林鵬飛+任麗群+李平+顧麗菊+李謙+燕志宏

實(shí)驗(yàn)室/貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025； 3.貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心，貴州貴陽(yáng) 550018）摘要：為驗(yàn)證BMPR-IB基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)與宗地花豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性，從而提高宗地花豬繁殖性能，提供有價(jià)值的分子輔助標(biāo)記，推進(jìn)宗地花豬的選育進(jìn)程，以貴州宗地花豬經(jīng)產(chǎn)母豬為試驗(yàn)材料，利用DNA池和DNA直接測(cè)序方法檢測(cè)BMPR-IB基因的多態(tài)性，對(duì)各突變位點(diǎn)不同基因型個(gè)體與總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、仔豬平均初生質(zhì)量和母豬泌乳力性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。在受試群體中發(fā)現(xiàn)，基因BMPR-IB有2個(gè)突變位點(diǎn)，G595C、C643T均位于第6外顯子，經(jīng)產(chǎn)母豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)各基因型均表現(xiàn)為AA>AG>GG、BB>BT>TT，產(chǎn)活仔數(shù)為7頭的母豬泌乳力表現(xiàn)為AA基因型個(gè)體與AG、GG基因型個(gè)體間差異極顯著（P<0.01）；各基因型仔豬平均初生質(zhì)量表現(xiàn)為 TT>BB>BT，但差異不顯著；母豬AA基因型總產(chǎn)仔數(shù)多于AG與GG基因型，AA基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，A為優(yōu)勢(shì)等位基因；BB基因型在總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)的繁殖性狀中多于BT、TT基因型，BB為優(yōu)勢(shì)基因型，B為優(yōu)勢(shì)等位基因。推測(cè)等位基因A和等位基因B可能為宗地花豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)的有利等位基因，且AA基因型和BB基因型為有利基因型。

關(guān)鍵詞：宗地花豬；BMPR-IB基因；多態(tài)性；SNP位點(diǎn)；繁殖性狀；關(guān)聯(lián)性分析

中圖分類(lèi)號(hào)： S828.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）17-0035-04

通信作者：燕志宏，教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與種質(zhì)資源創(chuàng)新。E-mail：yzh611127@sina.com。骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體（bone morphogenetic proteins receptor，簡(jiǎn)稱(chēng)BMPR）是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）發(fā)揮生理功能的基礎(chǔ)，BMPR屬于TGF-β受體超家族中的一個(gè)亞家族成員。BMPR可以分為Ⅰ和Ⅱ2種亞型，其中Ⅰ型受體可以分為BMPR-IA（ALK-3）、BMPR-IB（ALK-6）、ActR-IA（ALK-2），Ⅱ型受體則分為BMPR-Ⅱ、ActR-ⅡA、ActR-ⅡB等3種[1]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB基因?qū)Ψ敝承誀畹挠绊懽钤缡怯蒞ilson等于1980年發(fā)現(xiàn)的，BMPR-IB基因突變后會(huì)引起母羊Booroola Merino高產(chǎn)。后來(lái)，BMPR-IB基因被改名為FecB基因[2]。

研究表明，BMPR-IB基因是與母豬的生殖系統(tǒng)、卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、胚胎發(fā)育等密不可分的基因。試驗(yàn)證明BMPR-IB基因在豬的顆粒細(xì)胞中有表達(dá)[3]。宋一萍對(duì)8個(gè)豬品種的BMPR-IB基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在該基因的編碼區(qū)第 369 bp 處C突變成T，山東地方豬種中在該位點(diǎn)的AA基因型總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)分別比BB基因型多0.45、0.51頭/胎，但差異不顯著；在引進(jìn)豬種中BB基因型母豬的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)分別比AA型多1.05、 0.90頭/胎（P<0.05）[4]。孟洪莉以長(zhǎng)白豬、大白豬、杜洛克豬、槐豬為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)BMPR-IB基因在位點(diǎn)A1081C處，長(zhǎng)白豬、大白豬和杜洛克豬的經(jīng)產(chǎn)母豬的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均表現(xiàn)為AA>CC>AC，其中大白母豬AA基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)顯著高于AC基因型（P<0.05），AA基因型個(gè)體產(chǎn)活仔數(shù)極顯著高于AC基因型（P<0.01），杜洛克母豬AA基因型個(gè)體的產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于CC基因型（P<0.05）；在該基因T19588A處，經(jīng)產(chǎn)和初產(chǎn)長(zhǎng)白母豬的TA基因型個(gè)體總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于TT基因型（P<0.05）[5]。

