陳興銀+石建明+楊鵬+張凱凱+關(guān)萍

摘要：為探討無籽刺梨及其近緣種的關(guān)系，對采自貴州興仁的無籽刺梨（Rosa sterilis S. D. Shi）、貴州安順的光枝無籽刺梨（Rosa sterilis S.D.Shi var.leioclada M.T.An，Y.Z.Cheng et M.Zhong）及采自貴州遵義、興仁的繅絲花（Rosa roxburghii Tratt.）以及從美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上下載的長尖葉薔薇（Rosa longicuspis Bertal.）進(jìn)行內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析。利用MEGA6.0軟件對ITS序列進(jìn)行分析，ITS序列總長為629 bp，其中ITS1序列長度為253 bp，5.8S長度為164 bp，ITS2長度為212 bp；對無籽刺梨、繅絲花、長尖葉薔薇進(jìn)行組合分析，組合1（無籽刺梨、長尖葉薔薇、興仁繅絲花）和組合2（無籽刺梨、長尖葉薔薇、遵義繅絲花）中整個ITS序列共有26個變異位點，占序列總長度的4.10%，組合3（光枝無籽刺梨、長尖葉薔薇、興仁繅絲花）、組合4（光枝無籽刺梨、長尖葉薔薇、遵義繅絲花）中共有30個變異位點，占序列總長度的4.76%。4個組合中ITS1變異位點數(shù)都為7個，占ITS1序列長度的2.76%，占序列總長度的1.11%；5.8S序列均沒有變異位點；組合1、2中ITS2的變異位點數(shù)為19個，占ITS2序列長度的896%，占序列總長度的3.02%；組合3、4中ITS2的變異位點數(shù)為23個，占ITS2序列長度的10.8%，占ITS序列總長度的3.65%。4個組合中無籽刺梨與光枝無籽刺梨都含有2種堿基疊加的變異位點，疊加的2種堿基中1個來自長尖葉薔薇，1個來自繅絲花，無籽刺梨同時具有繅絲花、長尖葉薔薇的2種ITS序列。通過最大簡約法（MP）進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，無籽刺梨與長尖葉薔薇聚為1支，通過形態(tài)學(xué)比較發(fā)現(xiàn)，無籽刺梨與貴州繅絲花、繅絲花較為接近。研究結(jié)果為進(jìn)一步探討無籽刺梨的物種起源提供了一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：無籽刺梨；ITS序列；變異位點

中圖分類號： S685.120.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0042-05

通信作者：關(guān)萍，博士，教授，研究方向為植物分子生物學(xué)。E-mail：guanp508@163.com。無籽刺梨（Rosa sterilis S. D. Shi）別稱搭鉤刺梨，為薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Roses）多年生落葉攀援性灌木，為貴州省特有種[1]。其果實清爽可口，酸甜適中，并富含維生素C、氨基酸、超氧化物歧化酶（SOD）、多種微量元素等，無籽刺梨因富含大量維生素C，得名“維C之王”，具有廣闊的食品加工、營養(yǎng)保健品等資源開發(fā)前景[2-3]。無籽刺梨因不能產(chǎn)生可育種子而得名，無籽刺梨主要通過扦插進(jìn)行無性繁殖，而多代的無性繁殖可能會導(dǎo)致無籽刺梨品質(zhì)退化[4]。因此可見，分析無籽刺梨的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列，可為進(jìn)一步選育無籽刺梨近緣種進(jìn)行雜交，進(jìn)而保存無籽刺梨優(yōu)良特性奠定一定理論基礎(chǔ)。

