覃志松+趙南京+殷高方+石朝毅+甘婷婷+肖雪+段靜波+張小玲++陳雙+劉建國(guó)+劉文清

摘要：通過(guò)對(duì)植物葉綠素?zé)晒獾臏y(cè)量，可以實(shí)時(shí)獲得植物生理狀態(tài)信息。為了得到植物光合作用速率，通過(guò)對(duì)光合作用的電子傳遞進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)基于快相熒光技術(shù)高等植物速率測(cè)量?jī)x。利用高速脈寬可調(diào)技術(shù)產(chǎn)生激發(fā)光信號(hào)，并利用高速采樣技術(shù)獲得微秒量級(jí)的快相熒光曲線，最后利用滑動(dòng)窗口和最小二乘算法在數(shù)字信號(hào)處理器（DSP）平臺(tái)上計(jì)算獲得光合作用參數(shù)最小熒光產(chǎn)率（Fo）、最大光熒光產(chǎn)率（Fm）等信息，并基于光合作用吸收模型計(jì)算植物的光合速率（JVPSⅡ）。通過(guò)對(duì)高溫脅迫條件的高等植物光合參數(shù)進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果表明，可以獲得光化學(xué)效率產(chǎn)率（Fv/Fm）、光合速率（JVPSⅡ）連續(xù)變化趨勢(shì)，F(xiàn)v/Fm與國(guó)外的PAM技術(shù)測(cè)量結(jié)果線性相關(guān)性達(dá)到0.982，該測(cè)量?jī)x為研究植物光合作用提供了一種新的測(cè)量手段。

關(guān)鍵詞：光合速率測(cè)量；快相熒光；非負(fù)最小二乘算法；葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)

中圖分類號(hào)： X835文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）17-0230-04

作者簡(jiǎn)介：覃志松（1977—），男，廣西容縣人，博士，講師，主要從事熒光檢測(cè)技術(shù)研究。E-mail：zsqin@aiofm.ac.cn。

通信作者：趙南京，博士，研究員，主要從事環(huán)境污染光學(xué)與光譜學(xué)監(jiān)測(cè)新技術(shù)與方法研究。E-mail：njzhao@aiofm.ac.cn。光合作用測(cè)量的方法包括直接測(cè)量法、間接測(cè)量法。直接測(cè)量法依據(jù)光合作用過(guò)程CO2+2H2O→CH2O+O2+H2O，通過(guò)測(cè)量光合作用過(guò)程中反應(yīng)物消耗速率或產(chǎn)物生成速率反映其生理狀態(tài)[1-2]。常用測(cè)量方法是測(cè)量有機(jī)物的積累速率、CO2氣體交換或光合放氧來(lái)反演光合作用速率[3]。20世紀(jì)30年代，Kautsky發(fā)現(xiàn)葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象[4]，以后國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該現(xiàn)象進(jìn)行了深入研究，發(fā)展并形成了光合作用熒光誘導(dǎo)理論，成為研究植物光合作用快速而有效的探針[5]。目前廣泛使用Water-PAM作為測(cè)量系統(tǒng)[6-8]，其原理根據(jù)Schreiber等提出的脈沖振幅調(diào)制技術(shù)（pulse amplitude modulation，簡(jiǎn)稱PAM），該技術(shù)使用飽和脈沖光還原全部PQ和PSⅡ初級(jí)電子受體來(lái)測(cè)量植物光合作用可變熒光產(chǎn)率Fv/Fm參數(shù)[9]。1992年Kolber等提出高速重復(fù)脈沖技術(shù)（fast repetition rate，簡(jiǎn)稱FRR），使用快速光脈沖光激發(fā)誘導(dǎo)熒光產(chǎn)率曲線來(lái)反演出光合作用細(xì)節(jié)參數(shù)：功能吸收截面σPSⅡ和QB氧化還原時(shí)間τQA進(jìn)行反演[10]；2014年石朝毅等提出了可變光脈沖誘導(dǎo)熒光的檢測(cè)方法[11]，對(duì)激發(fā)條件進(jìn)行了詳細(xì)的分析。