宗地花豬是貴州省優(yōu)良地方豬種之一，皮厚而糯、肉嫩味香，為人們所喜愛(ài)。但飼養(yǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)仔數(shù)少、生產(chǎn)效率低、成本高、養(yǎng)殖投入高、收益低等使宗地花豬養(yǎng)殖群體規(guī)模發(fā)展緩慢。針對(duì)宗地花豬的保種選育，相關(guān)機(jī)構(gòu)和學(xué)者做了很多研究，推進(jìn)了宗地花豬的開(kāi)發(fā)利用。馮文豪等對(duì)宗地花豬的胴體肉質(zhì)性狀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明雖然宗地花豬瘦肉率明顯低于大白豬，但肉質(zhì)性狀優(yōu)于大白豬[6]。燕志宏等研究宗地花豬1世代的生長(zhǎng)發(fā)育情況[7]，隨后在2011年研究了宗地花豬及其與長(zhǎng)白豬、大白豬的雜種1代豬哺乳期和保育期的生長(zhǎng)性能[8]。燕志宏等還對(duì)產(chǎn)區(qū)保種選育基礎(chǔ)群進(jìn)行了繁殖性能的測(cè)定，隨后開(kāi)始對(duì)宗地花豬繁殖性能的研究[9]。隨著分子生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，燕志宏等分別對(duì)影響宗地花豬肉質(zhì)和繁殖性狀的一些相關(guān)基因進(jìn)行了研究，取得了一定的研究成果[10-14]。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物樣本

66頭宗地花豬經(jīng)產(chǎn)母豬來(lái)自貴州紫薇畜牧業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司宗地花豬飼養(yǎng)場(chǎng)，各母豬均健康，在相同的環(huán)境和管理?xiàng)l件下進(jìn)行飼養(yǎng)，用耳缺鉗采取每頭母豬耳根邊緣耳組織，放入裝有70%乙醇的1.5 mL離心管中，放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，于-20 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑與儀器

主要試劑和儀器：Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒、核酸染料、DL 2000 DNA Marker、 2×Taq Master Mix、瓊脂糖等，均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；去離子水、無(wú)水乙醇、TAE緩沖液等試劑為實(shí)驗(yàn)室自備。PCR擴(kuò)增儀（PTC200，美國(guó)Bio-Rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)（BioSens SC 710，美國(guó)Bio-Rad公司）、微量移液器（ACURA825，SOCOREX公司）。

1.3DNA提取

用基因組DNA提取試劑盒提取DNA，用含有核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)量每個(gè)樣品DNA濃度，共測(cè)3次，取其平均值，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

參照美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡(jiǎn)稱(chēng)NCBI）提供的豬BMPR-IB基因序列（登錄號(hào)為NC-010450.3），利用Premier 5.0軟件結(jié)合Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用NCBI Blast軟件檢測(cè)所設(shè)計(jì)引物的特異性（表1）。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。1.5統(tǒng)計(jì)分析

利用DNAStar等軟件分析測(cè)序結(jié)果，篩選SNPs位點(diǎn)，分析不同位點(diǎn)在受試群體中的基因型頻率和遺傳特異性，并進(jìn)行Hardy-Weinbery（哈迪-溫伯格）平衡檢測(cè)；根據(jù)最小二乘線(xiàn)性模型，分析不同基因型與樣本母豬繁殖性能[總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、仔豬平均初生質(zhì)量、泌乳力（即平均泌乳量）]的關(guān)聯(lián)效應(yīng)。

2結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增

對(duì)66頭宗地花豬經(jīng)產(chǎn)母豬進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均顯示為1條特異性條帶，其片斷長(zhǎng)度分別為398、389 bp，與預(yù)期目標(biāo)片段相符，且條帶清晰、整齊無(wú)拖尾（圖1），可用于測(cè)序。

2.2BMPR-IB基因DNA池PCR測(cè)序結(jié)果

將所得PCR產(chǎn)物送往北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行純化切膠回收測(cè)序，對(duì)所得序列運(yùn)用SeqMan、BioXM等軟件進(jìn)行分析比對(duì)，在BMPR-IB基因上發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNPs位點(diǎn)，均位于第6外顯子上。測(cè)序峰如圖2所示。

