李慧超+師亮+楊艷萍

【摘要】 目的：探討呼吸內胚層及第二生心區(qū)與小鼠胚胎心動脈端發(fā)育的關系。方法：對35例胚齡9～13 d小鼠胚胎心連續(xù)石蠟切片應用抗音猬因子（Shh）、抗Ptc1、抗Smo、抗心肌肌球蛋白重鏈（MHC）、抗胰島因子（ISL-1）、抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體進行免疫組織化學和免疫熒光化學染色。結果：胚齡9～11 d，呼吸內胚層開始發(fā)育，其腹側形成Ptc1陽性的內胚層細胞索，與緊鄰的第二生心區(qū)咽前ISL-1陽性間充質細胞形成對稱的錐體形結構，頂端突入動脈囊腔。胚齡12～13 d，隨內胚層細胞索消失，氣管腹側ISL-1陽性間充質細胞數量明顯減少，心包內主動脈和肺動脈分離。結論：發(fā)育中的呼吸內胚層可能通過Shh信號通路為第二生心區(qū)咽前ISL-1陽性間充質細胞的發(fā)育聚集提供位置信息，參與小鼠胚胎心流出道的正常形態(tài)發(fā)生。

【關鍵詞】 呼吸內胚層； 第二生心區(qū)； 小鼠； 免疫組織化學； 免疫熒光

【Abstract】 Objective：To explore the relationship of pulmonary endoderm and the second heart field with development of the distant of the mouse embryonic heart.Method：Serial sections of thirty-five mouse embryos from embryonic day（ED）9 to embryonic day（ED）13 were stained immunohistochemically or immunofluorescently with antibodies against Sonic Hedgehog（Shh），Patched（Ptc1），Smoothened（Smo），myosin heavy chain（MHC），islet 1（ISL-1），α-smooth muscle actin（α-SMA）.Result：From ED9 to ED11，pulmonary endoderm started to develop，and formed a solid endoderm cord with Ptc1 positive expression which was surrounded by ISL-1 positive prepharyngeal mesenchyme in the second heart field projected into the aortic sac.During ED12 to ED13，following the disappearance of endoderm cord，the quantity of ISL-1 positive mesenchyme cells was obviously reduced，aorta and pulmonary artery were totally seprated.Conclusion：The developing pulmonary endoderm probably provides the positional information for the aggregation of ISL-1 positive prepharyngeal mesenchyme in the second heart field to take part in the morphogenesis of the outflow tract in mouse embryonic heart.

【Key words】 Pulmonary endoderm； Second heart field； Mouse； Immunohistochemisty； Immunofluorescence

First-authors address：Changchun Medical College，Changchun 130031，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.29.001

胚胎心流出道的正常發(fā)育和分隔保證了機體血液循環(huán)的有效進行[1]。近年研究表明，胚胎心流出道的分隔和延長有賴于第二生心區(qū)心前體細胞的參與[1-2]。位于咽前胰島因子（ISL-1）是心前體細胞較好的標記蛋白，敲除ISL-1基因小鼠胚胎右心室、流出道缺失[3]。Shh信號通路參與維持第二生心區(qū)細胞的存活和增殖，條件性敲除前腸內胚層處Shh信號通路中任一成員，均引起相似的呼吸系統(tǒng)及流出道發(fā)育畸形[4-6]，但由于轉基因或敲基因引起的心臟畸形動物多死于胚胎早、中期，對流出道正常發(fā)育的關系鮮見報道。本實驗觀察Shh信號通路分子在前腸呼吸內胚層的表達規(guī)律，探討其與第二生心區(qū)咽前ISL-1陽性間充質的關系，為進一步闡明流出道發(fā)育畸形提供一定的形態(tài)學基礎?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 取2～3月齡健康中國昆明雌性小鼠（山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供）20只，體質量25～30 g。在明暗周期條件下飼養(yǎng)，動情期與同種雄鼠合籠過夜，次晨發(fā)現陰栓者即妊娠0.5 d。妊娠小鼠經剖腹收集9～13 d胚胎共計35例，其中9 d胚胎連帶子宮，10～13 d胚胎從子宮內剝離，均經混合固定液固定24 h，固定液比例為甲醇∶丙酮∶水=2∶2∶1，后經脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，制作厚度為6 μm的連續(xù)石蠟切片。每隔6片取1片做HE染色，其余切片進行免疫組織化學染色及免疫熒光化學染色。