由于快相熒光技術(shù)可在微秒量級(jí)的時(shí)間分辨率下獲得熒光快速變化曲線，瞬時(shí)的激發(fā)條件可獲得更高的信噪比[11]；同時(shí)由于測(cè)量時(shí)間足夠快，使得測(cè)量光合系統(tǒng)Ⅱ時(shí)，避免了光合系統(tǒng)Ⅰ的電子傳遞影響，使得測(cè)量的光合作用參數(shù)更加準(zhǔn)確。因此本研究采用快相熒光技術(shù)研制植物光速率測(cè)量系統(tǒng)，其主要思路是通過(guò)應(yīng)用高速采樣技術(shù)獲得熒光動(dòng)力學(xué)曲線，利用非線性回歸分析算法反演獲得Fo、Fm、Fv/Fm，再根據(jù)吸收模型獲得植物光合速率參數(shù)。

1基本原理

光合作用的實(shí)質(zhì)是電子傳遞過(guò)程，圖1詳細(xì)闡述了電子傳遞和熒光激發(fā)原理[5]。光照后，PSⅡ反應(yīng)中心發(fā)生原初電荷分離產(chǎn)生強(qiáng)氧化劑P680+，電子傳遞至QA，形成1個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的還原劑QA-；在PSⅡ電荷分離產(chǎn)生1個(gè)非常穩(wěn)定的還原劑鐵硫蛋白（FeSX-）和1個(gè)弱氧化劑（P700+）。具強(qiáng)氧化勢(shì)的P680+可以使水放出1個(gè)電子，而QA-具有的還原勢(shì)驅(qū)動(dòng)電子“下山”傳遞，最終傳給P700+1個(gè)電子。電子傳遞過(guò)程中在光合膜兩側(cè)建立的質(zhì)子梯度驅(qū)動(dòng)ATP的合成。PSⅡ電子傳遞過(guò)程中存在2個(gè)重要的時(shí)間節(jié)點(diǎn)：QA到PQ需要100～200 μs，PQ達(dá)到PSⅠ幾百微秒到幾十毫秒。

單周轉(zhuǎn)強(qiáng)光激發(fā)后，PSⅡ大量吸收電子導(dǎo)致在QA處阻塞，反應(yīng)中心關(guān)閉，無(wú)法再接收后續(xù)的能量用于光化學(xué)反應(yīng)，其光能僅能以熱量、熒光的形式耗散，引起熒光產(chǎn)率從靜態(tài)最小熒光Fo上升并達(dá)到最大熒光產(chǎn)率Fm，葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)率與激發(fā)光能量、PSⅡ的功能吸收截面σPSⅡ及QA的氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)。根據(jù)FRR原理，光系統(tǒng)在強(qiáng)光激發(fā)下，時(shí)刻t與熒光產(chǎn)率函數(shù)可由式（1）表示[12]：

f（t）=Fo+（Fm-Fo）[1-exp（-σPSⅡt）]。（1）

式中：Fm為反應(yīng)中心完全關(guān)閉后的最大熒光產(chǎn)率；Fo為最小熒光產(chǎn)率；Fv=Fm-Fo是最大可變熒光產(chǎn)率；C（x）=exp（1-σPSⅡx）為關(guān)閉的PSⅡ反應(yīng)中心比例；σPSⅡ?yàn)镻SⅡ功能吸收截面。通過(guò)式（1）可獲得光化學(xué)效率產(chǎn)率Fv /Fm、功能

吸收截面σPSⅡ等光合作用參數(shù)。

根據(jù)光合作用模型，獲得了上述的光合參數(shù)后，即可根據(jù)光量子吸收模型[13]對(duì)光合速率進(jìn)行計(jì)算，由式（2）表示：

JVPSⅡ=Fm·FoFm-Fo·Fv′Fm′·KRELED·E。（2）

式中：Fo、Fm為在暗適應(yīng)下由式（1）計(jì)算得到；Fm′、Fv′（Fm′-Fo）′為在光適應(yīng)條件下計(jì)算獲得；ELED、KR分別表示LED的光照度[以單位時(shí)間、單位面積內(nèi)的通過(guò)的光量子數(shù)計(jì)，單位：μmol/（m2·s），下同]和光譜糾正系數(shù)，這2個(gè)參數(shù)可以采用光譜儀進(jìn)行測(cè)定；E表示環(huán)境光照度，可以使用光傳感器來(lái)獲得該參數(shù)，因而光合速率即可根據(jù)式（2）計(jì)算獲得。