季祥彪等對無籽刺梨進(jìn)行形態(tài)解剖研究，認(rèn)為無籽刺梨有可能是1個自然雜交種[5]；在時圣德等報道的薔薇屬新種中，無籽刺梨與繅絲花（Rosa roxburghii Tratt）近緣，其形態(tài)主要有小葉數(shù)量、花的顏色、果實大小及果實有無籽的差異[6]。鄧亨寧等利用核基因和葉綠體基因片段進(jìn)行建樹，得出無籽刺梨為長尖葉薔薇（Rosa longicuspis Bertal.）和繅絲花的天然雜交種[7]。雜交是指2個在遺傳上有明顯分化的個體間的交配，交配后一般不能產(chǎn)生有生殖能力的后代[8]。雜交，特別是異源雜交多倍化是新物種形成、多樣化的重要機(jī)制之一[9]。傳統(tǒng)上通常通過中間性狀來判斷一個種是否為雜交種，但是在一些中間性狀不明顯或者不清楚親本的情況下，此方法會判斷不準(zhǔn)確。因此，正如Soltis等研究表明，即使已經(jīng)從形態(tài)學(xué)或細(xì)胞遺傳學(xué)上確定某個物種為雜交種，仍需要其他一些證據(jù)進(jìn)一步驗證[10-11]。相較于其他一些新方法，如同工酶、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）、簡單重復(fù)序列（SSR）等，含有豐富的堿基變化及信息位點的核糖體DNA序列分析更能準(zhǔn)確反映雜交種與親本間的遺傳關(guān)系[12-14]。本研究以天然雜交種無籽刺梨及其可能的親本繅絲花、長尖葉薔薇作為研究對象，以核糖體ITS基因作為分子標(biāo)記，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹分析，探討無籽刺梨與繅絲花、長尖葉薔薇在ITS序列上的變化規(guī)律和特點。

1材料與方法

1.1材料

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)來自14個無籽刺梨的親緣物種，其中6個種的ITS序列由測序所得，測序樣品來自6個種的新鮮葉片，經(jīng)硅膠干燥后，保存于-20 ℃，材料詳細(xì)來源見表1。其他8個種的ITS序列從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載，長尖葉薔薇是根據(jù)無籽刺梨ITS序列在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上利用BLAST通過相似搜索法得到的最為相似的序列，詳見表2。表1供試試驗樣品的采集地等信息

樣品編號材料名稱拉丁學(xué)名采集地1無籽刺梨Rosa sterilis S.D.Shi貴州省黔西南州興仁縣巴鈴鎮(zhèn)2光枝無籽刺梨Rosa sterilis S. D. Shi var. leioclada M.T.An，Y.Z.Cheng et M.Zhong貴州省安順市3繅絲花Rosa roxburghii Tratt.貴州省黔西南州興仁縣巴鈴鎮(zhèn)4小果薔薇Rosa cymosa貴州大學(xué)南區(qū)后山5繅絲花Rosa roxburghii Tratt.貴州省遵義市道真縣上壩鄉(xiāng)6金櫻子Rosa laevigata貴州梵凈山

1.2方法

1.2.1DNA提取稱取經(jīng)硅膠干燥的材料10～20 mg，用植物DNA提取試劑盒提取，試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。DNA提取后，用1%瓊脂糖凝膠與紫外-可見分光光度計檢測DNA的質(zhì)量和濃度，將DNA濃度稀釋至 20 ng/μL，保存?zhèn)溆谩?

1.2.2PCR擴(kuò)增與測序引物選用ITS1（5′-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3′）[15]，引物序列由昆明碩擎有限公司合成。25 μL PCR反應(yīng)體系：1 μL DNA模板，各1 μL正反向引物，125 μL Mix，用ddH2O補齊剩余體積。擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共計38個循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。純化后的PCR產(chǎn)物送至昆明碩擎有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.3序列分析測序得到的序列利用DNAStar中的SeqmanⅡ軟件進(jìn)行編輯和拼接，并進(jìn)行人工矯正。ITS序列的范圍參照GenBank上繅絲花（AB038459.1）序列，確定樣品ITS1、5.8S和ITS2的邊界，拼接好的序列用MEGA6.0軟件進(jìn)行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，以自展法進(jìn)行檢測，共循環(huán) 1 000 次，采用最大簡約法建樹。

