單建軍， 管崇武， 張 穎， 張宇雷， 吳 凡， 王俊鈞， 張海耿， 宋奔奔

(1 農(nóng)業(yè)部漁業(yè)裝備與工程重點實驗室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機械儀器研究所，上海200092; 2 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱150070; 3 榮成出入境檢驗檢疫局，山東 威海 264300; 4 林德氣體上海有限公司，上海 201206)

基于循環(huán)水孵化系統(tǒng)的俄羅斯鱘受精卵孵化性能研究

單建軍1， 管崇武1， 張 穎2， 張宇雷1， 吳 凡1， 王俊鈞3， 張海耿1， 宋奔奔4

(1 農(nóng)業(yè)部漁業(yè)裝備與工程重點實驗室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機械儀器研究所，上海200092; 2 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱150070; 3 榮成出入境檢驗檢疫局，山東 威海 264300; 4 林德氣體上海有限公司，上海 201206)

目前，絕大多數(shù)海淡水增養(yǎng)殖魚類的苗種繁育幾乎完全是人工繁殖，但對受精卵的孵化方式的研究較少，尤其循環(huán)水孵化方面。為探索封閉循環(huán)水孵化系統(tǒng)對鱘魚(Acipenseriformes)受精卵孵化性能的影響，本文通過對俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedtii)受精卵孵化率、孵化酶組成和含量以及孵化過程中水體氨氮濃度變化規(guī)律進行研究。結(jié)果顯示，封閉循環(huán)水孵化系統(tǒng)中總氨氮濃度隨孵化時間呈線性增長，受精卵的排氨率為60～90 mg/(g·h)，破膜6 h后孵化率為86%，孵化水體中孵化酶累積較嚴重。俄羅斯鱘的孵化酶主要由分子量為41.3 kDa的蛋白質(zhì)組成，受精卵的孵化液由23種蛋白質(zhì)組成，其中包括7種水解酶。研究表明，對氨氮的去除及孵化酶控制技術(shù)是循化水孵化系統(tǒng)急需攻克的首要問題。

俄羅斯鱘；循環(huán)水；孵化系統(tǒng)；受精卵；破膜率；孵化酶

鱘魚(Acipenseriformes)是一種古老的軟骨硬磷魚類， 迄今已有2 億多年的歷史。鱘魚魚子醬營養(yǎng)豐富、味道鮮美[1-2]。自2006年以來，中國已成為世界鱘魚養(yǎng)殖大國，鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界鱘魚的80%以上，建立了集繁育-養(yǎng)殖-加工于一體的完整的產(chǎn)業(yè)鏈，年需鱘魚苗種達1.2億尾[3-4]。俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedtii)，隸屬于鱘形目、鱘科、鱘屬，具有體型大、生長快、繁殖能力強，對不良環(huán)境耐受能力強等特點，是鱘魚養(yǎng)殖的主要品種之一[5-6]。其肉質(zhì)鮮美、性成熟時間早、魚卵粒大飽滿、魚子醬經(jīng)濟價值高，因此，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖前景廣闊。鱘魚受精卵的孵化主要采用流水方式，具有孵化能力高、孵化死亡率低、易剔除死卵等優(yōu)點，但同時也存在耗水量大、孵化條件要求高、易受氣候條件、環(huán)境變化影響等缺點[7-8]。工廠化循環(huán)水魚卵孵化系統(tǒng)是一種機械自動化程度高、節(jié)水節(jié)地的新型苗種孵化模式，其特點之一就是魚卵孵化環(huán)境可控[9]。目前，有關(guān)俄羅斯鱘的研究多集中在種質(zhì)改良及養(yǎng)殖生物學(xué)等方面[10-11]，有關(guān)其魚卵孵化方式的研究還尚未見報道。

在個體發(fā)育過程中，魚類受精卵的孵化標志著胚胎發(fā)育的完成和胚后發(fā)育的開端。魚類苗種孵化是胚體運動、孵化酶溶解卵膜內(nèi)層等因素綜合作用的結(jié)果[12-13]。作為魚卵孵化的決定性物質(zhì)之一，孵化酶由孵化腺分泌，具有類似胰酶或胰蛋白酶的性質(zhì)，它是各種蛋白質(zhì)水解酶的組合[13]。本研究構(gòu)建了俄羅斯鱘受精卵的封閉式循化水孵化系統(tǒng)，通過研究俄羅斯鱘受精卵的孵化率及孵化過程中水體氨氮濃度的變化規(guī)律，并采用生化方法測定孵化后1～6 h孵化液蛋白濃度的變化、孵化液蛋白質(zhì)組成及孵化酶的組成等，初步了解循環(huán)水孵化系統(tǒng)下俄羅斯鱘受精卵的孵化性能及孵化酶代謝規(guī)律，為鱘魚繁育技術(shù)的改進提供理論數(shù)據(jù)和技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1試驗材料及裝置

