秦 慶 胡 瑛 呂永強

中國人民解放軍第210醫(yī)院檢驗科，遼寧大連 116021

痰涂片抗酸染色、結核抗體試驗、熒光PCR、T-SPOT.TB在肺結核診斷中的臨床意義

秦 慶 胡 瑛 呂永強▲

中國人民解放軍第210醫(yī)院檢驗科，遼寧大連 116021

目的 比較痰涂片抗酸染色﹑結核抗體試驗﹑熒光PCR和結核感染T細胞斑點試驗在肺結核診斷中的價值。 方法 96例經(jīng)肺結核診斷和治療指南標準確診為肺結核患者設為實驗組，56例其他肺部疾?。ǚ欠谓Y核）患者設為對照組，用上述四種方法同時進行檢測。計算每種方法的靈敏度﹑特異度﹑準確性，并進行四種檢測方法之間的配對χ2檢驗。 結果 痰涂片抗酸染色﹑結核抗體試驗﹑熒光PCR﹑T-SPOT.TB檢測的靈敏度分別為11.46%﹑44.80%﹑38.54%和93.75%，特異度分別為98.96%﹑82.14%﹑94.64%﹑91.10%，準確性分別為43.42%﹑58.55%﹑59.21%﹑92.76%，四種方法兩兩之間比較差異均有統(tǒng)計學意義。 結論 每種方法各有優(yōu)缺點，綜合評價T-SPOT.TB檢測方法優(yōu)于其他三種方法。工作中，應多種檢測方法聯(lián)合使用，以便對肺結核做出正確的診斷。

抗酸染色；結核抗體試驗；TB-DNA；T-SPOT.TB；肺結核

結核病是由于結核分枝桿菌感染人體各個器官而引起的一種慢性傳染病，其主要侵襲的是肺部臟器，作為危害人類健康的傳染病之一，是中青年人的重要死因[1]。結核病之所以得到全世界的重視，不僅僅是發(fā)病率高，其死亡率長期以來一直居高不下，最主要原因是缺少快速有效的檢測方法[2]。結核病的臨床表現(xiàn)復雜多樣，對臨床醫(yī)生診斷該病帶來了很大的障礙。目前結核病的普查方法是結核菌素試驗，該方法在全世界廣泛的應用，但在我國由于非結核分枝桿菌感染率較高，因此TST出現(xiàn)了較多的假陽性，而免疫力低下的患者，又會出現(xiàn)一定的假陰性[3]。所以找出一種能夠早期快速檢測結核病的方法來替代結核菌素試驗，對疾病的控制﹑死亡率的降低至關重要。因此本研究針對肺結核檢測分別開展了痰涂片抗酸染色﹑結核抗體試驗﹑熒光PCR和結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）四種方法的診斷能力研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在2016年1～12月收入本院的96例肺結核患者（均符合肺結核診斷和治療指南標準）為實驗組，其中男58例，女38例，年齡23～85歲；56名非肺結核疾病患者為對照組，其中男35例，女21例，年齡25～77歲；其中不包括孕婦，免疫抑制等患者，上述患者均簽署知情同意書，分別對兩組進行痰涂片抗酸染色﹑結核抗體試驗﹑熒光PCR和結核感染T細胞斑點試驗檢測。

1.2 試劑

抗酸染液（北京華越洋生物有限公司），結核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒（MP生物醫(yī)學亞太私人有限公司），結核分枝桿菌（TB）核酸檢測試劑盒（艾康生物技術有限公司），結核感染T細胞檢測試劑盒（上海信長醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 痰涂片抗酸染色 與清晨取患者深咳膿性痰，收集在無菌密閉容器中，加入少量生理鹽水稀釋，取少量涂在載玻片上，然后進行抗酸染色，染色完成后置于顯微鏡下觀察100個視野，如發(fā)現(xiàn)結核分枝桿菌≥3個，則該患者診斷為陽性，記錄陽性患者例數(shù)。1.3.2 結核抗體試驗 采用促凝管取患者靜脈血，離心10min，按照結核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒（MP生物醫(yī)學亞太私人有限公司）的使用說明書，進行規(guī)范操作，并記錄結果。1.3.3 TB-DNA 利用試劑盒（艾康生物技術有限公司）選用結核分枝桿菌保守基因片段設計特異引物及特異Taqman探針，該探針能與引物擴增區(qū)域中間的一段DNA模板發(fā)生特異性結合，在PCR延伸反應過程中，Tap酶的外切酶活性將5′端熒光基團從探針上切割下來，使之游離于反應體系中，從而脫離了3′端熒光猝滅集團的屏蔽，能接受光刺激而發(fā)出可供儀器檢測的熒光。本次采用定性檢測結核分枝桿菌的方法，嚴格遵照結核分枝桿菌

