杜琳琳+呂建穎+曹曉燕+饒鳴帥+施文娟+蘭瑩+孫楓+程兆榜+孟慶長(zhǎng)+袁建華+周益軍+周彤

摘要：為建立科學(xué)有效的玉米品種抗玉米粗縮病人工接種鑒定方法，分別研究了玉米接種苗齡、接種強(qiáng)度及接種時(shí)間3個(gè)因素對(duì)鑒定效果的影響。結(jié)果顯示，玉米接種苗齡在芽鞘期、2葉1心期和4葉1心期接種無(wú)顯著差異；在有效接種強(qiáng)度為3頭/苗條件下，鑒定效果優(yōu)于1～2頭/苗處理；接種12～48 h條件下，鑒定效果優(yōu)于6 h處理。由此構(gòu)建了玉米粗縮病人工接種鑒定方法：在玉米芽鞘期至4葉1心期接種，接種時(shí)間12～48 h，有效接種強(qiáng)度3頭/苗。在此條件下對(duì)玉米品種蘇951進(jìn)行接種鑒定，鑒定結(jié)果與重病區(qū)田間鑒定無(wú)顯著性差異，表明所建立的人工接種鑒定方法能客觀地反映玉米品種對(duì)玉米粗縮病的抗性水平。

關(guān)鍵詞：玉米粗縮??；水稻黑條矮縮病毒；人工接種；抗性鑒定

中圖分類號(hào)： S435.131.4+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）17-0093-02

通信作者：周彤，博士，研究員，主要從事植物抗病性研究。E-mail：zhoutong@jaas.ac.cn。玉米粗縮病（maize rough dwarf disease，MRDD）是由灰飛虱[Laodelphax striatellus （Fallén）]（SBPH）以持久性不經(jīng)卵方式傳播的一種惡性病毒病[1]，通常表現(xiàn)為葉色深綠，植株嚴(yán)重矮化，節(jié)間變短、變粗，葉背出現(xiàn)白色蠟狀突起，籽粒較少或者不結(jié)籽粒[2]。引起MRDD的病毒目前有3種：Rice black streaked dwarf virus（RBSDV）、Mal de Rio Cuarto virus（MRCV）和Maize rough dwarf virus（MRDV），我國(guó)玉米粗縮病病原為水稻黑條矮縮病毒（RBSDV），除侵染玉米外，還可以侵染水稻、小麥、大麥等禾本科植物[3]。該病害于1954年傳入我國(guó)以來(lái)，20世紀(jì)70年代和90年代該病曾在我國(guó)大范圍長(zhǎng)時(shí)間流行，至今已擴(kuò)展到河北、陜西、山東、江蘇、湖北、遼寧等十余省市[4]。近年來(lái)，隨著氣候環(huán)境變化和玉米種植面積的擴(kuò)大，玉米粗縮病的發(fā)生進(jìn)一步趨重，已上升為玉米生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的病毒病害[5]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅2008年山東省發(fā)病面積就達(dá) 1 110.82萬(wàn)hm2，其中重病田塊病株率達(dá)50%以上，而春播、套種玉米病株率可高達(dá)80%以上，山東省因?yàn)榇挚s病造成 1.667萬(wàn)hm2 玉米絕產(chǎn)[6]，嚴(yán)重影響了玉米的安全生產(chǎn)。

目前生產(chǎn)上采用的治蟲防病方法只能作為一種應(yīng)急防治策略，而選育和應(yīng)用抗病品種無(wú)疑是一種更為經(jīng)濟(jì)環(huán)保的防治策略。目前，玉米粗縮病抗性鑒定主要依靠重病區(qū)田間鑒定和人工接種鑒定[7]。田間鑒定易受田間灰飛虱數(shù)量、灰飛虱帶毒率等環(huán)境因素的影響，鑒定結(jié)果重演性與準(zhǔn)確性較差，往往需要多年、多點(diǎn)的重復(fù)試驗(yàn)，極大地延緩了抗粗縮病育種的進(jìn)程[8]。而現(xiàn)有人工接種鑒定方法均直接以接蟲數(shù)量作為接種強(qiáng)度的指標(biāo)，忽略了僅有攜帶RBSDV的灰飛虱才能傳毒這一因素。為此，本課題組引入灰飛虱有效接種量（有效接種量=接種蟲數(shù)×帶毒率）的概念，并從接種苗齡、接種強(qiáng)度和接種時(shí)間3個(gè)方面研究玉米粗縮病人工接種鑒定的最佳條件，以期為玉米抗玉米粗縮病的品種選育提供切實(shí)可行的鑒定技術(shù)。

