馬洋+秦國華+王銳

【摘要】 目的：大鼠后腳掌注射完全弗氏佐劑（complete freunds adjuvant，CFA）可誘導產(chǎn)生條件位置回避（conditioned place avoidance，C-CPA）反應，大鼠經(jīng)過“非痛環(huán)境”/“痛環(huán)境”適應后，檢測形成的C-CPA行為反應可持續(xù)多長時間。方法：（1）根據(jù)后腳掌注射CFA后觀察痛行為的時間，將大鼠隨機分為Day3組、Day5組、Day7組、Day10組、Day14組共五個實驗組；（2）建立CFA誘導的CPA模型；（3）檢測各組大鼠CPA反應；（4）Western-blot檢測rACC腦區(qū)痛情緒相關NMDA受體亞基NR1及磷酸化（p-NR1）的表達水平。結果：大鼠后腳掌注射CFA后五組大鼠熱痛行為反應隨時間無明顯變化；CPA反應在Day3組、Day5組、Day7組、Day10組大鼠與注射CFA前相比產(chǎn)生了明顯的CPA反應，而Day14組的CPA反應明顯減弱；同步Western-blot檢測的p-NR1表達也呈現(xiàn)了與行為反應一致的變化趨勢。結論：CFA一次注射與環(huán)境條件化適應建立的C-CPA模型建成后可維持至少10 d的時間，之后CPA反應逐漸消失，且NMDA受體NR1亞基磷酸化水平與CPA反應的形成有關。

【關鍵詞】 完全弗氏佐劑； 環(huán)境適應； 條件位置逃避； 前扣帶皮層； NR1磷酸化

【Abstract】 Objective：Rats injected subcutaneously into the hind paw with complete freunds adjuvant（CFA） were acclimated to one side of cage apparatus to induce conditioned place avoidance（CPA） responses.Then we examined how long C-CPA response was sustained.Method：（1）According to the observation time of CFA-injection into the hind paw，the rats were randomly divided into five groups，such as Day3 group，Day5 group，Day7 group，Day10 group and Day14 group.（2）To establish CFA-induced conditioned place avoidance（C-CPA）.（3）Conditioned place avoidance responses were detected in each group.（4） The expression of NR1 subunits and its phosphorylation were measured by Western-blot.Result：CFA-injection into the hind paw induced nociceptive behaviors and CPA responses.The nociceptive behavior had no obvious change in the course of experiment，and the CPA responses in Day3 group，Day5 group，Day7 group and Day10 group compared with the control group，whereas the responses in Day10 group gradually disappeared.The expressions of the phosphorylation of NR1 measured synchronously presented the same trends with CPA responses.Conclusion：C-CPA responses can stably maintain 10 days，then gradually disappeare.And the expression of p-NR1 relates to the formation of CPA responses.

【Key words】 Complete freunds adjuvant； Acclimation； Conditioned place avoidance； Anterior cingulate cortex； Phosphorylation of NR1 subunits

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.29.002

國際疼痛研究會（IASP）將疼痛定義為：“一種不愉快的感覺和情緒體驗，其發(fā)生與實際或潛在的組織損傷有關或這類損傷的相關描述?！笨梢?，疼痛包含兩種成分：即痛的感覺分辨（sensory-discriminative）和痛的情緒反應（emotional-affective dimensions）[1-2]。前者主要感受和編碼刺激的屬性，如刺激的性質(zhì)、強度、定位等；后者指痛的情緒、情感反應，涉及編碼傷害性刺激所引發(fā)的厭惡、焦慮、恐懼等負性情緒。神經(jīng)傳導疼痛的情緒和感覺成分時有著不同的通路和機制。有研究表明，ACC和疼痛的情緒方面密切相關，在ACC內(nèi)，N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）受體是由NR1、NR2及NR3三種不同的亞基構成的異四聚體復合物，并參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種功能，包括學習記憶和痛覺調(diào)制等[3]，基本亞基NR1參與NMDA受體活性的調(diào)節(jié)，并通過自身磷酸化過程異化突觸傳遞[4]，因此上調(diào)NR1亞基的磷酸化（P-NR1）水平可使突觸傳遞的可塑性增強，進一步導致痛覺過敏及異常疼痛[5-7]。endprint

完全弗氏佐劑（complete freunds adjuvant，CFA）常被用在持續(xù)性炎性疼痛的模型中，本實驗室在痛情緒機制的研究中將CFA慢性炎性痛模型和條件位置回避結合起來，利用可產(chǎn)生持續(xù)性炎性痛的CFA作為致痛物質(zhì)，建立了簡便、有效、實驗周期更短的CFA誘導的CPA反應（C-CPA）模型[8]，該模型完成baseline測試、條件化適應和CPA反應檢測只需3 d時間[9-10]，很好地模擬并量化了大鼠的痛情緒反應，并對此進行相關機制的研究。但是該模型建立的CPA反應究竟能持續(xù)多長時間還不清楚，本實驗將利用C-CPA反應結合ACC腦區(qū)NMDA受體亞基NR1磷酸化的表達，對該反應模型做一時效性觀察?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，體重250～270 g，由北京海淀興旺實驗動物養(yǎng)殖場供應。完全弗氏佐劑（CFA，sigma）、熱板刺激儀（life science）、條件位置回避裝置（自制）、嚙齒類動物固定裝置、NeuroMotive軟件（USA）、ANY-maze軟件（USA）