2結(jié)果與分析

2.1PCR產(chǎn)物的電泳檢測

6個樣品的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)均有1條明顯的750 bp左右的條帶，與ITS序列大小相似，證明擴(kuò)增程序可行，且擴(kuò)增產(chǎn)物可用于測序。

2.2ITS序列分析

參照GenBank上繅絲花（AB038459.1）ITS序列的范圍排序，數(shù)據(jù)庫上的繅絲花序列排序后缺失3個堿基，2種來自不同地方的繅絲花及無籽刺梨、光枝無籽刺梨、下載的長尖葉薔薇（FJ416657.1）ITS序列（包括ITS1、5.8S、ITS2）長度范圍為604～626 bp。遵義繅絲花缺失25個堿基，無籽刺梨缺失18個堿基，光枝無籽刺梨缺失5個堿基。長尖葉薔薇與興仁繅絲花一樣缺失3個堿基。ITS1序列長度范圍為231～251 bp，其中興仁繅絲花、長尖葉薔薇缺失2個堿基，光枝無籽刺梨缺失3個堿基，無籽刺梨缺失6個堿基，遵義繅絲花缺失22個堿基。5.8S序列長度均為164 bp，沒有變異位點。ITS2序列長度為200～211 bp，其中來自興仁繅絲花、長尖葉薔薇花的缺失1個堿基，光枝無籽刺梨、長尖葉薔薇序列長度為208 bp，遵義繅絲花缺失3個堿基，無籽刺梨缺失12個堿基。排序后ITS全長為629 bp，ITS1序列長度為253 bp，5.8S序列長度為164 bp，ITS2序列長度為212 bp。

2.3形態(tài)學(xué)分析

通過觀察無籽刺梨、刺梨新鮮標(biāo)本與貴州繅絲花花期臘月標(biāo)本，同時參考《貴州植物志》[16]上長尖葉薔薇的形態(tài)進(jìn)行比較分析，從形態(tài)上來看，無籽刺梨的形態(tài)特征與貴州繅絲花、繅絲花較為接近（表3、圖1）。表3無籽刺梨及其近緣種形態(tài)學(xué)比較分析[6，15]

植物種名葉花果繅絲花橢圓形，長1.0～2.2 cm，寬0.6～1.2 cm，托葉大部分與葉柄貼生，離生部分展開花單生，稀，1～2朵簇生，花徑5～6 cm，花瓣重瓣至半重瓣，粉紅色至深紅色果實扁球形無籽刺梨橢圓形或長卵形，長1.3～4.5 cm，寬0.5～2.2 cm，托葉附生于葉柄上，披針形花簇生，5～10朵組成傘房花序，花徑 5 cm，花瓣白色果實球形，外形略像金櫻子，直徑約2 cm貴州繅絲花橢圓形或長卵形，長1.0～3.5 cm，寬0.7～1.8 cm，托葉下部與葉柄貼生，上部離生，呈披刺形花簇生，7～10朵組成傘房花序，花徑 3 cm長葉尖薔薇卵形，卵狀長圓形，橢圓形，長3～7 cm，寬1.0～3.5 cm，托葉大部分與葉柄貼生，離生部分披針形花數(shù)朵至10余朵組成傘房花序，花徑3～4 cm，白色果實倒卵球形，直徑1.0～1.2 cm