2系統(tǒng)設(shè)計(jì)

光合速率測(cè)量?jī)x構(gòu)架如圖2所示，主要包括光學(xué)結(jié)構(gòu)、激發(fā)單元、發(fā)射單元和程序算法控制等內(nèi)容。

光源采用單個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)為560 nm的激光二極管，最大瞬時(shí)光照度為30 000 μmol/（m2·s）。由于激發(fā)光具有發(fā)散角度，為更好地匯聚到光纖內(nèi)，采用透鏡組將其調(diào)成平行光后入射到光纖。光纖有15根細(xì)光纖組成，分別由6根激發(fā)光纖、9根熒光光纖組成，并設(shè)計(jì)為“Y”形結(jié)構(gòu)，在1/4處將15根光纖匯成整體結(jié)構(gòu)。光纖的剖面結(jié)構(gòu)如圖3所示，由于激發(fā)光強(qiáng)較為集中，而熒光的發(fā)射是向各個(gè)方向分散發(fā)射，為更好地收集熒光，激發(fā)光纖置于內(nèi)部，而熒光光纖則均勻放置在外圍。為了減少激發(fā)光的反射，設(shè)計(jì)專用的葉片夾，除了能將外界光照屏蔽以便更好地進(jìn)行暗適應(yīng)外，還可以將葉片平整地放置后，將光纖固定并與葉片呈45°。激發(fā)光經(jīng)玻璃濾光片BG39（截止波長(zhǎng)650 nm）對(duì)樣品激發(fā)產(chǎn)生熒光，葉綠素?zé)晒庑盘?hào)在685 nm效率較高，因此使用帶寬為10 nm的帶通濾波片HB680對(duì)熒光濾波再進(jìn)行熒光檢測(cè)。endprint

激發(fā)單元由數(shù)字信號(hào)處理器（DSP）產(chǎn)生高速可調(diào)脈寬信號(hào)，并由驅(qū)動(dòng)器（TC4421A，MICROCHIP）驅(qū)動(dòng)激光二極管產(chǎn)生激發(fā)光信號(hào)。TC4421A是強(qiáng)電流緩沖器/驅(qū)動(dòng)器，能夠用9.0 A的峰值電流驅(qū)動(dòng)容性負(fù)載，可以驅(qū)動(dòng)大功率N-MOSFET（IRF640，Vishay），可以滿足光脈沖的調(diào)制需要。由于瞬時(shí)電流可高達(dá)十幾安培，為提供足夠強(qiáng)的激發(fā)光強(qiáng)，電路采用3個(gè)300 μF并聯(lián)作為儲(chǔ)能元件。有激發(fā)單元產(chǎn)生的快相激發(fā)光強(qiáng)范圍從 2 400～30 000 μmol/（m2·s），最小分辨率為1 200 μmol/（m2·s）。

熒光采用電倍增管模塊（H6779-1，濱松公司）進(jìn)行信號(hào)探測(cè)，它包括1個(gè)金屬封裝的光電倍增管（PMT）和1個(gè)高壓模塊，在685 nm處約為25 mA/W?？刂齐妷簽?.80 V時(shí)，探測(cè)器電容為10 pF，暗電流為0.4 nA，電流增益約為60 dB，上升時(shí)間為0.78 ns，響應(yīng)特性完全滿足測(cè)量要求。

獲得熒光電流信號(hào)以后，采用500 MHz寬帶高速放大器OPA637完成I/V轉(zhuǎn)換，并由DSP內(nèi)置的高速12位ADC完成轉(zhuǎn)換并保存在SRAM器件中，作為算法程序的熒光信息?？刂坪陀?jì)算過(guò)程采用高性能DSP芯片（MK60FX150，F(xiàn)reescale），該DSP芯片采用單指令周期，最高處理速度達(dá)210 MIPS，滿足本測(cè)量系統(tǒng)的時(shí)間要求。該單片機(jī)采用Cortex-M4內(nèi)核，集成有16通道的高精度12位A/D模數(shù)轉(zhuǎn)換器，采樣速率可達(dá)1.0 MSPS，可滿足本研究的高速采樣和數(shù)據(jù)計(jì)算的要求。