1.2 實驗方法

1.2.1 建立慢性持續(xù)性炎性動物模型 將完全弗氏佐劑（CFA）原液與0.9%氯化鈉溶液按1∶1混合，振蕩混勻為乳化狀態(tài)，抽取0.08 mL注射于大鼠左側(cè)腳掌皮下。注射完后一只手摁壓針眼處，另一只手輕柔注射部位片刻，利于CFA吸收并防止出血。之后，大鼠左側(cè)腳掌會出現(xiàn)一個較長時間的炎癥痛，即紅、腫、熱、痛，對熱刺激或機械刺激敏感的基本炎癥反應狀態(tài)。

1.2.2 大鼠痛情緒的測量方法

1.2.2.1 條件位置回避（CPA）裝置[8]的介紹 CPA為一無頂無底的有機玻璃材質(zhì)的長盒，中間有一可抽取的有機玻璃擋板阻隔，將長盒平均分成兩個匹配室，一個室四面內(nèi)側(cè)貼有間隔一致的紅色水平條帶，底部為3 mm×3 mm孔徑的鋼絲網(wǎng)眼，另一室貼有藍色垂直條帶，底部為6 mm×6 mm孔徑的鋼絲網(wǎng)眼。將一個小LED燈掛在貼有藍色條帶室的外側(cè)，光強度為能使相應室有亮度，但不影響另外一個室，達到使兩室明暗程度不一的目的。由此形成的兩個獨立匹配室對大鼠有視覺和觸覺的差別。

1.2.2.2 CPA的訓練過程 由CFA誘導的條件位置回避實驗過程分為三個階段每個階段之前都要打開暗室的15 W燈，讓大鼠適應30 min，第一階段：Pre-conditioning test（Day1）將兩匹配室中間的隔板取出，讓大鼠自由活動10 min，記錄大鼠活動行為，并分析大鼠在兩室的停留時間。第二階段：Conditioning test（Day2）將兩室中間的隔板插入，形成兩個相對獨立的室。將大鼠任意放入其中一個室自由活動30 min，規(guī)定此室為非CFA匹配室，即“非痛環(huán)境”。之后將大鼠放回飼養(yǎng)籠，30 min后給大鼠左側(cè)腳掌皮下注射0.08 mL配好的弗氏完全佐劑（CFA）注射液。2 h后，將大鼠放入另外一個室自由活動30 min，規(guī)定此室為CFA匹配室，即“痛環(huán)境”。之后將大鼠放回籠中飼養(yǎng)。第三階段：Post-conditioning test分別在3、5、7、10、14 d將兩匹配室中間的隔板取出，讓大鼠自由活動10 min，記錄大鼠活動行為，并分析大鼠在“非痛環(huán)境”和“痛環(huán)境”中停留的時間。用大鼠第三階段在“痛環(huán)境”匹配室停留的時間減去第一階段在該室停留的時間，差值稱為回避分數(shù)（CPA Score）。CAP的訓練過程，見圖1。

1.2.3 大鼠熱縮足潛伏期（PWL）的測量方法 將大鼠放在罩有有機玻璃盒且未加熱的熱板上適應

30 min，隨后取出大鼠，調(diào)節(jié)熱板加熱到50 ℃后保持溫度恒定。計時顯示歸零時，將大鼠再次放入熱板上，立即蓋上蓋子，同時踩下踏板開始計時，當大鼠舔或者抬起后肢時立即踩踏踏板，停止計時，并迅速將大鼠取出放回籠中。熱縮足潛伏期為大鼠放入熱板到后肢抬起的時間。正常大鼠的PWL應保持在10～15 s，如果沒有現(xiàn)象，在超過20 s后將大鼠取出，避免組織損傷。每只大鼠測量三次后求均值作為最后結果，每隔15 min測量一次。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism6軟件對數(shù)據(jù)進行分析和作圖，計量資料以（x±s）表示，大鼠在“痛環(huán)境”匹配室的第一、三階段停留時間進行配對t檢驗，組間比較進行非配對t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠后腳掌注射CFA可誘導產(chǎn)生C-CPA反應 各組大鼠條件適應前后在“疼痛環(huán)境”中停留的時間，Day3組[Pre（323.80±12.95）s vs Post（178.70±27.25）s，n=7]，Day5組[Pre（291.80±16.49）s vs Post（176.30±42.95）s，n=9]，Day7組[Pre（336.80±23.08）s vs Post（246.30±30.90）s，n=8]，Day10組[Pre（316.30±20.44）s vs Post（199.50±27.97）s，n=8]，Day14組[Pre（307.30±16.27）s vs Post（270.70±21.99）s，n=9]，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各組大鼠逃避分數(shù)比較：NS組（9.96±29.80）s，Day3組（-145.10±22.13）s，Day5組（-115.50±44.45）s，Day7組（-90.46±28.93）s，Day10組（-61.43±58.00）s，Day14組（-36.56±25.69）s，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。大鼠后腳掌注射CFA后，通過比較各組大鼠處理前后在“疼痛環(huán)境”中停留的時間可知，Day3組、Day5組、Day7組和Day10組大鼠在“疼痛環(huán)境”匹配室的時間和第1天相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），Day14組大鼠在“疼痛環(huán)境”匹配室的時間和第1天相比差異無統(tǒng)計意義（P>0.05），各組回避分數(shù)和正常組相比，Day3組、Day5組、Day7組和Day10組差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），Day14組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖2。endprint