2.4聚類分析

基于ITS序列，利用最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)樹，從圖2可看出，來自貴州遵義和興仁的繅絲花與GenBank上下載的繅絲花序列聚為1支的支持率為98%，貴州銅仁金櫻子與GenBank上下載的金櫻子序列聚單聚為1支的支持率為75%，金櫻子單聚為1支，形態(tài)學(xué)上將金櫻子分在金櫻子組中。無籽刺梨和光枝無籽刺梨聚為1支，支持率為99%，無籽刺梨與光枝無籽刺梨為同一種，無籽刺梨和光枝無籽刺梨與長尖葉薔薇構(gòu)成姐妹群。碩苞薔薇單聚為1支，根據(jù)形態(tài)學(xué)分類，碩苞組中只含有碩苞薔薇。小果薔薇和木香花聚為1支，形態(tài)學(xué)上將小果薔薇與木香花歸為木香組。腺齒薔薇、尾萼薔薇和玫瑰聚為1支，形態(tài)學(xué)分類中腺齒薔薇、尾萼薔薇和玫瑰為桂味組，蘋果為外類群，其系統(tǒng)發(fā)育樹與形態(tài)學(xué)上分類基本一致。

2.5變異位點及堿基類型

通過MEGA 6.0對序列進(jìn)行分析，以無籽刺梨和光枝無籽刺梨為中心，進(jìn)行組合分析變異位點、堿基類型。興仁繅絲花、無籽刺梨、長尖葉薔薇為第1個組合，遵義繅絲花、無籽刺梨、長尖葉薔薇為第2個組合，貴州興仁繅絲花、光枝無籽刺梨、長尖葉薔薇為第3個組合，遵義繅絲花、光枝無籽刺梨、長尖葉薔薇為第4個組合。組合1中共有26個變異位點，占ITS序列總長度的 4.10%，其中ITS1有7個變異位點，占ITS1序列長度的 2.76%，占ITS序列總長度的1.11%，5.8S中沒有變異位點，ITS2中含有19個變異位點，占ITS2序列長度的8.96%，占ITS序列總長度的3.02%。組合2、組合1的變異位點數(shù)與變異比例一樣。組合3中總變異位點為30個，占ITS序列總長度的4.76%，其中ITS1有7個變異位點，占ITS1序列長度的2.76%， 占ITS序列總長度的1.11%，ITS2

中有變異位點23個，占ITS2序列長度的10.8%，占ITS序列總長度的3.65%。組合4與組合3變異位點數(shù)與變異比例一樣。每個組合具體的堿基變異類型見表4，其中4個組合為不同個體間的4個重復(fù)，4個組合中的ITS序列中，無籽刺梨第46個位點上發(fā)生了堿基的疊加，在這個位點上這2個堿基1個來自繅絲花，1個來自長尖葉薔薇。由圖3、表4可以看出，所有組合上的64位點，組合1、組合2上的第63、103、220位點，組合3、組合4上的第104位點都發(fā)生了堿基疊加。

3討論與結(jié)論

光枝無籽刺梨為安明態(tài)等于2009年發(fā)表的新變種[17]，同年后幾個月，鄧朝義等在對無籽刺梨形態(tài)分類修訂中，對光

枝無籽刺梨進(jìn)行歸并[18]。從形態(tài)學(xué)上無籽刺梨的分類存在一定爭議，基于ITS序列，從構(gòu)建系統(tǒng)樹上可見，無籽刺梨和光枝無籽刺梨聚為1支，支持率為99%，即光枝刺梨和無籽刺梨為同一個種，其結(jié)果與李旦等運用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）分子標(biāo)記和DNA條形碼對無籽刺梨的鑒定結(jié)果一致[19]。

