安 鵬，李星瑤 ，蔡子墨，黨慧敏，李 林，吳喜利

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安710004)， 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(西安712083)

放療與中藥“君-佐”相伍的理論運(yùn)用于肝癌細(xì)胞放療增敏效果分析*

安 鵬1，李星瑤1，蔡子墨1，黨慧敏1，李 林2，吳喜利1

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安710004)， 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(西安712083)

目的：分析采用放療與中藥“君-佐”相伍的理論對(duì)肝癌細(xì)胞放療增敏效果，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法：將HepG2細(xì)胞分為5組，檢測(cè)各組細(xì)胞克隆形成數(shù)及克隆形成率，檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，并分析HIF-1α、CA-9、VEGF或β-actin的蛋白及mRNA水平。結(jié)果：藥物加放療組HepG2細(xì)胞克隆形成數(shù)及克隆形成率顯著低于其他組(P<0.05)；藥物加放療組HepG2細(xì)胞凋亡率明顯高于其他組，且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；藥物加放療組HepG2細(xì)胞HIF-1α/β-actin及VEGF/β-actin蛋白及mRNA水平顯著低于其他組，但藥物加放療組HepG2細(xì)胞CA-9/β-actin蛋白及mRNA水平顯著高于其他組。結(jié)論：采用放療與中藥“君-佐”相伍的理論對(duì)肝癌細(xì)胞處理后，可能提高細(xì)胞凋亡率及放療增敏效果。

目前早期肝癌的治療仍首選外科手術(shù)，但臨床就診患者多屬中晚期病人，手術(shù)切除率低，即使早期切除，術(shù)后5 年復(fù)發(fā)率也在60%以上[1]。由于肝癌細(xì)胞的輻射抗拒性，使肝癌的放療劑量明顯高于肝臟的耐受，尤其有肝病基礎(chǔ)的中晚期肝癌，又限制了放療劑量，導(dǎo)致對(duì)于肝癌放療效果不理想[2]?！熬?佐”相伍的放療增敏理論是我課題組根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥“君臣佐使”配伍理論設(shè)計(jì)而來(lái)的?！熬甲羰埂崩碚撌侵兴幣湮榈幕A(chǔ)原理，也是祖國(guó)醫(yī)學(xué)臨床組方的基本原則?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》載有“上藥為君，中藥為臣，下藥為佐使，以相宣攝合和……”這主要是關(guān)于藥性分類的論述。因而筆者對(duì)采用該理論對(duì)肝癌細(xì)胞放療增敏效果進(jìn)行分析，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

材料與方法

1 材 料 本組研究中人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)買自ATCC細(xì)胞庫(kù)，黃芩素購(gòu)買自曼斯特有限公司，純度大于99%，絲裂酶原購(gòu)買自浙江海正藥業(yè)，新生胎牛血清及DMEM購(gòu)買自GIBCO公司，MTT、碘化丙啶及二甲基亞砜購(gòu)買自Sigma公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)買自福麥斯有限公司。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：快速將所凍存細(xì)胞于37℃水浴搖床60轉(zhuǎn)/min慢搖復(fù)蘇，復(fù)蘇后800轉(zhuǎn)/min離心5min，吸去上清加入10 ml含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 ml，共10孔，5% CO2溫箱37 ℃培養(yǎng)。將所有細(xì)胞分為五組，即空白對(duì)照組：細(xì)胞+ 培養(yǎng)基、放療組：細(xì)胞+培養(yǎng)基+放療、藥物組：藥物+細(xì)胞+培養(yǎng)基、藥物加放療組：藥物+細(xì)胞+培養(yǎng)基+放療、肝細(xì)胞加藥物組：肝細(xì)胞+藥物+培養(yǎng)基，檢測(cè)各組細(xì)胞克隆形成數(shù)及克隆形成率。

2.2流式細(xì)胞術(shù)：通過(guò)FCM檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，使用AnnexinV-FITC及PI染色雙染分析各組細(xì)胞凋亡率。