核酸檢測試劑盒說明書，進行規(guī)范的操作。

1.3.4 T-SPOT.TB 采用肝素或檸檬酸鈉抗凝劑采血管抽取8mL外周靜脈血，樣本采集后盡快進行外周單個核細胞的分離，按照結核感染T細胞檢測試劑盒（上海信長醫(yī)療器械有限公司）的說明書進行操作。T-SPOT試劑盒設有空白對照孔﹑陽性對照孔﹑分別以ESAT-6和CFP-10抗原為刺激物的反應孔，通過計數(shù)斑點來判斷病人是否被結核桿菌感染。當出現(xiàn)以下三種情況結果被認為是不確定的：（1）空白對照孔超過10個這種情況下需要重新復查。（2）陽性質控對照孔少于20個。（3）當空白對照對照孔數(shù)為0～5個并且反應孔斑點數(shù)減去空白對照孔等于5～7時，需要復查。當空白對照沒有或者很少的斑點而陽性質控對照孔的斑點數(shù)超過20個，表明檢測結果是有反應性的，以下兩種情況結果為陽性：（1）當空白對照孔斑點數(shù)為0～5個時，（任意一個反應孔的斑點數(shù)）-（空白對照的斑點數(shù)）≥6；（2）當空白對照孔斑點數(shù)為6～10個時，（任意一個反應孔的斑點數(shù)）≥2×（空白對照的斑點數(shù)）。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學軟件SPSS19.0版對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用百分數(shù)（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

兩組患者四種檢測方法結果見表1～2?？傆?52例受檢者中，痰涂片抗酸染色檢測陽性為12例，占7.9%，陰性140例，占92.1%；結核抗體試驗檢測陽性為53例，占34.9%，陰性99例，占65.1%；TBDNA檢測陽性為40例，占26.3%，陰性112例，占73.7%；T-SPOT.TB檢測陽性為95例，占62.5%，陰性57例，占37.5%。四種方法兩兩之間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表1 實驗組四種檢測方法結果

表2 對照組四種檢測方法結果

表3 四種方法的配對檢測分析

3 討論

痰涂片抗酸染色是利用結核分枝桿菌的細胞壁上的脂類不容易著色，對其延長染色的時間，細胞壁上的脂類著色后，不容易被酸性脫色劑脫去，通過顯微鏡觀察視野中是否有被染成紅色的結核桿菌，來判斷臨床疑似肺結核的患者是否被結核分枝桿菌感染，這種方法具有操作方便﹑價格便宜的優(yōu)點[4]，是經(jīng)典的細菌學診斷方法。對于不能進行分枝桿菌培養(yǎng)的實驗室來說，抗酸染色可以視為診斷肺結核的金標準，但是結果陽性不能夠說明視野中是結核分枝桿菌，有可能是非結核分枝桿菌﹑麻風桿菌等細菌的感染，同時顯微鏡檢查存在一些主觀因素，例如檢驗人員涂片的質量﹑染色時間﹑鏡檢的經(jīng)驗等，標本留取合格率低，也會影響陽性率。另外還與患者疾病所處的階段有關，患者在排菌期抗酸染色陽性率很高，如果不在排菌期很難檢出結核桿菌[5]，并且通過顯微鏡也無法區(qū)分結核桿菌的死活。雖然其特異度是上述四種方法中最高的，達到98.96%，其診斷非病人能力較強，但靈敏度卻是最低的，僅為11.46%，故漏診率很大，該方法準確性為43.42%，也是四種方法中最低的。即使痰涂片未見結核桿菌，也不可排除結核病的可能性，所以在診斷肺結核病時要結合臨床癥狀和影像學檢查等[6]。

結核抗體試驗依據(jù)結核病是一種由結核分枝桿菌感染后引起的機體慢性肉芽腫和一系列免疫反應所介導的疾病，通過檢測機體免疫反應產(chǎn)生的特異性抗體來診斷結核病，具有方便﹑快速﹑可重復，特異性高等優(yōu)點[7]。有文獻報道稱結核抗體試驗可以作為兒童﹑不方便留取痰標本者和肺外結核病診斷的重要指標[8]。但是機體對外界刺激產(chǎn)生的免疫反應的強度和持續(xù)時間存在個體性差異，部分病人雖然肺結核正處于靜止期，但血清中的抗結核抗體會持續(xù)一定的滴度，使檢測結果出現(xiàn)陽性，增加了檢測的假陽性率，對醫(yī)生判斷患者的病情起到一定的干擾作用[9]。同時結核抗體檢測的干擾因素也很多，如患者存在自身免疫病，自身免疫性抗體將可能影響結核抗體試驗檢測結核抗體的特異性，造成結果的假陽性[10]。因此該方法假陽性率最高，由表中看出結核抗體試驗的特異度是最低的，為82.14%，誤診率較高，而靈敏度為44.80%，漏診率也較高，方法準確性為58.55%。