根據(jù)孟德爾遺傳學(xué)定律和植物有性生殖的特點可知，當(dāng)2個親本進(jìn)行雜交時，如果2個親本在相同位點上的等位基因序列不同，那么在子代，尤其是F1代中，將會含有這2種不同序列的等位基因?；贒NA測序儀的工作原理和測序反應(yīng)的特點，當(dāng)1個雜交發(fā)生后，如果2個親本在同一基因的相同位點上的堿基不同，那么，在其雜交后代的相同基因的相同位點上將檢測出2種不同的堿基，其中1個來自父本，1個來自母本，因而在原始測序圖上，將呈現(xiàn)出這2種堿基峰的疊加[20]。由本研究可知，所有組合上的第64位點，組合1、組合2上的第63、103、220位點均發(fā)生了堿基峰的疊加，此外還有組合3、組合4上的第104位點。從本研究還可以看出，以無籽刺梨為重復(fù)，來自興仁、遵義不同個體繅絲花為對照的組合1和組合2的變異位點及變異堿基類型基本一致，以光枝無籽刺梨為重復(fù)，來自興仁和遵義不同個體繅絲花為對照的組合3、組合4的變異位點及變異堿基類型也基本一致。其中第46位點上4個組合中的無籽刺梨堿基都為K，均發(fā)生了堿基疊加，且疊加的堿基中1個來自繅絲花，另1個來自長尖葉薔薇。組合1、組合2的第103位和組合3、組合4的第104位也發(fā)生相同堿基疊加，其位點不一樣的原因為遵義和興仁繅絲花不同個體間有堿基缺失，導(dǎo)致排序后堿基位點發(fā)生變化，無籽刺梨和光枝無籽刺梨為同一種，其中組合1和組合2中第63位上無籽刺梨為堿基疊加，而組合3、組合4中的第63位上光枝無籽刺梨堿基為T，與長尖葉薔薇堿基一樣，4個組合中繅絲花和長尖葉堿基一樣。組合1、組合2上第220位點，以及組合3、組合4上的第221位點情況與第63位點一樣。組合3、組合4在第63、221位點上出現(xiàn)此種情況的原因可能是經(jīng)歷了較長時間的繁衍和生境的不同，而導(dǎo)致光枝無籽刺梨第63位點上的G被替換成了T，第221位上的C被替換成A，ITS2中大多出現(xiàn)繅絲花與長尖葉堿基一致，無籽刺梨堿基不一致，如組合1中的第443位點，繅絲花和長尖葉堿基都為G，無籽刺梨卻為C，其原因可能是無籽刺梨上堿基突變，G被C替換，其他變異位點也發(fā)生了替換。即無籽刺梨與繅絲花、長尖葉薔薇ITS上的基因變化部分符合孟德爾遺傳學(xué)定律。由本研究還看出，組合1和組合2的疊加堿基比組合3和組合4的多，其原因是組合1和組合2中的來自興仁的野生無籽刺梨為原始種，采自時圣德等在貴州薔薇屬新分類群中發(fā)布的新種無籽刺梨本種采集地，位于海拔1 500 m興仁縣巴鈴[6]，安順光枝無籽刺梨則經(jīng)過大規(guī)模人工無性栽培繁殖，通過多次無性繁殖栽培及環(huán)境改變等都可能導(dǎo)致其堿基發(fā)生變化。

綜上所述，無籽刺梨核基因序列與繅絲花和長尖葉薔薇的核基因序列上部分堿基符合孟德爾遺傳學(xué)定律，從用最大簡約法構(gòu)建的進(jìn)化樹來看，無籽刺梨與長尖葉薔薇聚為1支，形態(tài)上對比可知，無籽刺梨與貴州繅絲花較為接近。文曉鵬等認(rèn)為，無籽刺梨為貴州繅絲花的高度不育種[21]。貴州繅絲花僅存1份花期標(biāo)本，存于貴州大學(xué)南校區(qū)博物館內(nèi)，未見果期標(biāo)本，且筆者于2016年多次在貴州繅絲花采集地花溪進(jìn)行搜尋采樣，未發(fā)現(xiàn)貴州繅絲花，并對貴州繅絲花標(biāo)本葉片進(jìn)行DNA反復(fù)提取，由于年代久遠(yuǎn)，未提取到貴州繅絲花DNA，所以無法獲取有關(guān)貴州繅絲花的分子信息，基于上述情況，無籽刺梨與貴州繅絲花的親緣關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]韋景楓，程友忠，蒙先舉，等. 無籽刺梨生物學(xué)特征性觀察[J]. 中國林副特產(chǎn)，2012，121（6）：27-29.