光照參數(shù)采用光學(xué)材料窗口集成的光傳感（NHZD210，武漢中科），量程范圍為0～2 000 lx，DSP使用RS485通信接口與傳感器連接。通過(guò)讀指令將光照參數(shù)讀入并保存在DSP的內(nèi)存中，作為計(jì)算光合速率的其中1個(gè)參數(shù)。

2.2計(jì)算流程

參數(shù)的計(jì)算基于嵌入式DSP系統(tǒng)，由于復(fù)雜的非線性擬合算法不適用在本系統(tǒng)上運(yùn)行，本研究對(duì)快速下降法進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)熒光產(chǎn)率曲線采用線性擬合極值法對(duì)Fo、Fm進(jìn)行估計(jì)，代入式（1）擬合獲得Fo、Fm和σPSⅡ，結(jié)合環(huán)境光照實(shí)時(shí)曲線計(jì)算測(cè)量區(qū)間的瞬時(shí)光照度Et，結(jié)合LED激發(fā)光譜曲線計(jì)算獲得Ek（即ELED）和KR參數(shù)，應(yīng)用式（2）即可獲得該時(shí)刻的光合速率JVPSⅡ，詳細(xì)計(jì)算流程如圖3所示。

3結(jié)果與分析

基于快相熒光動(dòng)力學(xué)原理研制的高等植物光合作用參數(shù)

測(cè)量系統(tǒng)實(shí)物如圖4所示，主要部分由主機(jī)、“Y”形導(dǎo)入光纖、樣品夾組成，質(zhì)量約為3.0 kg，適合進(jìn)行野外進(jìn)行植物光合作用測(cè)量操作。可以對(duì)植物快相熒光動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行測(cè)量和分析，獲得光合作用細(xì)節(jié)參數(shù)Fo、Fm、Fv/Fm參數(shù)，其中 Fv/Fm 與采用PAM技術(shù)的國(guó)外商業(yè)化儀器 Mini-PAM作對(duì)比分析驗(yàn)證。

高溫脅迫對(duì)高等植物光合葉片系統(tǒng)產(chǎn)生及其重要的影響，長(zhǎng)時(shí)間的脅迫會(huì)導(dǎo)致光合系統(tǒng)Ⅱ和光合系統(tǒng)Ⅰ的電子傳遞收到嚴(yán)重破壞，主要表現(xiàn)為光合作用速率持續(xù)下降[14-15]，F(xiàn)v/Fm和Y（Ⅱ）和Y（Ⅰ）迅速下降[19]。高溫脅迫試驗(yàn)選用筆者所在實(shí)驗(yàn)室培育的綠蘿（Epipremnum aureum），其平均光照度約25.0 μmol/（m2·s），綠蘿屬常綠藤本且氣根發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)在溫度較為恒定的環(huán)境中，平均生長(zhǎng)溫度在20 ℃左右。高等植物光合參數(shù)測(cè)量，由于溫度條件相比其他脅迫如水分、營(yíng)養(yǎng)鹽、重金屬和毒性試驗(yàn)條件較為容易建立，因此本研究采用溫度脅迫條件，對(duì)高等植物光合參數(shù)變化趨勢(shì)進(jìn)行測(cè)量和分析。將儀器和綠蘿植株都置于恒溫箱中，設(shè)定溫度從20 ℃至60 ℃，通過(guò)人工調(diào)控20個(gè)檔位，每檔依次升高2.0 ℃。測(cè)量周期為30 min/次，測(cè)量前進(jìn)行20 min的暗適應(yīng)時(shí)間。通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)獲得的光合作用參數(shù)變化趨勢(shì)如圖5所示。

從圖5-a可知，在常溫25 ℃下，F(xiàn)v/Fm比較平穩(wěn)，隨著溫度的上升，F(xiàn)v/Fm呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。最終溫度在50 ℃的時(shí)候已經(jīng)減弱到0.437，表明植物的光合系統(tǒng)已經(jīng)受損嚴(yán)重。其測(cè)量結(jié)果與Mini-PAM結(jié)果一致，線性相關(guān)系數(shù)為0.982（圖5-b）。通過(guò)對(duì)比主要的參數(shù)Fo、Fm和Fv/Fm等，證明本研究的光合速率測(cè)量?jī)x的有效性。