常規(guī)PCR檢測結核感染時，需要將樣本中的核酸擴增，然后進行電泳，雖然速度比較快，但很容易出現(xiàn)交叉感染等缺點，會影響檢測的特異度。近些年興起的熒光PCR方法，可以很好的彌補常規(guī)PCR的不足，所以本次實驗應用熒光PCR技術檢測結核桿菌核酸，由表中結果可以得出TB-DNA的特異度比較高，為94.64%，但是陽性率不高，靈敏度為38.54%，漏診率較大，這是由于樣本取材方面要求很嚴格，不容易取到含有結核分枝桿菌的樣本。在對照組出現(xiàn)的假陽性可能與以下兩種因素有關：（1）患者處于結核分枝桿菌感染的“亞臨床”狀態(tài)；（2）可能存在兩種疾病并存即雙重感染[11]。該方法綜合準確性為59.21%。T-SPOT.TB檢測技術是利用機體受結核桿菌刺激會引發(fā)免疫反應，產(chǎn)生效應T細胞和記憶T細胞，記憶T細胞會長期存在于人體，通過將患者外周血細胞分離，得到記憶T細胞，然后利用相同的抗原再次刺激，記憶T細胞就會轉變成效應T細胞并且分泌細胞因子γ干擾素，被預包被在反應孔膜上的特異抗體捕獲，加入酶標二抗，洗去未標記的抗體，在反應孔內加入底物，就會形成色素沉著的斑點，每個斑點代表一個分泌細胞因子的T細胞，計數(shù)斑點數(shù)量，得出外周血中結核致敏T細胞的數(shù)量。

T-SPOT.TB的優(yōu)點在于它對檢驗的要求較低：（1）不受免疫力狀態(tài)的影響；（2）與患者是否在排菌期，排菌量無關[12]。因此在此次研究中該方法的靈敏度最高，達到93.75%，遠遠高于另外三種方法，而其特異度為91.10%，雖有一定的假陽性，但仍在可接受范圍內，方法準確性最終達到92.76%，該方法整體優(yōu)于其它三種方法。T-SPOT.TB技術不僅可以用于檢測外周血，還能應用于支氣管肺泡灌洗液﹑痰液﹑胸腹水及腦脊液等標本進行檢測[13]?；舴品频萚14]對31例肺外結核的患者進行T-SPOT.TB檢測，靈敏度為93.5%，陶學芳等[15]對30例肺外結核病患者用T-SPOT.TB檢測，靈敏度為93.33%，說明T-SPOT.TB在肺外結核病診斷上有較高的敏感性，所以這項技術還可以應用在臨床輔助診斷肺外結核病上。

對四種檢測方法之間進行配對χ2檢驗，結果P值最大為0.029，滿足P＜0.05，因此認為這四種方法兩兩之間比較差異均有統(tǒng)計學意義。

綜上所述，痰涂片抗酸染色作為經(jīng)典方法在排除非患者方面具有明顯價值，結核抗體試驗具有快速檢測的能力，PCR檢測特異度較高，T-SPOT.TB檢測靈敏度明顯高于其它方法。雖然沒有一種方法可以在所有診斷指標上都表現(xiàn)優(yōu)秀，但綜合評價，T-SPOT.TB檢測方法還是優(yōu)于其他三種方法，特別可以作為肺結核病早期診斷的一項有效檢查手段，也可以發(fā)現(xiàn)那些需要定期隨訪的潛伏性患者。在實際工作中，如果有條件應選擇多種方法聯(lián)合檢測，并結合患者的病史﹑臨床癥狀﹑影像病理等資料，對肺結核做出正確的診斷，有效減少誤診﹑漏診的發(fā)生。

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Clinical significance of acid fast staining of sputum smear,tuberculosis antibody test,fluorescent PCR and T-SPOT.TB in the diagnosis of pulmonary tuberculosis

QIN Qing HU Ying LV Yongqiang
Department of Clinical Laboratory,the 210th Hospital of PLA,Dalian 116021,China

Objective To compare the value of acid fast staining of sputum smear,tuberculosis antibody test,fluorescent PCR and tuberculosis infection T cell spot test (T-SPOT.TB) in the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Methods 96 patients with pulmonary tuberculosis diagnosed by the criteria of diagnosis and treatment of pulmonary tuberculosis were set as experimental group,56 patients with other lung diseases(non tuberculosis) were divided into control group,the above four methods are used for simultaneous detection.The sensitivity,specificity and accuracy of each method were calculated,The paired χ2test between four detection methods was carried out. Results The sensitivity of acid fast staining of sputum smear,tuberculosis antibody test,fluorescence PCR and T-SPOT.TB was 11.46%,44.80%,38.54% and 93.75% respectively,the specificity was 98.96%,82.14%,94.64%,91.10%respectively,the accuracy were 43.42%,58.55%,59.21% and 92.76%, respectively,the differences between two methods were statistically significant. Conclusion Each method has advantages and disadvantages,the comprehensive evaluation method of T-SPOT.TB is better than the other three methods,Multiple detection methods should be used in combination in the work,in order to make the correct diagnosis of pulmonary tuberculosis.

Acid fast staining;Tuberculosis antibody test;TB-DNA; T-SPOT.TB;Pulmonary tuberculosis

R521

A < class="emphasis_bold"> [文章編號]]

] 2095-0616（2017）21-130-04

▲通訊作者

2017-08-31）