[2]韋景楓，鐘漫，程友忠，等. 無籽刺梨試管苗移栽及其影響因素的探討[J]. 中國林副特產(chǎn)，2010，104（1）：30-31.

[3]鄭元，辛培堯，高健，等. 無籽刺梨的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀及展望[J]. 貴州林業(yè)科技，2013，41（2）：62-64.

[4]林源，唐軍榮，田斌，等. 無籽刺梨的研究現(xiàn)狀及發(fā)展建議[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（4）：122-123，124.

[5]季祥彪，李淑久. 貴州4種刺梨的比較形態(tài)解剖學(xué)研究[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，1998，1（1）：28-33.

[6]時圣德. 貴州薔薇屬新分類群[J]. 貴州科學(xué)，1985（1）：11-12.

[7]鄧亨寧，高信芬，李先源，等. 無籽刺梨雜交起源：來自分子數(shù)據(jù)的證據(jù)[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報，2015，24（4）：10-17.

[8]徐炳聲，顧德興. 雜交在進(jìn)化中的作用及雜種的識別和分類處理[J]. 武漢植物學(xué)研究，1986，4（4）：385-397.

[9]Arnold M L，Bouck A C，Cornman R S. Verne Grant and Louisiana Irises：is there anything new under the sun[J]. New Phytol，2003，161（1）：143-149.

[10]Soltis P S，Doyle J J，Soltis D E. Molecular data and polyploid evolution in plants [M]. US：Springer，1992：177-201.

[11]羅瑜萍，龔維，邱英雄，等. 羊蹄甲屬3種園藝樹種分子鑒定及親緣關(guān)系的ISSR分析[J]. 園藝學(xué)報，2006，33（6）：433-436.

[12]Baldwin B G. Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants：an example from the compositae[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，1992，1（1）：3-16.

[13]Baklwin B G，Sanderson M J. Porter J M，et al. The ITS region of nuclear ribosomal DNA：a valusble source of evidence on angiosprem phyloeny[J]. Annals of the Missouri Botanical Garden，1995，82（2）：247-277.

[14]盧松茂，陳振東，林秀香，等. 基于rDNA-ITS序列的天門冬擬莖點霉與相似種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，31（1）：62-67.

[15]Gurushidze M，Mashayekhi S，Blattner F R，et al. Phylogenetic relationships of wild and cultivated species of Allium section Cepa inferred by nuclear rDNA ITS sequence analysis[J]. Plant Systematics and Evolution，2007，269（3/4）：259-269.

[16]李永康，黃威廉，王興國，等. 貴州植物志[M]. 成都：四川民族出版社，1984：235-247.

[17]安明態(tài)，程友忠，鐘漫，等. 貴州薔薇屬一新變種——光枝無籽刺梨[J]. 資源與利用，2009，1（42）：63.

[18]鄧朝義，方仕能，黃勇. 貴州特有種子植物無子刺梨形態(tài)特征研究及分類學(xué)訂正[J]. 種子，2009，28（9）：62，68.

[19]李旦，周安佩，張德國，等. 基于AFLP分子標(biāo)記和DNA條形碼對無籽刺梨的鑒定[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2015，28（1）：116-121.

[20]袁長春，黎培新，王燕芳，等. 用核糖體ITS區(qū)序列驗證自然雜交種Meconopsis× cookei G. Taylor[J]. 遺傳學(xué)報，2004，31（9）：901-907.

[21]文曉鵬，龐曉明，鄧秀新. 刺梨及部分近緣種形態(tài)學(xué)性狀及RAPD標(biāo)記分析[J]. 園藝學(xué)報，2003，30（2）：204-206.伍革民，徐龍鑫，朱麗莉，等. 瑤山雞TRHR基因編碼區(qū)序列SNP檢測及其與繁殖性狀的相關(guān)性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（17）：47-49.