俄羅斯鱘受精卵購于杭州千島湖鱘龍科技股份有限公司，平均受精卵重量為(0.017 5±0.003 1)g。試驗地點位于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機械儀器研究所實驗室內(nèi)，試驗裝置示意圖見圖1。系統(tǒng)由1個玻璃鋼瓶式孵化器(30 L)和一個玻璃缸處理槽(600 mm×500 mm×400 mm)組成，孵化用水通過水泵從水泵倉抽上來，經(jīng)過紫外線殺菌裝置后進入瓶式孵化器，孵化用水從瓶式孵化器的出口排出進入魚苗池，魚苗池出口處鋪設(shè)過濾網(wǎng)用以過濾卵膜及其他顆粒污染物，之后水流依次經(jīng)過活性炭倉和生物填料倉進行吸附和生物處理，再由水泵注入紫外殺菌裝置消處理后進入瓶式孵化器，從而實現(xiàn)水體循環(huán)利用。在本次試驗研究過程中，生物填料與活性炭均未放置，每套系統(tǒng)總水體量0.1 m3，1 h 循環(huán)10次。

圖1 試驗裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the testing apparatus

1.2試驗設(shè)計

1.2.1 受精卵排氨率

采用停用循環(huán)水試驗裝置的生物處理功能進行排氨率研究。設(shè)置4組平行試驗組，每組系統(tǒng)的瓶式孵化器里放置1 000枚俄羅斯鱘受精卵，生物填料倉和活性炭倉不放置濾料和活性炭，每隔1 h測定出口處的氨氮(TAN)濃度，連續(xù)測量8 h，實驗期間，溶氧(DO)濃度≥6，pH 8.03～8.49，水溫19.0℃～20.4℃。

1.2.2 受精卵孵化率、孵化酶的組成及含量

通過觀察受精卵孵化狀態(tài)，采用考馬斯亮藍法檢測水中總蛋白濃度，觀察循環(huán)水條件下水中孵化酶的濃度累積程度。在發(fā)現(xiàn)有受精卵破膜孵化出仔魚后，每隔1 h測定水中總蛋白濃度，并撈出仔魚統(tǒng)計孵化率(100%×孵出仔魚數(shù)/受精卵數(shù))。采用LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜分析，對水體中孵化酶的組成及成分進行分析。

1.3試驗方法

1.3.1 排氨率計算

水體中氨氮濃度采用納氏試劑法測定，排氨率計算公式[14]：

(1)

式中：Ram為排氨率，mg/(g·h)；C0、Ct分別為起始氨氮濃度和t時間后氨氮濃度，mg/L；V為瓶式孵化器容積，L；m為受精卵重量，g；t為實驗時間，h。

1.3.2 受精卵孵化液制備

待90%以上的胚胎孵化后，用濾網(wǎng)撈出孵出仔魚，所得培養(yǎng)液即為孵化液。取100 mL孵化液，于4℃緩慢加56.8 g 硫酸銨，邊攪拌邊加至飽和，該步驟在5～10 min完成，繼續(xù)攪拌20 min。在4℃，10 000 r/min冷凍離心10 min，棄上清液，所得沉淀為濃縮孵化酶液。加1倍體積0.2 mol/L 的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.0)，轉(zhuǎn)入透析袋，在4℃下透析。每4 h換1次緩沖液，共換4～5次，得到除鹽濃縮孵化酶液。

