amplification of primer S37 in 12 forage varieties

圖4 引物S35在12個高粱屬牧草品種中擴增結(jié)果Fig.4 Amplification of primer S35 in 12 forage varieties

圖5 引物S50在12個高粱屬牧草品種中擴增結(jié)果Fig.5 Amplification of primer S50 in 12 forage varieties

2.3 高粱屬牧草品種遺傳結(jié)構(gòu)

利用13個引物構(gòu)建的ISSR數(shù)據(jù)指紋計算出供試材料的遺傳相似系數(shù)，按UPGMA法進行聚類分析，建立聚類分枝樹狀圖(圖6)。12個高粱屬牧草品種的遺傳相似系數(shù)在0.6867～0.9036。當Gs為0.786時，可以把12個高粱屬牧草品種分為4類，第一類群包括6個高丹草品種和2個高粱品種；第二類群為2個甜高粱品種；第三類群為蘇丹草品種超級丹；第四類群為蘇丹草品種布魯賽。

3 討 論

3.1 高粱屬牧草品種ISSR指紋圖譜構(gòu)建的可行性

ISSR技術具有較穩(wěn)定的試驗重復性，已廣泛應用于野生植物天然居群的結(jié)構(gòu)分析、種質(zhì)資源的評價、栽培植物品種的鑒定等，特別是在品種鑒定方面有著無可替代的簡便性與實用性[21-22]。陳志丹等[23]通過ISSR技術，從11條引物中篩選出5條核心引物建立了安溪鐵觀音茶樹分子指紋圖譜，依據(jù)圖譜差異可以鑒定性狀不同的鐵觀音茶樹。尹明華等[24]應用ISSR技術鑒定出上饒早梨3個主栽品種的親緣關系及其不同繼代次數(shù)試管苗的遺傳變異，并利用挑選出的5條核心引物，構(gòu)建了上饒早梨3個主栽品種的DNA分子指紋圖譜，可鑒定上饒早梨主栽品種的歸屬地。Joshi等[25]利用ISSR分子標記檢測了飼料高粱品種的特異性，鑒定了品種真實性，提出ISSR可以輔助飼用高粱新品種的保護。本研究借鑒前人研究經(jīng)驗，以20個基因型(個體)的樣本量為基礎，采用混合取樣策略(bulking or pooling strategies)，在PCR體系摸索確定的基礎上，從初步篩選到的13個引物中確定出3個核心引物S37、S35和S50，形成了每個品種各自獨立的數(shù)字指紋，構(gòu)建出能區(qū)別12個高粱屬牧草品種的ISSR數(shù)字指紋。試驗條件中，采用混合取樣策略可以獲得供試各品種大多數(shù)個體均具有的條帶，避免某些個體稀有條帶出現(xiàn)。加之PCR體系的摸索和確定，保證了研究中12個高粱屬牧草品種鑒定數(shù)字指紋的有效性。有研究指出，數(shù)字指紋只有在固定的材料范圍內(nèi)有效，鑒別能力相對有限[26-27]。本研究所采用的高粱屬牧草品種數(shù)量有限，所獲得的3對核心引物的有效性還需要在更多的品種上加以驗證。

表3利用3個ISSR引物構(gòu)建的12個高粱屬牧草品種的數(shù)字指紋

Table 3 Digital fingerprint of 12 forage varieties established by 3 ISSR primers

編號Number材料名稱Materialname組合編碼指紋圖譜CombinatorialcodingfingerprintpatternS35-S37-S50A布魯賽1110011-010100-11010B甜蜜蜜1111011-010100-11010CF84211110011-111111-11010D青貯大師1111011-111111-11010EF84231111111-010100-11010F超級丹1111011-110111-11000G超級糠王1111011-010100-11110H大力士1111111-010100-11011I220501111011-110111-11010J斯威特1111111-111111-00000K268371111011-110111-01110L金鷹1110011-110111-11010

圖6 高粱屬牧草基于ISSR分析的聚類分析圖Fig.6 Clustering dendrogram of 12 forage varieties based on ISSR analysis