1.2 免疫組織化學染色 標本經脫蠟、水化后，3%過氧化氫和TENG-T（Tris 10 mmol/L，NaCl 150 mmol/L，EDTA 5 mmol/L，0.25% gelatin，0.05% Tween-20，pH 8.0）[7]各封閉30 min，再分別用山羊抗Ptc1（1∶100，Santa Cruz）、抗Smo（1∶150，Santa Cruz）多克隆抗體，小鼠抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA，1∶1000，1A4，Sigma）、抗Shh（1∶40，Developmental Studies Hybridoma Bank）、抗心肌肌球蛋白重鏈（MHC，1∶1000，Upstate）單克隆抗體，兔抗ISL-1（1∶200，AB Tech）多克隆抗體室溫孵育過夜，最后依次經兔抗小鼠IgG或兔抗羊IgG、羊抗兔IgG和兔過氧化物酶-抗過氧化物酶復合物分別孵育[8]，DAB顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。endprint

1.3 免疫熒光化學染色 切片脫蠟、水化、封閉處理后，兔抗ISL-1（1∶100，AB Tech）抗體分別與山羊抗抗Smo（1∶50，Santa Cruz）、Ptc1（1∶20，Santa Cruz）抗體混合，切片室溫孵育過夜，混合二抗FITC-驢抗兔IgG（1∶50，Santa Cruz）和Cy3-驢抗山羊IgG（1∶50，康為世紀生物有限公司）孵育1 h，核復染10 min，封片，熒光顯微鏡照相。

2 結果

（1）胚齡9 d，心管彎曲成襻，前腸與動脈囊之間間充質細胞極少，前腸腹側壁內胚層局部增厚，將向呼吸系統(tǒng)發(fā)育，稱之為呼吸內胚層，呈Shh陽性表達（圖1A），心管動脈端可見ISL-1陽性細胞，并與心肌特異性MHC表達重疊（圖1B～C）。（2）胚齡10 d，呼吸內胚層繼續(xù)增厚并向腹側突出，呈Ptc1陽性表達（圖2A），表明呼吸內胚層向喉氣管溝發(fā)育，呼吸內胚層與動脈囊之間間充質細胞增多，并在內胚層突起周圍呈ISL-1較強表達（圖2B）。（3）胚齡11 d，喉氣管溝繼續(xù)發(fā)育，其頂端形成ISL-1和Ptc1雙陽性實心內胚層細胞索（圖3A），指向動脈囊背側壁間充質，ISL-1陽性細胞圍繞喉氣管溝形成對稱的錐體形結構，并隨發(fā)育細胞數量逐漸增多，錐體形結構范圍不斷擴大，其頂端與流出道心內膜墊相融合，形成主肺動脈隔雛形，免疫熒光雙染可見ISL-1和Smo雙陽性細胞（圖3B），此時前腸背側食管內胚層周圍未見其聚集。（4）胚齡12 d，氣管在流出道水平已與食管完全分隔，氣管腹側的內胚層細胞索縮短變粗，細胞排列變松散，與周圍間充質分界不清晰，但仍呈Ptc1陽性，氣管腹側ISL-1陽性錐體形結構體積明顯減小，錐體頂端指向主肺動脈隔，表達較強的α-SMA（圖4A～C）。（5）胚齡13 d，氣管腹側細胞索消失，ISL-1陽性間充質細胞數量明顯減少，氣管失去Ptc1表達（圖5A～B）。