1.3.3 總蛋白測定

孵化酶粗品和Sephacryl S-100純化樣品經(jīng)離心管濃縮和脫鹽后，采用考馬斯亮藍法(南京建成)測定總蛋白濃度。

1.3.4 SDS-PAGE凝膠電泳分析

除鹽濃縮孵化酶液組成成分分析：將已鑒定的孵化酶組分進行PAGE分離，采用垂直板連續(xù)體系在4℃電泳，凝膠濃度7%，電流20～30 mA，采用考馬斯亮藍染色，然后對電泳結(jié)果進行掃描攝影，根據(jù)條帶數(shù)來確定孵化酶的組分數(shù)量。孵化酶組分分子量測定：采用SDS-PAGE垂直板連續(xù)體系，凝膠濃度1.25%，電流50 mA，其中標準蛋白依次為兔磷酸化酶B(97400Da)、牛血清標準蛋白(66200Da)、兔肌動蛋白(43000Da)、牛碳酸醉酶(31000Da)、胰蛋白酶抑制劑(20100Da)，雞蛋清溶菌酶(14400Da)，指示劑為澳酚藍。經(jīng)染色和脫色后立即測量各組分遷移距離，根據(jù)公式計算相對遷移率(蛋白移動距離/指示劑移動距離)，并將電泳結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)下掃描拍照。以標準蛋白相對遷移率為橫坐標，分子量的對數(shù)為縱坐標，做標準曲線，根據(jù)孵化酶組分的相對遷移率，在標準曲線上讀取孵化酶組分分子量。

1.3.5 LC-MS/MS分析

在進行LC-MS/MS分析前，對提取后的蛋白樣品進行還原烷基化處理和酶解，步驟如下：

(1)將樣品加入濃度10 mM二硫蘇糖醇(DDT)在56℃下反應(yīng)30 min后，加入濃度20 mM碘乙酰胺(IAA)室溫下避光反應(yīng)30 min；(2)加入預(yù)冷的丙酮(丙酮∶樣品體積比=5∶1)在-20℃沉淀2 h；(3)12 000 r/min，4℃，離心20 min，取沉淀物；(4)加入含1M尿素的三乙胺-碳酸緩沖液(TEAB)20 μL，混懸充分溶解；(5)按酶：蛋白質(zhì)量比1∶50加入胰蛋白酶(Trypsin)，在37℃下酶解15 h；加入濃度0.5%的三氟乙酸(TFA)終止酶解，濃縮凍干。

采用Eksigent 1D plus色譜儀和ZORBAX 300SB-C18 column反應(yīng)柱(5 μm, 300,0.1×150 mm)分析，流動相的A液是5%乙腈0.1%甲酸溶液，B液是95%乙腈0.1%甲酸溶液。使用A液復(fù)溶樣品進行色譜分析。色譜洗脫梯度為0～5 min，5%B；5～70 min，45%B；70～77 min，80%B；77～80 min，5%B；90 min，終止。色譜流速300 nL/min。

采用Triple TOF 5600質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析，MS掃描范圍350～1 250 m/z，累積時間0.25 s；MSMS掃描范圍100～2 000 m/z，HS高靈敏度掃描模式，累積時間0.1 s。

1.4數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以平均值±標準差(Mean±SD)，數(shù)據(jù)用Excel2016統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果與分析

2.1受精卵孵化過程中水體氨氮濃度的變化

如圖2所示，在循環(huán)水條件下，孵化過程中水體的氨氮濃度呈線性增長曲線，斜率平均為0.096 6。在30 L的孵化水體中，1 000枚卵在水溫19.3℃、溶氧8.96 mg/L的孵化條件下，8 h后產(chǎn)生的氨氮總量平均為(22.20±4.53)mg，平均每枚卵的排氨速率為(2.78±0.57) μg/h，遠高于張傳騫等[15]對于褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)受精卵孵化時的氨排泄率0.8 nmol/(ind·h)的研究結(jié)果。經(jīng)計算，受精卵孵化過程中排氨率為(158.86±32.57)ug/(g·h)。

圖2 水體中氨氮濃度隨孵化時間變化曲線圖Fig.2 Variation curve of the concentration of ammonia nitrogen with the increasing of hatching period

2.2破膜后孵化液中總蛋白濃度及蛋白亞基組成的變化

在循環(huán)水孵化系統(tǒng)中，受精卵的孵化率隨破膜時間增加，破膜后6 h受精卵的孵化率達86%(表1)。

表1 俄羅斯鱘受精卵的破膜率及孵化液的蛋白質(zhì)濃度Tab.1 Rupture rate of the fertilized eggs in acipenseriformes and concentration of protein in the hatching solution

由于水體循環(huán)利用，孵化液中的蛋白質(zhì)濃度隨破膜時間的增加而逐漸升高，破膜后6 h，孵化水體中的蛋白質(zhì)濃度達(2.64 ±0.02)g/L。