3.2 供試高粱屬牧草品種的遺傳聚類

相關學者已經(jīng)從生物學特性、分子水平等開展了高粱屬牧草遺傳及聚類分析，目前仍存在較多爭議。楊小翠等[28]通過54個生物學性狀對48個蘇丹草和高粱品種進行聚類分析，李杰勤等[29]利用RAPD技術研究32個栽培高粱品種、10個蘇丹草品種及2個高粱近緣種遺傳差異，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)使用生物學性狀或RAPD分子標記進行聚類均不能將高粱和蘇丹草區(qū)分開，這與Zhan Q W[30]利用SSR分子標記技術獲得的研究結(jié)果吻合，研究者建議將蘇丹草劃為雙色高粱種蘇丹草亞種。王芳等[5]利用15對SSR引物對129份高粱和蘇丹草的聚類分析中指出，高粱和蘇丹草均各自聚為一組，SSR引物可較好地將高粱與蘇丹草區(qū)分開。本研究利用ISSR技術鑒定出12個高粱屬牧草品種的遺傳相似系數(shù)在0.6867～0.9036，12個品種可以分為4類，第一類群包括全部的高丹草品種和高粱品種；第二類群全部為甜高粱品種；蘇丹草2個品種分別被歸為第三、四類。該聚類結(jié)果與目前劃分的親緣關系相符，更支持王芳等的研究結(jié)果，不同于楊小翠、李杰勤和Zhan Q W的研究結(jié)果。高丹草是以高粱為母本、蘇丹草為父本育成的材料。本研究中高丹草和高粱被歸為第一類群，說明高丹草的親緣關系更接近高粱，這亦與王芳等[5]的結(jié)果相似。關于高粱和蘇丹草的分類問題，需要大量的品種作為支撐，本研究所選品種有限，聚類結(jié)果僅能代表參試品種的親緣關系，二者的分類地位需要進一步擴大參試品種進行試驗證實。

4 結(jié) 論

本研究利用ISSR技術構(gòu)建了12個高粱屬牧草品種的DNA數(shù)字指紋圖譜，能快速鑒定供試品種的真實性。聚類分析發(fā)現(xiàn)，12個品種的遺傳聚類結(jié)果基本反映了品種間的親緣關系?？傊?，利用該技術能為高粱屬牧草品種的純度、真?zhèn)舞b定和親本選配提供參考。

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ConstructionofMolecularFingerprintPatternandGeneticClusteringAnalysisinSorghumForage

CHEN Chao1, ZHANG Yu-jun1, ZHAO Li-li1*, WANG Pu-chang2, SHEN Ji3, TANG Hua-jiang1

(1.Department of Grass Science, College of Animal Science,Guizhou University,Guizhou Guiyang 550025, China; 2.Guizhou Pratacultural Institute, Guiyang Guizhou 550006,China; 3.Station of Forage Grass and Fodder, Yinjiang Bureau of Agriculture and Animal Husbandry Science and Technology, Guizhou Yinjiang 555200, China)

【Objective】 This study aimed to establish the rapid and effective analysis method for identification ofSorghumforage varieties. 【Method】The digital fingerprint, identification and clustering of 12 forage varieties ofSorghumbicolor,Sorghumdochna,SorghumSudanenseandSorghumbicolor×S.sudanenseare respectively analyzed by the ISSR molecular marker technique based on the mixed DNA pool 【Result】13 amplification products with high polymorphism and good repeatability are screened from 110 ISSR primers by ISSR. The genetic similarity coefficient of 12 forage varieties is 0.6867-0.9036. When Gs is 0.786, 12 forage varieties can be divided into four groups. There are sixS.bicolor×S.sudanensevarieties and twoS.bicolorvarieties in Group I, twoS.dochnavarieties in Group II, oneS.sudanensevariety in Group III and oneS.sudanensevariety in Group IV. Three core primers (S37, S35 and S50) are selected to differentiate ISSR digital fingerprint of 12Sorghumforage varieties.【Conclusion】The ISSR molecular marker technique can effectively identify the purity and true or false ofSorghumforage varieties and reveal genetic difference amongSorghumforage varieties.

Sorghumforage; ISSR; Digital fingerprint; Clustering analysis

1001-4829(2017)10-2191-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.006

2017-04-12

國家科技支撐計劃(2014BAD23B03)；國家自然科學基金(31560664)；貴州省科技計劃項目[黔科合NY字(2014)3048]；黔科合支撐[(2016)2516]

陳 超(1974-)，男，貴州惠水人，博士，副教授，主要從事草學、畜牧學研究，*為通訊作者，E-mail：zhaolili_0508@163.com。

S431.14

A

(責任編輯 聶克艷)