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(1濰坊醫(yī)學(xué)院,山東濰坊 261053；2濰坊市人民醫(yī)院)

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織中Bcl-6基因異常情況及其臨床意義

于海1，張?jiān)葡?，王慧2，張娜2

(1濰坊醫(yī)學(xué)院,山東濰坊 261053；2濰坊市人民醫(yī)院)

目的觀察彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)中Bcl-6基因異常情況，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。方法DLBCL患者42例，采用Bcl-6雙色斷裂點(diǎn)分離探針熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)Bcl-6基因，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Bcl-6蛋白表達(dá)，采用χ2檢驗(yàn)分析Bcl-6基因異常與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果42例DLBCL患者中發(fā)生Bcl-6基因易位6例，發(fā)生Bcl-6基因擴(kuò)增3例，Bcl-6蛋白表達(dá)陽(yáng)性19例。Bcl-6基因易位患者Bcl-6蛋白表達(dá)陽(yáng)性率較無(wú)易位者高(P=0.014)；Bcl-6基因是否易位患者DLBCL分型、性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。Bcl-6基因是否擴(kuò)增患者Bcl-6蛋白表達(dá)、DLBCL分型、性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論DLBCL中Bcl-6基因存在易位和擴(kuò)增兩種情況，并且Bcl-6基因易位與患者Bcl-6蛋白表達(dá)有密切的聯(lián)系。

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤；Bcl-6；基因異常；臨床指標(biāo)

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是一種高度異質(zhì)性的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，是最常見(jiàn)的侵襲性淋巴瘤。在歐美國(guó)家，DLBCL占非霍奇金淋巴瘤的30%左右，而在我國(guó)，其發(fā)病率高達(dá)40%。既往大量證據(jù)證實(shí)，不同類(lèi)型的淋巴瘤在基因?qū)W、病理形態(tài)以及治療反應(yīng)性等方面均存在明顯差異，尤其是基因異常改變對(duì)指導(dǎo)療效和評(píng)估預(yù)后具有十分重要的臨床意義。因此，深入研究各種類(lèi)型的分子遺傳學(xué)特征，進(jìn)一步了解其具體的發(fā)病機(jī)制并為精準(zhǔn)醫(yī)療提供理論依據(jù)已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。Bcl-6是一種具有下調(diào)基因轉(zhuǎn)錄而抑制細(xì)胞凋亡功能的原癌基因。生理情況下，Bcl-6只表達(dá)于生發(fā)中心。當(dāng)發(fā)生DLBCL后，Bcl-6因發(fā)生斷裂重排或擴(kuò)增，異常表達(dá)的Bcl-6可以通過(guò)抑制PRDM1和p53等的表達(dá)從而促進(jìn)DLBCL的發(fā)生和發(fā)展[1]。故存在Bcl-6基因異常的患者預(yù)后不佳。最近，在2016版世界衛(wèi)生組織(WHO)淋巴腫瘤修訂分類(lèi)中，將伴MYC和Bcl-2和(或)Bcl-6重排的該部分患者分類(lèi)為高侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤[2]?？梢?jiàn)，進(jìn)一步明確Bcl-6基因在DLBCL中的異常改變對(duì)指導(dǎo)臨床具有重要意義。本研究觀察了DLBCL中Bcl-6基因異常情況，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集濰坊市人民醫(yī)院病理科2015年1月～2016年10月病理首次診斷為DLBCL的患者42例。其中男26例、女16例，年齡43～80(58.91±12.31)歲。分型參照2008年WHO關(guān)于造血與淋巴組織腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[3]，其中GBC型16例、n-GCB型26例。納入標(biāo)準(zhǔn)：全部病例診斷均符合《2008年WHO淋巴瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)》；全部研究對(duì)象均未接受化療或放療；年齡≥18歲，資料完整。排除壞死性淋巴結(jié)炎、傳染性單核細(xì)胞增多癥、轉(zhuǎn)移性腫瘤和髓外白血病等疾病。標(biāo)本部位：淺表淋巴結(jié)27例，皮下軟組織6例，胃腸道6例，腸系膜、脾各1例，扁桃體1例。標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制作成簡(jiǎn)易組織芯片蠟塊。