1材料與方法

1.1玉米材料和接種體的準(zhǔn)備

以感病玉米品種蘇951為接種對(duì)象。于江蘇省重病區(qū)采集植株矮縮、葉色濃綠、分蘗略有增多、心葉有缺刻、葉片質(zhì)厚等表現(xiàn)出小麥綠矮病典型癥狀的小麥植株[9]，參照周彤等的方法[10]將灰飛虱在RBSDV毒源上飼喂獲毒，之后移入育有武育粳3號(hào)秧苗的燒杯中飼養(yǎng)13 d，度過(guò)循回期，每批次飼毒蟲中隨機(jī)取100頭，參照周彤等的方法檢測(cè)灰飛虱帶毒率，并測(cè)算有效接種蟲量（有效接種蟲量=接種蟲量×帶毒率）[11]。

1.2人工接種鑒定最佳條件篩選

1.2.1接種時(shí)間對(duì)鑒定的影響接種時(shí)間設(shè)置6、12、24、48 h 4個(gè)處理，重復(fù)3次。將感病玉米品種蘇951播種于裝有蛭石與營(yíng)養(yǎng)土1 ∶1混配土的500 mL燒杯中，每杯播4株苗，用40目網(wǎng)紗制成防蟲紗罩。待玉米苗長(zhǎng)至2葉1心時(shí)進(jìn)行接種鑒定，接種前2 d淘汰病弱苗，挑選生長(zhǎng)一致的幼苗 25～30株進(jìn)行接種，有效接種強(qiáng)度2頭/苗。每天趕蟲2次，以確保被鑒定的玉米苗均勻獲毒。接種2 d后清除全部灰飛虱，將玉米苗移栽至大田。30 d后開始調(diào)查發(fā)病情況，每7 d調(diào)查1次，連續(xù)調(diào)查3次。參照玉米粗縮病典型癥狀[2]調(diào)查病害發(fā)生情況，計(jì)算發(fā)病率。

1.2.2接種強(qiáng)度對(duì)鑒定的影響有效接種蟲量設(shè)置1、2、3頭/苗3個(gè)處理，重復(fù)3次。播種方式同“1.2.1”節(jié)的方法。待玉米苗長(zhǎng)至2葉1心期進(jìn)行接種鑒定，接種時(shí)間為2 d，接種后處理及調(diào)查方法同“1.2.1”節(jié)的方法。

1.2.3玉米接種苗齡對(duì)鑒定的影響接種苗齡設(shè)置芽鞘期、2葉1心期和4葉1心期3個(gè)處理，重復(fù)3次。播種方式同“1.2.1”節(jié)的方法，按有效接種強(qiáng)度2頭/苗進(jìn)行接種，接種時(shí)間為2 d，接種后處理及調(diào)查方法同“1.2.1”節(jié)的方法。

1.3人工接種鑒定與重病區(qū)田間鑒定效果的比較

選擇大豐稻麥原種場(chǎng)和豐縣歡口鎮(zhèn)沙莊村常年重病區(qū)作為鑒定圃，兩地分別于2012年5月下旬和2014年6月上旬播種玉米品種蘇951。于鑒定圃灰飛虱一代成蟲峰期調(diào)查灰飛虱蟲量并采集500頭高齡若蟲，隨機(jī)取100頭檢測(cè)帶毒率[10]，于田間第1次發(fā)病高峰期調(diào)查發(fā)病情況，每7 d重復(fù)調(diào)查1次，計(jì)算發(fā)病率。玉米整個(gè)生長(zhǎng)期間不噴灑任何殺蟲劑和抗病毒劑。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPASS 16.0軟件處理，Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1人工接種鑒定方法的最佳條件篩選

各批次獲得接種用灰飛虱經(jīng)ELISA檢測(cè)，帶毒率在 15%～42%之間，轉(zhuǎn)換為有效接種蟲量后將獲毒灰飛虱用于人工接種鑒定。病毒在介體體內(nèi)的接種時(shí)間、接種強(qiáng)度、水稻接種苗齡3個(gè)因素對(duì)鑒定效果的影響如表1所示。endprint

接種時(shí)間：隨著接種時(shí)間的增加玉米粗縮病的發(fā)病率不斷升高。接種6、12、24、48 h后，玉米粗縮病的發(fā)病率分別為60.97%、85.63%、86.87%、90.17%，接種12、24、48 h處理顯著高于6 h處理（P<0.05），且這3個(gè)處理間差異不顯著，表明玉米粗縮病人工接種鑒定適宜接種時(shí)間為12～48 h。

接種強(qiáng)度：當(dāng)有效接蟲量為1、2、3頭/苗時(shí)，玉米粗縮病發(fā)病率分別為87.73%、87.75%、98.67%。其中有效接種蟲量3頭/苗的發(fā)病率顯著高于另外2個(gè)處理（P<0.05），但有效接種蟲量每苗為1頭和2頭2個(gè)處理間差異不顯著，表明玉米粗縮病人工接種鑒定適宜接種蟲量為3頭/苗。