2.3宗地花豬個(gè)體BMPR-IB基因測(cè)序結(jié)果分析

運(yùn)用SeqMan軟件對(duì)所有樣品的測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，第6外顯子G595C位點(diǎn)處發(fā)生A→G堿基突變，由圖3可知，有3種基因型，分別命名為AA、AG、GG基因型。第6外顯子C643T位點(diǎn)處發(fā)生B→T堿基突變，發(fā)現(xiàn)3種基因型，分別命名為BB、BT、TT基因型，有2個(gè)等位基因B和T。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，AA、BB基因型個(gè)體序列與GenBank上所提交的豬的基因序列一致，定義為野生型，GG、TT型則定義為突變型，AG、BT基因型定義為雜合型。

2.4基因型頻率及遺傳特異性分析

從群體遺傳學(xué)角度對(duì)宗地花豬BMPR-IB基因各SNP位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率進(jìn)行分析。由表2可見(jiàn)，在G595C位點(diǎn)上，AG 基因型頻率最高， 為優(yōu)勢(shì)基因型， A等位基因頻率為52.27%，表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)等位基因；對(duì)于C643T位點(diǎn)，優(yōu)勢(shì)基因型為BB基因型，B為優(yōu)勢(shì)等位基因。通過(guò)對(duì)

2.5不同基因型與繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

由表3可知，在宗地花豬母豬群中，總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)各基因型均表現(xiàn)為AA﹥AG﹥GG，AA基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均最多，A為優(yōu)勢(shì)等位基因。方差分析結(jié)果表明，宗地花豬母豬總產(chǎn)仔數(shù)表現(xiàn)為AA基因型個(gè)體顯著高于AG、GG基因型個(gè)體，分別多產(chǎn)1.13、1.37頭/胎，AG基因型個(gè)體與GG基因型個(gè)體間總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)差異均不顯著；AA基因型個(gè)體產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于AG、GG基因型個(gè)體，分別多產(chǎn)1.15、1.56頭/胎；GG基因型的仔豬平均初生質(zhì)量最高，GG基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，3種基因型個(gè)體間仔豬平均初生質(zhì)量差異不顯著；產(chǎn)活仔數(shù)為7頭/胎的母豬泌乳力表現(xiàn)為AA基因型個(gè)體與AG、GG基因型個(gè)體間差異極顯著，分別比AG、GG基因型高17.297、22.917 kg。由表3還可知，在宗地花豬母豬群中，總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)各基因型均表現(xiàn)為BB﹥BT﹥TT，BB基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均最多，B為優(yōu)勢(shì)等位基因。方差分析結(jié)果表明，宗地花豬母豬總產(chǎn)仔數(shù)表現(xiàn)為BB基因型個(gè)體顯著高于BT、TT基因型個(gè)體，分別多產(chǎn) 1.06、2.06頭/胎，BT基因型個(gè)體顯著高于TT基因型個(gè)體，多產(chǎn)1.00頭/胎，BB基因型個(gè)體產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于BT、TT基因型個(gè)體，分別多產(chǎn)1.04、1.56頭/胎；仔豬平均初生質(zhì)量各基因型表現(xiàn)為T(mén)T﹥BB﹥BT，但各基因型間差異不顯著；產(chǎn)活仔數(shù)為7頭/胎的母豬泌乳力表現(xiàn)為BB基因型個(gè)體高于BT基因型個(gè)體，由于樣本數(shù)有限，無(wú)法判斷該位點(diǎn)TT基因型個(gè)體的平均泌乳力與BB、BT基因型之間的差異。