1.2 Bcl-6基因檢測(cè) 采用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)。3 μm石蠟切片常規(guī)處理后，使用Bcl-6雙色斷裂點(diǎn)分離探針(北京金菩嘉，中國(guó))檢測(cè)Bcl-6基因，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在熒光顯微鏡(Olympus BX51，日本)下觀察，應(yīng)用FISH圖像分析軟件進(jìn)行圖像采集、分析和保存。正常Bcl-6基因表現(xiàn)為2個(gè)紅色和綠色熒光融合的黃色信號(hào)；Bcl-6基因易位顯示為1個(gè)紅色、1個(gè)綠色、1個(gè)黃色信號(hào)；Bcl-6基因擴(kuò)增顯示為≥3個(gè)黃色信號(hào)。將20例反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)標(biāo)本按上述方法進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)，每份樣本分析200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出異常信號(hào)的細(xì)胞數(shù)，百分比平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，陽(yáng)性閾值=平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差。本研究將Bcl-6基因易位陽(yáng)性閾值定義為11%，即分析100個(gè)腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)11個(gè)及11個(gè)以上陽(yáng)性細(xì)胞即判斷為Bcl-6基因易位。Bcl-6基因擴(kuò)增陽(yáng)性閾值定義為12%，即分析100個(gè)間期細(xì)胞中出現(xiàn)12個(gè)及12個(gè)以上細(xì)胞顯示≥3個(gè)黃色信號(hào)判斷為Bcl-6基因擴(kuò)增。

1.3 Bcl-6蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法。石蠟切片常規(guī)脫蠟后，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法檢測(cè)觀察組組織中Bcl-6蛋白表達(dá)水平(兔抗人單克隆抗體，1∶100，北京中杉金橋，中國(guó))。DAB顯色后，蘇木素復(fù)染。PBS緩沖液替代一抗作為空白對(duì)照。染色步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。結(jié)果判定：蛋白陽(yáng)性呈棕褐色、棕黃色或淺黃色表達(dá)，主要位于細(xì)胞核。根據(jù)既往蛋白免疫組化判讀標(biāo)準(zhǔn)[4]，以腫瘤組織中陽(yáng)性細(xì)胞百分率計(jì)數(shù)。同時(shí)，按照Hans等[5]分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，最終將Bcl-6蛋白>30%定義為陽(yáng)性表達(dá)。所有評(píng)判均由兩名高年資病理醫(yī)師完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。各因素組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL患者Bcl-6基因異常情況 42例DLBCL患者中發(fā)生Bcl-6基因易位6例，發(fā)生Bcl-6基因擴(kuò)增3例，無(wú)Bcl-6基因擴(kuò)增重排，Bcl-6基因異常率為21.43%。

2.2 DLBCL患者Bcl-6蛋白表達(dá)情況 42例DLBCL患者中Bcl-6蛋白表達(dá)陽(yáng)性19例。

2.3 Bcl-6基因易位與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表1。

表1 Bcl-6基因易位與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.4 Bcl-6基因擴(kuò)增與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表2。

表2 Bcl-6基因擴(kuò)增與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系(例)