4結(jié)論

本研究基于快相熒光動(dòng)力學(xué)原理研制了植物光合作用速率測(cè)量系統(tǒng)，應(yīng)用分支光纖方式對(duì)激發(fā)光與熒光進(jìn)行收集，設(shè)計(jì)快相熒光硬件檢測(cè)電路，應(yīng)用快速下降法算法對(duì)熒光曲線反演獲得光合作用參數(shù)信息， 并結(jié)合環(huán)境光照信息計(jì)算獲得

植物的光合速率。將獲得的光合參數(shù)與PAM技術(shù)進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果表明具有較好的一致性，本研究成果為植物光合作用研究提供了一種新的測(cè)量手段。

致謝：衷心感謝國(guó)家環(huán)境保護(hù)環(huán)境光學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以及國(guó)家環(huán)境光學(xué)監(jiān)測(cè)儀器工程技術(shù)研究中心為本研究工作開(kāi)展所提供的技術(shù)與平臺(tái)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1]許大全. 光合作用效率[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002：28-36.

[2]Raines C A. Increasing photosynthetic carbon assimilation in C3 plants to improve crop yield：current and future strategies[J]. Plant Physiology，2011，155（1）：36-42.

[3]吳慶余，劉志禮. 測(cè)定浮游植物光合作用速率的 14C方法[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，1986（3）：63-65.

[4]Kautsky H，Hirsch A. Neue versuche zur kohlens？ureassimilation[J]. Die Naturwissenschaften，1931，19（48）：964.endprint

[5]韓博平，韓志國(guó)，付翔. 藻類光合作用機(jī)理與模型[M]. 北京：科學(xué)出版社，2003：35-40.

[6]Guan W，Gao K. Impacts of UV radiation on photosynthesis and growth of the coccolithophore Emiliania huxleyi （Haptophyceae）[J]. Environmental and Experimental Botany，2010，67（3）：502-508.

[7]Ji C F，Legrand J，Pruvost J，et al. Characterization of hydrogen production by Platymonas subcordiformis in torus photobioreactor[J]. International Journal of Hydrogen Energy，2010，35（13）：7200-7205.

[8]Helbling E W，Pérez D E，Medina C D，et al. Phytoplankton distribution and photosynthesis dynamics in the Chubut River estuary （Patagonia，Argentina） throughout tidal cycles[J]. Limnology and Oceano-graphy，2010，55（1）：55-65.

[9]Schreiber U，Schliwa U，Bilger W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer[J]. Photosynthesis Re-search，1986，10（1/2）：51-62.

[10]Kolber Z S，Prasil O，F(xiàn)alkowski P G. Measurements of variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques：defining methodology and experimental protocols[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1998，1367（1/2/3）：88-106.

[11]Shi C Y，Zhang Y J，Yin G F，et al. Measurement of algae PSⅡ photosynthetic parameters using high-frequency excitation flashes[J]. Chinese Optics Letters，2014，12（8）：80101-80104.

[12]Suggett D J，Práil O，Borowitzka M A. Chlorophyll a fluorescence in aquatic sciences：methods and applications[M]//Developments in applied phycology. Netherlands：Springer，2010，4：19-30.

[13]Oxborough K，Moore C M，Suggett D J，et al. Direct estimation of functional PSⅡ reaction center concentration and PSⅡ electron flux on a volume basis：a newapproach to the analysis of Fast Repetition Rate fluorometry （FRRf） data[J]. Limnology&Oceanography Methods，2012，10（3）：142-154.

[14]李治鑫，李鑫，范利超，等. 高溫脅迫對(duì)茶樹(shù)葉片光合系統(tǒng)的影響[J]. 茶葉科學(xué)，2015，35（5）：415-422.

[15]楊再?gòu)?qiáng)，李伶俐，殷劍敏，等. 灌漿初期不同時(shí)長(zhǎng)高溫脅迫對(duì)早稻葉片光合和熒光參數(shù)的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)氣象，2014，35（1）：80-84.陳洪濤，孫云娟. 基于改進(jìn)四邊測(cè)距算法的智慧農(nóng)業(yè)無(wú)線傳感器精確定位[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（17）：234-237.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.17.062endprint