3 討論

3.1 呼吸內胚層與第二生心區(qū)咽前ISL-1陽性間充質分布規(guī)律 胚齡9 d，前腸內胚層腹側上皮逐漸增生，呼吸內胚層開始發(fā)育。至胚齡10 d，前腸呼吸內胚層腹側的ISL-1陽性間充質細胞開始出現并逐漸增多，前腸腹側ISL-1陽性間充質細胞是第二生心區(qū)的主要組成部分[9-10]，其出現在呼吸內胚層發(fā)育之后，說明兩者的發(fā)育可能存在相關性。隨喉氣管溝的延伸，前腸和動脈囊之間的ISL-1陽性間充質細胞數量不斷增加，圍繞喉氣管溝呈對稱的錐體形結構[11]，實驗中發(fā)現前腸背側食管內胚層周圍未見ISL-1陽性細胞聚集，說明呼吸內胚層誘導ISL-1陽性細胞形成的錐體形結構具有特異性。喉氣管溝不斷向動脈囊背側壁方向延長，特征性錐體形結構的頂端隨之突入動脈囊腔，與動脈囊背側壁融合，最終形成主肺動脈隔，喉氣管溝腹側的實心內胚層細胞索至胚胎發(fā)育13 d流出道分隔完成后才消失，說明第二生心區(qū)咽前ISL-1陽性間充質細胞可能是在呼吸內胚層提供的位置信息引導下正確分布、遷移，完成流出道的正常分隔的。

3.2 Shh信號通路分子與呼吸內胚層發(fā)育 陸地動物生后存活需要心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的共同發(fā)育[12]。前腸內胚層既在胚胎心流出道形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮重要作用，也是呼吸系統(tǒng)發(fā)育的起源，而前腸的發(fā)育有賴于內胚層上皮與鄰近間充質間多種信號因子的相互作用[13-14]。Shh是分泌性糖蛋白，有研究表明，在前腸內胚層可分泌Shh[15-16]，其信號傳遞受靶細胞膜上受體Ptc1和Smo的控制，特異性敲除小鼠內胚層Shh基因或第二生心區(qū)ISL-1表達區(qū)域的Smo基因會引起流出道和心房發(fā)育畸形[15-18]，說明前腸呼吸內胚層借Shh信號系統(tǒng)與ISL-1陽性的第二生心區(qū)存在某種相關性。本實驗觀察到，胚齡9 d，Shh表達于開始發(fā)育的呼吸內胚層，隨發(fā)育表達逐漸減弱，而Ptc1表達增強。Ptc1的表達強度限制Shh的擴散范圍，并可代表Shh信號系統(tǒng)的活躍程度[19]，胚齡10～12 d，Ptc1在發(fā)育中的呼吸內胚層和實心細胞索上的表達說明Shh信號通路活化，Shh信號具有濃度依賴性和短距離作用性[20]，呼吸內胚層細胞增生和細胞索形成可能增加了Shh的分泌量，而呼吸內胚層借此以自分泌的方式調節(jié)自身和喉氣管溝發(fā)育及內胚層細胞索的形成，并通過旁分泌在周圍間充質中形成不同的濃度梯度，誘導ISL-1陽性間充質細胞增生，并以不同數量和密度聚集。喉氣管溝頂端內胚層細胞索擴大了Shh信號的作用范圍，可能也為其周圍聚集的第二生心區(qū)ISL-1陽性間充質細胞提供了距離更近、更精確的位置信息。有報道表明，喉氣管溝向動脈囊方向的主動生長力可能產生機械牽拉作用，進而驅動ISL-1陽性細胞向流出道方向運動，而實心細胞索的形成確保了牽拉力作用的方向，這也說明呼吸內胚層與第二生心區(qū)咽前ISL-1陽性間充質細胞在流出道的正常形態(tài)發(fā)生中具有一定的相關性[21]。

胚齡12 d，氣管腹側內胚層細胞索變短粗，細胞排列松散，課題組其他成員也觀察類似現象，是否通過上皮-間充質轉化為ISL-1陽性細胞尚需進一步研究。

參考文獻

[1] Neeb Z，Lajiness J D，Bolanis E，et al.Cardiac outflow tract anomalies[J].Wiley Interdiscip Rev Dev Biol，2013，2（4）：499-530.