3 討論

既往大量證據(jù)表明，DLBCL患者無(wú)論在臨床表現(xiàn)、病理形態(tài)、治療反應(yīng)性及預(yù)后，還是腫瘤細(xì)胞的表型及基因遺傳學(xué)均表現(xiàn)出高度異質(zhì)性[6]。近年來(lái)隨著分子遺傳學(xué)領(lǐng)域研究的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)基因異常在DLBCL發(fā)生發(fā)展、指導(dǎo)治療方案和評(píng)估預(yù)后起著重要的作用。其中，Bcl-6基因異常是調(diào)控DLBCL發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因之一。研究顯示，Bcl-6基因不僅在調(diào)控B細(xì)胞生發(fā)中心的形成中起重要作用[7]，而且可以通過(guò)調(diào)節(jié)B細(xì)胞的活化、分化、細(xì)胞周期和凋亡作用影響DLBCL[8]。Bcl-6基因生物學(xué)活動(dòng)是一個(gè)復(fù)雜的多信號(hào)傳導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng),作用機(jī)制仍不十分清楚。目前有證據(jù)表明，Bcl-6基因的突變和染色體異位是發(fā)生腫瘤的基礎(chǔ)，也是Bcl-6基因異常最主要的兩種方式。當(dāng)Bcl-6基因發(fā)生易位或擴(kuò)增后，其蛋白表達(dá)失去有效的調(diào)節(jié)，異常表達(dá)的Bcl-6可以直接調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的分化、增殖和凋亡而直接促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[9]。此外，Bcl-6基因亦能通過(guò)調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)而調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)，如STAT和Blimp-1等[10]。這也提示，相關(guān)基因異?？赡苁且餌LBCL不同治療反應(yīng)性和預(yù)后差異的重要原因。因此，研究相關(guān)基因的具體作用機(jī)制對(duì)指導(dǎo)臨床治療和評(píng)估預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。

既往大量證據(jù)表明，MYC基因異?？勺鳛锽urkitt淋巴瘤的遺傳學(xué)特征之一。但對(duì)于DLBCL，則缺乏特異性的分子遺傳學(xué)標(biāo)志物。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，DLBCL患者中存在較常見(jiàn)的Bcl-6基因異常。國(guó)外研究報(bào)道，Bcl-6基因易位在DLBCL中檢出率為23.1%[11]；而我國(guó)研究顯示，Bcl-6基因易位檢出率高達(dá)57.5%[12]。這提示，地區(qū)差異可能是發(fā)生Bcl-6基因異常差異的重要原因。本研究DLBCL患者Bcl-6基因異常檢出率僅為21.43%，與國(guó)內(nèi)其他學(xué)者報(bào)道不同，原因可能與納入的研究對(duì)象有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，42例DLBCL患者中發(fā)生Bcl-6基因易位者6例，且6例患者全部表達(dá)為Bcl-6蛋白。而B(niǎo)cl-6蛋白陰性患者中，無(wú)基因易位者。這提示，Bcl-6基因易位與蛋白表達(dá)之間有密切的相關(guān)性。按照Hans分型標(biāo)準(zhǔn)，將全部研究對(duì)象分為GCB型和non-GCB型后，進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，Bcl-6基因易位與Hans分型無(wú)相關(guān)性，這提示，在臨床上不能通過(guò)Hans分型來(lái)評(píng)估患者的Bcl-6基因易位情況。同時(shí)，本研究亦顯示，Bcl-6基因易位與患者性別和年齡無(wú)相關(guān)性。

此外，本研究結(jié)果顯示，有3例患者發(fā)生Bcl-6基因擴(kuò)增(7.14%)，這與韓永勝等[13]報(bào)道的Bcl-6基因擴(kuò)增檢出率為17.2%差異較大，原因可能有多種。3例發(fā)生Bcl-6基因擴(kuò)增患者中蛋白表達(dá)陰性2例、陽(yáng)性1例。進(jìn)一步分析顯示，Bcl-6基因擴(kuò)增病例與無(wú)擴(kuò)增病例中的Bcl-6蛋白表達(dá)、性別及年齡均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，DLBCL中Bcl-6基因存在易位和擴(kuò)增兩種情況，并且Bcl-6基因易位與患者Bcl-6蛋白表達(dá)有密切的聯(lián)系。因此，對(duì)于Bcl-6蛋白表達(dá)陽(yáng)性的患者，發(fā)生Bcl-6基因易位的可能性大，建議行FISH檢測(cè),從而指導(dǎo)其臨床治療。Bcl-6基因擴(kuò)增也是DLBCL中基因異常的重要方式，目前國(guó)內(nèi)外研究較少，對(duì)其作用機(jī)制尚缺乏了解，值得進(jìn)行深入研究。

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山東省濰坊市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20100220)。

張?jiān)葡?E-mail： zhangbing199592@163.com)

2017-07-10)