2.2 大鼠后腳掌注射CFA可誘導rACC神經(jīng)元NMDA受體NR1發(fā)生磷酸化 如圖3所示，Day3組、Day5組、Day7組和Day10組大鼠rACC區(qū)NR1的磷酸化表達水平和正常組相比差異均有統(tǒng)計學意義（n=3，P<0.05），Day14組無明顯變化（n=4，P>0.05）。

2.3 大鼠后腳掌注射CFA引起熱痛行為發(fā)生變化 Day3組[Pre（11.9±1.1）s vs Post（8.9±1.3）s，P<0.05，n=7]，Day5組[Pre（13.9±0.7）s vs Post（8.8±1.0）s，P<0.05，n=9]，Day7組[Pre（12.2±1.2）s vs Post（8.5±0.9）s，P<0.05，n=8]，Day10組[Pre（14.07±1.0）s vs Post（8.7±0.4）s，P<0.05，n=8]，Day14組[Pre（14.27±2.7）s vs Post（8.9±0.6）s，P<0.05，n=9]。后腳掌注射CFA后，各組大鼠PWL與第1天基礎值相比明顯縮短，各組大鼠PWL比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖4。

3 討論

疼痛是一種包含感受、情緒和認知的多維度體驗，也是人們?nèi)メt(yī)院就醫(yī)的最主要起始原因。在過去，人們對痛感覺成分的研究獲得了巨大的進展。近些年的臨床觀察顯示，慢性痛患者所遭受的惡性情緒遠比疼痛本身更為嚴重。目前研究者們利用CPA模型對痛情緒進行深入研究[11-14]，那么在動物模型中以炎性致痛物質(zhì)CFA誘導的CPA反應究竟能持續(xù)多長時間呢？

為此，在實驗過程中，與足底注射生理鹽水對照組相比，給大鼠后腳掌注射CFA可以成功誘導出CPA反應，通過給大鼠足底注射CFA所產(chǎn)生的自發(fā)性、持續(xù)性疼痛與環(huán)境相耦合，使動物產(chǎn)生明顯的厭惡“疼痛環(huán)境”的痛情緒反應[15]。大鼠腳掌注射CFA后，實驗者分別在第3、5、7、10和14天檢測各組大鼠的CPA反應和PWL變化。結果發(fā)現(xiàn)，在檢測CPA反應過程中，Day3組、Day5組、Day7組和Day10組大鼠條件適應后，在“疼痛環(huán)境”中停留的時間明顯小于適應之前在此環(huán)境中停留的時間，各自的回避分數(shù)和正常組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明大鼠產(chǎn)生了明顯的CPA反應；而Day14組卻均無顯著變化，沒有產(chǎn)生CPA反應，說明大鼠在第14天痛情緒得到緩解。此外，與正常組相比，各組大鼠的熱縮足潛伏期明顯縮短，說明大鼠慢性炎性痛持續(xù)存在。以上結果表明，該模型中大鼠產(chǎn)生的CPA反應在第14天得到緩解，而炎性痛感受依然存在。之前的研究發(fā)現(xiàn)疼痛的兩種成分分別是通過不同的機制來發(fā)揮作用的[16]，通過本實驗也證明了這種現(xiàn)象。

有資料表明ACC腦區(qū)神經(jīng)元上分布著大量的NMDA受體， NMDA受體包括NR1必需亞基和NR2A-D調(diào)節(jié)亞基[7]。在實驗中，實驗者檢測了CFA誘導痛情緒反應時NR1亞基的磷酸化水平，結果顯示，與足底注射生理鹽水組相比，Day3組、Day5組、Day7組和Day10組大鼠rACC區(qū)NR1亞基的磷酸化水平顯著升高，而Day14組無明顯變化（P>0.05），說明NMDA受體亞基NR1的磷酸化介導了CFA誘導大鼠產(chǎn)生CPA反應。本研究通過C-CPA反應在慢性炎癥痛大鼠模型中的持續(xù)時間和rACC區(qū)NMDA受體亞基NR1磷酸化的表達情況，明確了該動物模型實驗觀察的時效性，也證實了NR1磷酸化是形成并維持痛情緒反應的重要基礎，這為今后利用該動物模型深入研究痛情緒提供了實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2017-05-18） （本文編輯：程旭然）endprint