如圖3和表2所示，俄羅斯鱘受精卵孵化液主要由7種蛋白組成(B1～B7)，其蛋白質(zhì)的分子量范圍為130.9～22.4 kDa。其中，以分子量為130.9 kDa和41.3 kDa 兩種蛋白質(zhì)為主。底鳉(Fundulusgrandis)孵化酶的分子量在15到40 kDa之間[16]，虹鱒魚(rainbow trout)的孵化酶大小約為10 kDa[16]，魚類孵化酶的分子量不會變化太大，與其他魚類的孵化酶分子量比對表明，分子量為41.3 kDa的蛋白質(zhì)為俄羅斯鱘的孵化酶。

2.3受精卵孵化液中的蛋白質(zhì)組成

俄羅斯鱘受精卵孵化液的水解酶及蛋白質(zhì)組成見表3。經(jīng)LC-MS/MS分析，可鑒定到的水解酶種類為7種，此外還包括16種蛋白質(zhì)。其中，熱應(yīng)激蛋白不參與受精卵的孵化。

圖3 破膜后孵化液中蛋白質(zhì)的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of protein in the hatching solution after rupture of membranes表2 俄羅斯鱘孵化液中蛋白質(zhì)的遷移距離和相對遷移率Tab.2 The migration distance and relative migration rate of protein in the hatching solution of acipenseriformes

項目序號相對遷移率遷移距離/cm分子量/kDa粗提孵化酶帶B10．110．1130．9帶B20．560．5114．3帶B31．331．290．1帶B41．561．484．2帶B52．332．166．4帶B63．893．541．3帶B75．895．322．4

表3 俄羅斯鱘受精卵孵化液的水解酶及蛋白質(zhì)組成Tab.3 Hydrolytic enzymes and proteins composition in the hatching solution of the fertilized eggs in acipenseriformes

3 討論

3.1魚卵孵化時的排氨率

3.2魚卵孵化時孵化酶的累積

在魚類人工孵化過程中，魚卵在胚胎發(fā)育早期發(fā)生大量破膜的現(xiàn)象比較常見，這對人工魚類繁殖生產(chǎn)造成較大的損失[13]。導(dǎo)致胚胎早脫膜現(xiàn)象的原因比較復(fù)雜。由于孵化水體中孵化酶的濃度過高是導(dǎo)致早脫膜的主要原因之一，因此在孵化生產(chǎn)中需要防止孵化酶在孵化水體中積累。本研究中，孵化水體中的蛋白質(zhì)濃度隨破膜時間的增加而逐漸升高，破膜后1 h為0.12 g/L，至6 h時已經(jīng)升至2.64 g/L，表明水體中孵化酶濃度快速累積。紫外殺菌器對于孵化酶濃度的控制沒有明顯效果，可能是由于受精卵卵膜脫落后會釋放大量水解酶及蛋白質(zhì)進入孵化水體，降低了水體透明度，從而影響紫外殺菌器的工作效率。因此在循環(huán)水孵化系統(tǒng)中，對于孵化酶濃度的控制也是系統(tǒng)設(shè)計的重點和難點。

3.3魚類孵化酶的組成

魚類及兩棲動物受精卵的孵化都是借助于孵化酶來完成的。孵化酶與卵殼直接接觸，消化魚卵殼內(nèi)層的輻射區(qū)部分，被降解的卵殼內(nèi)層輕微膨脹，變成疏松的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[22-23]。了解魚類孵化酶的性質(zhì)、孵化機制及其影響因素，對于提高受精卵的孵化率，進而大幅提高種苗育成率將產(chǎn)生重大影響[16]。研究證實，青鳉(Oryziaslatipes)、斑馬魚(Barchydaniorerio)、虹鱒、白斑狗魚(EsoxluciusL.)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)及河川沙塘鱧(Odontobutispotamophila)等魚類中均有孵化酶存在。史振平等[24]對牙鲆孵化酶的研究表明牙鲆作為海水魚中偏口魚類的代表，其孵化酶在大小、反應(yīng)溫度、pH 值以及酶性質(zhì)等方面大都與底鳉相似, 均是屬于絲氨酸蛋白酶類型的金屬蛋白酶。黃顙魚魚卵中的孵化酶主要分布在魚卵外胚層及卵膜內(nèi)層上，各個孵化時期均有孵化酶存在[25]。對青鳉孵化酶的研究表明，孵化酶由兩種Zn-金屬蛋白酶組成酶系，分別為高卵殼裂解酶(HCE)和低卵殼裂解酶(LCE)，而虹鱒的孵化酶則為分子量約為10 kDa的堿性蛋白酶[26-28]。本研究中，俄羅斯鱘的孵化酶約為41.3 kDa，與牙鲆(34.8 kDa)、玻璃海鞘(34 kDa)、底鳉 (15～40 kDa)等的分子量大小相似，大于日本鰻鱺 (24 kDa) 、虹鱒(10 kDa) 及白斑狗魚(10～15 kDa)等孵化酶分子量[16，29-30]。本研究采用質(zhì)譜技術(shù)對俄羅斯鱘的孵化液進行蛋白質(zhì)組分析，結(jié)果表明，多種水解酶及蛋白質(zhì)參與了俄羅斯鱘受精卵的孵化，而與泥鰍、青鳉等魚類的兩種孵化酶組分的研究結(jié)果不同[31]。