[2] Zaffran S，Kelly R G.New developments in the second heart field[J].Differentiation，2012，84（1）：17-24.

[3] Lin L Z，Bu L，Cai C L，et al.Isl1 is upstream of sonic hedgehog in a pathway required for cardiac morphogenesis[J].Developmental Biology，2006，295（2）：756-763.endprint

[4] Rochais F，Mesbah K，Kelly R G.Signaling pthways controlling second heart field development[J].Circ Res，2009，104（8）：933-942.

[5] Jacobs I J，Ku W Y，Que J.Genetic and cellular mechanisms regulating anterior foregut and esophageal devekopment[J].Dev Biol，2012，369（1）：54-64.

[6] Warburton D，Bellusci S，De Langhe S，et al.Molecular mechanisms of early lung specification and branching morphogenesis[J].Pediatr Res，2005，57（5 Pt 2）：26R-37R.

[7]武姍姍，景雅，楊艷萍，等.神經嵴細胞和胰島因子1陽性細胞與小鼠胚胎心流出道發(fā)育的關系[J].解剖學報，2011，42（5）：684-689.

[8] Liang S，Ya J，Li H C，et al.Pulmonary endoderm，second heart field and the morphogenesis of distal outflow tract in mouse embryonic heart[J].Growth Differ，2014，56（4）：276-292.

[9] Yang Y P，Li H R，Cao X M，et al.Second heart field and the development of the outflow tract in human embryonic heart[J].Dev Growth Differ，2013，55（3）：359-367.

[10] Golzio C，Havis E，Daubas P，et al.ISL1 directly regulates FGF10 transcription during human cardiac outflow formation[J].PLoS One，2012，7（1）：e30 677.

[11]蔡玉瑾，景雅，喬愛秀，等.小鼠胚胎心流出道的形態(tài)發(fā)生與呼吸內胚層發(fā)育耦聯[J].解剖學報，2012，43（6）：802-806.

[12] Peng T，Tian Y，Boogerd C J，et al.Coordination of heart and lung co-development by a multipotent cardiopulmonary progenitor[J].Nature，2013，500（7464）：589-592.

[13] Litingtung Y，Lei L，Westphal H，et al.Sonic hedgehog is essential to foregut development[J].Nat Genet，1998，20（1）：58-61.

[14] Cardoso W V，Lu J.Regulation of early lung morphogenesis：questions，facts and controversies[J].Development，2006，133（9）：1611-1624.

[15] Goddeeris M M，Schwartz R，Klingensmith J，et al.

Independent requirements for Hedgehog signaling by both the anterior heart field and neural crest cells for outflow tract development[J].Development，2007，134（8）：1593-1604.

[16] Hoffmann A D，Peterson M A，Friedland-Little J M，et al.

Sonic hedgehog is required in pulmonary endoderm for atrial septation[J].Development，2009，136（10）：1761-1770.

[17] Bellusci S，Furuta Y，Rush M G，et al.Involvement of sonic hedgehog（Shh）in mouse embryonic lung growth and morphogenesis[J].Development，1997，124（1）：53-63.

[18] Dyer L A，Kirby M L.Sonic hedgehog maintains proliferation in secondary heart field progenitors and is required for normal arterial pole formation[J].Dev Biol，2009，330（2）：305-317.

[19] Incardona J P，Gruenberg J，Roelink H.Sonic hedgehog induces the segregation of patched and smoothened in endosomes[J].Dev Biol，2006，295（2）：756-763.

[20] Dessaud E，Mc Mahon A P，Briscoe J.Pattern formation in the vertebrate neural tube：a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network[J].Development，2008，135（15）：2489-2503.

[21] Varner V D，Taber L A.Not just inductive：a crucial mechanical role for the endoderm during heart tube assembly[J].Development，2012，139（9）：1680-1690.

（收稿日期：2017-08-25） （本文編輯：程旭然）endprint