接種苗齡：在玉米芽鞘期、2葉1心、4葉1心期接種，玉米粗縮病發(fā)病率分別為83.95%、87.65%、80.64%。3個(gè)處理間發(fā)病率差異不顯著（P>0.05），表明適宜玉米粗縮病人工接種鑒定的接種苗齡為芽鞘期至4葉1心期。

2.2人工接種鑒定與重病區(qū)田間鑒定效果的比較

大豐稻麥原種場(chǎng)和豐縣歡口鎮(zhèn)沙莊村一代灰飛虱成蟲峰期總蟲量分別為1 303.5萬(wàn)、390萬(wàn)頭/hm2，帶毒率分別為200%和3.00%，有效接種蟲量分別為26.1萬(wàn)、11.7萬(wàn)頭/hm2。玉米品種蘇951在2個(gè)重病區(qū)田間鑒定的結(jié)果分別為100%和93.50%。人工接種鑒定與重病區(qū)田間鑒定結(jié)果間無(wú)顯著差異，表明本研究建立的人工接種鑒定方法能夠模擬重病區(qū)田間鑒定效果，它的抗性評(píng)價(jià)結(jié)果可靠。

3討論

20世紀(jì)以來(lái)，國(guó)內(nèi)很多學(xué)者開展了玉米抗玉米粗縮病材料的篩選工作，但鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗病材料較少。目前生產(chǎn)上急需建立科學(xué)、準(zhǔn)確的抗性鑒定方法。田間自然傳毒鑒定方法雖方便快捷，但受環(huán)境條件、灰飛風(fēng)發(fā)生及遷飛數(shù)量等因素制約，難以保證鑒定效果的準(zhǔn)確性和重演性。如張海燕等研究表明登海3622、邦玉358、金海5號(hào)和農(nóng)大108表現(xiàn)為感病[12]，而王延玲等得到的結(jié)果為抗病[13]，楊興飛等和薛林等均鑒定為高抗[14-15]。因此，人工接種鑒定無(wú)疑是更為科學(xué)和可靠的方法。針對(duì)玉米粗縮病的人工接種鑒定方法，前人已做了許多嘗試。但在接種強(qiáng)度的指標(biāo)方面，往往直接使用接蟲數(shù)量，忽略了只有攜帶RBSDV的灰飛虱才能侵染玉米使其發(fā)病這一因素。這使不同研究結(jié)果間出現(xiàn)了較大差異，影響了抗性鑒定效果，如邸墊平等的網(wǎng)箱集團(tuán)接種試驗(yàn)結(jié)果表明，約1.7頭/苗時(shí)發(fā)病率達(dá)92.31%～100%[16]；而Wang等和張愛(ài)紅等分別以10頭/苗和5頭/苗接種，發(fā)病率分別為35.00%和27.67%[17-18]。本研究通過(guò)ELISA方法檢測(cè)灰飛虱帶毒率，并引入灰飛虱有效接種蟲量作為接種強(qiáng)度的量化指標(biāo)。為驗(yàn)證建立的人工接種鑒定方法的可靠性，我們對(duì)重病區(qū)抗性鑒定圃大豐稻麥原種場(chǎng)和豐縣歡口鎮(zhèn)沙莊村進(jìn)行了蟲量和帶毒率的調(diào)查，以1 hm2 67 500株苗折算，其有效接種蟲量折算分別為3.86頭/苗和1.73頭/苗，這與人工接種鑒定的接種強(qiáng)度基本一致。

在稻—麥或玉—麥輪作區(qū)，來(lái)自小麥的第1代攜帶RBSDV的灰飛虱是玉米粗縮病的主要侵染源[19-21]，這一田間傳毒規(guī)律啟發(fā)我們把小麥作為病毒來(lái)源。本世紀(jì)初之前RBSDV侵染小麥后常表現(xiàn)隱癥，但隨著全球氣候變暖導(dǎo)致小麥生育期延長(zhǎng)，以及田間病害發(fā)生程度的日趨嚴(yán)重，田間開始出現(xiàn)小麥綠矮病危害[22]，便于大量獲得飼毒灰飛虱用病毒樣本，有利于提高抗性鑒定的效率和規(guī)模。此外，本試驗(yàn)以小麥綠矮病株為初始毒源飼喂灰飛虱，是在最大程度地模擬田間實(shí)際的基礎(chǔ)上建立的人工鑒定方法。以抗感水平已知的玉米品種蘇951為研究對(duì)象，采用多年多地重病區(qū)田間鑒定和人工接種鑒定方法進(jìn)行分析，二者結(jié)果一致，表明本研究構(gòu)建的人工接種鑒定方法能客觀地反映玉米品種對(duì)玉米粗縮病的抗性水平，希望為玉米品種的抗性評(píng)價(jià)、抗玉米粗縮病品種的選育等提供切實(shí)可行的鑒定技術(shù)。

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