3討論

本試驗(yàn)在宗地花豬母豬BMPR-IB基因第6外顯子上發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn)，分別是分別是G595C和C643T，2個(gè)位點(diǎn)均為錯(cuò)義突變，G595C導(dǎo)致編碼的天冬氨酸（aspartic acid，簡(jiǎn)稱(chēng)Asp）變?yōu)榻M氨酸（histidine，簡(jiǎn)稱(chēng)His），C643T位點(diǎn)導(dǎo)致編碼的精氨酸（arginine，簡(jiǎn)稱(chēng)Arg）變?yōu)樯彼幔╰ryptophan，簡(jiǎn)稱(chēng)Trp）。該基因G595C位點(diǎn)在宗地花豬群體中等位基因A、G的基因頻率分別為52.27%、47.73%，多態(tài)信息含量為 0.374 5，屬于中度多態(tài)（0.250.05）。結(jié)果表明，G595C位點(diǎn)在該試驗(yàn)群體的選擇中均不易受到外界人為因素的干擾。同時(shí)這也表明，宗地花豬在該多態(tài)位點(diǎn)的遺傳變異較高，在以后的工作中應(yīng)加強(qiáng)后備母豬基礎(chǔ)群的選育，進(jìn)行有效的選擇與選育。該基因C643T位點(diǎn)在宗地花豬群體中等位基因B、T的基因頻率分別為83.33%、16.67%，等位基因B的頻率明顯高于等位基因T，該位點(diǎn)多態(tài)信息含量為 0.239 2，屬于低度多態(tài)（PIC<0.25），該位點(diǎn)在試驗(yàn)群體中基因突變頻率低，該位點(diǎn)可提供的遺傳信息性較差，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，該位點(diǎn)偏離了Hardy-Weinberg平衡（P<0.05），這可能是由該飼養(yǎng)場(chǎng)的宗地花豬群體樣本數(shù)不夠大引起的。C643T位點(diǎn)屬于低度多態(tài)，表明在以后宗地花豬繁殖性能的選種選育時(shí)，還須進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)群體進(jìn)行試驗(yàn)。

結(jié)果表明，在G595C位點(diǎn)上，宗地花豬母豬總產(chǎn)仔數(shù)、個(gè)體產(chǎn)活仔數(shù)均表現(xiàn)為AA基因型個(gè)體顯著高于AG、GG基因型個(gè)體，產(chǎn)活仔數(shù)為7頭/胎的母豬泌乳力表現(xiàn)為AA基因型個(gè)體與AG、GG基因型個(gè)體間差異極顯著（P<0.01）。綜合本試驗(yàn)繁殖性狀指標(biāo)，AA基因型母豬產(chǎn)仔數(shù)高，且哺乳能力強(qiáng)。在C643T位點(diǎn)上，宗地花豬母豬總產(chǎn)仔數(shù)表現(xiàn)為BB基因型個(gè)體顯著高于BT、TT基因型個(gè)體，BT基因型個(gè)體總產(chǎn)仔數(shù)又顯著高于TT基因型個(gè)體（P<0.05）；BB基因型個(gè)體產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于BT、TT基因型個(gè)體。綜合本試驗(yàn)繁殖性狀指標(biāo)，BB基因型的母豬為高產(chǎn)母豬。

結(jié)果表明，BMPR-IB基因的G595C、C643T突變，均導(dǎo)致突變型經(jīng)產(chǎn)母豬的產(chǎn)仔數(shù)下降，初步說(shuō)明BMPR-IB基因的突變基因型可能會(huì)對(duì)經(jīng)產(chǎn)母豬的產(chǎn)仔數(shù)有一定的抑制作用，這與宋一萍的研究結(jié)果[4]一致。Guan等研究表明，F(xiàn)ecB基因?qū)Ω嵫虻某跎|(zhì)量沒(méi)有顯著影響[15]；楊華等對(duì)雜交羊的研究結(jié)果[16]與Guan等的結(jié)果一致。目前，還未見(jiàn)BMPR-IB基因?qū)ψ胸i初生質(zhì)量的影響報(bào)道，本試驗(yàn)結(jié)果表明，BMPR-IB基因?qū)ψ胸i初生質(zhì)量沒(méi)有顯著影響。BMPR-IB基因?qū)ψ诘鼗ㄘi母豬泌乳力有顯著影響（P<0.05），但目前還未見(jiàn)BMPR-IB基因與母豬泌乳力關(guān)系的相關(guān)性報(bào)道。

由于母豬的繁殖性狀受到多方面因素的影響，在生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中，除了品種、品系，母豬的斷奶時(shí)間、發(fā)情時(shí)間、配種時(shí)間、母豬的斷奶膘情、營(yíng)養(yǎng)水平和飼養(yǎng)管理都會(huì)影響母豬的繁殖性狀[17-20]。本試驗(yàn)雖在相同的營(yíng)養(yǎng)水平和飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下進(jìn)行，但母豬自身的膘情、發(fā)情期、配種期，以及配種公豬的不同等均影響著試驗(yàn)結(jié)果，這造成母豬繁殖性狀數(shù)據(jù)的收集存在很大差異，使結(jié)果不夠準(zhǔn)確。下一步將繼續(xù)擴(kuò)大試驗(yàn)群體數(shù)據(jù)的采集，進(jìn)一步提供宗地花豬母豬繁殖性能的有效標(biāo)記。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.17.010