4 結(jié)論

本研究中，俄羅斯鱘受精卵孵化用水的氨氮濃度積累嚴重，排氨率為(158.86±32.57)μg/(g·h)，表明在循環(huán)水孵化系統(tǒng)中，去除氨氮是系統(tǒng)的重要環(huán)節(jié)。在封閉條件下受精卵孵化過程中孵化酶的不斷累積，受精卵破膜6 h后孵化水體中蛋白質(zhì)濃度已經(jīng)升至2.64 g/L，不但致使部分受精卵提前破膜，還降低了孵化水體的透明度，影響紫外殺菌器的正常工作。因此，循化水孵化系統(tǒng)作為新型的魚類受精卵孵化技術(shù)還有許多尚待解決的問題，其中系統(tǒng)內(nèi)氨氮及孵化酶去除控制技術(shù)是其急需攻克首要問題。

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AstudyonthehatchingperformanceoffertilizedeggsinAcipensergueldenstaedtiibasedonthecirculatingwaterhatchingsystem

SHANJianjun1,GUANChongwu1,ZHANGYing2,ZHANGYulei1,WUFan1,WANGJunjun3,ZHANGHaigeng1,SONGBenben4

(1FisheryMachineryandInstrumentResearchInstitute,ChineseAcademyofFisheriesSciences,KeyLaboratoryofFisheryEquipmentandEngineering,MinistryofAgriculture,Shanghai200092,China; 2HeilongjiangRiverFisheryResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences，Harbin150070,China; 3RongChengEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Weihai264300,China; 4LindeGas(Shanghai)Co.,Ltd.,Shanghai201206,China)

At present, seawater and freshwater aquaculture fish breeding is almost entirely based on artificial propagation, and less research has been done to the fertilized eggs hatching, especially in terms of circulating water hatching. In order to explore the effect of closed circulating water hatching system on the hatching performance of the fertilized eggs of acipenseriformes, in this paper, the hatching rate of the fertile eggs inAcipersergueldenstaediiacipenseriformes, the constitute and content of hatching enzyme, and the change situation of the concentration of ammonia nitrogen in the water body during the hatching process were studied. The results showed that the total concentration of ammonia nitrogen in the circulating water hatching system increased linearly with the increasing of hatch period; the ammonia excretion rate of the fertilized eggs inAcipersergueldenstaediiwas 60-90 mg/(g·h); the hatching rate was 86% in 6 hours after the rupture of membranes, and the accumulation of hatching enzymes in water body was serious. The hatching enzyme of acipenseriformes is mainly composed of the protein with molecular weight of 41.3 kDa. The hatching solution is composed of 23 kinds of proteins, including 7 kinds of hydrolases. The study showed that the removal of ammonia nitrogen and the hatching enzyme controlling technology are urgently to be resolved for the circulating water hatching system.

Acipersergueldenstaedii; circulating water; hatching system; fertilized eggs; rupture rate; hatching enzyme

10.3969/j.issn.1007-9580.2017.05.004

2017-07-01

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(2015CB150703)

單建軍(1986—)，工程師，研究方向：工廠化循環(huán)養(yǎng)殖。E-mail：shanjianjun@fmiri.ac.cn

管崇武(1980—)，副研究員，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖。E-mail：guanchongwu@fmiri.ac.cn

S959;X172

A

1007-9580(2017)-05-019-07