2.3 Western Blotting 檢測(cè)蛋白水平：各組細(xì)胞以細(xì)胞裂解液處理后，在冰上裂解靜置30 min，后以BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。后行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，再100 V濕轉(zhuǎn)90 min，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以5% BSA封閉1 h，抗HIF-1α、CA-9、VEGF或β-actin抗體4℃孵育過(guò)夜，后用標(biāo)記二抗孵育1 h，后使用天能凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白水平。

2.4 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)：采用SYBR熒光實(shí)時(shí)定量法對(duì)不同組HepG2細(xì)胞中HIF-1α、CA-9、VEGF或β-actinmRNA進(jìn)行檢測(cè)，采用相對(duì)定量比較CT值基因表達(dá)，采用相對(duì)熒光值對(duì)mRNA相對(duì)表達(dá)量分析。反應(yīng)體系為20 μl，上游及下游引物各1 μl，ddH2O 6 μl，10 μl Power SYBR Green PCR Master Mix，cDNA 2 μl。每個(gè)樣本的RNA含量均根據(jù)各自的β-actin含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究中使用的是SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差及百分率來(lái)計(jì)數(shù)資料，使用方差分析及卡方檢驗(yàn)分析組間數(shù)據(jù)，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞克隆形成 本組研究結(jié)果顯示，藥物加放療組HepG2細(xì)胞克隆形成數(shù)及克隆形成率顯著低于其他組(P<0.05)，當(dāng)仍顯著高于肝細(xì)胞加藥物組(P<0.05)，詳見表1。

表1 細(xì)胞克隆形成結(jié)果(個(gè))

2 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果 研究結(jié)果顯示，藥物加放療組HepG2細(xì)胞凋亡率明顯高于其他組，且差異存統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果(%)

3 蛋白表達(dá)水平結(jié)果 本組研究結(jié)果顯示，藥物加放療組HepG2細(xì)胞HIF-1α/β-actin及VEGF/β-actin蛋白水平顯著低于其他組，但藥物加放療組HepG2細(xì)胞CA-9/β-actin蛋白水平顯著高于其他組，詳見圖1。

4 mRNA表達(dá)水平 本組研究結(jié)果顯示，藥物加放療組HepG2細(xì)胞HIF-1α及VEGF mRNA水平顯著低于其他組，但物加放療組HepG2細(xì)胞CA-9 mRNA水平顯著高于其他組，詳見圖2。

討 論

祖國(guó)醫(yī)學(xué)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐、歷代醫(yī)家論述、總結(jié)，使“君臣佐使”理論日漸完善。目前，有很多學(xué)者越來(lái)越深入的對(duì)“君臣佐使”配伍理論的應(yīng)用進(jìn)行了研究與探討，同時(shí)又有一些新的觀點(diǎn)與“君臣佐使”配伍理論相結(jié)合，也出現(xiàn)了許多新思路和新模式。是否可以用“君臣佐使”的配伍理論指導(dǎo)中藥與西藥之間，甚至中藥與其他治療方法之間的配伍，這也是我們需要思考的。放射線殺死腫瘤細(xì)胞，同時(shí)對(duì)正常組織細(xì)胞也會(huì)引起明顯的副反應(yīng)，通過(guò)其產(chǎn)生的作用與副作用，中醫(yī)思維推斷放射線性專而力猛，具有辛溫、大熱、火毒等性質(zhì)，十分類似于雄黃、砒霜、火硝一類中藥。放療中所產(chǎn)生的抗性以及其副反應(yīng)的弊端，嚴(yán)重影響了其在治療腫瘤過(guò)程中的療效發(fā)揮。因此，放療增敏研究也就顯得尤為重要。而如果將放療比做“君藥”，那么增敏作用就如同“佐藥”的作用。這種“君-佐”配伍的關(guān)系是否能在治療腫瘤中發(fā)揮作用，那就需要我們實(shí)驗(yàn)得出。

放射線根據(jù)中醫(yī)理論應(yīng)類似于辛溫有毒類的藥物，如果把放射線作為“君藥”，與之相伍的“佐藥”清熱解毒類的藥物最為適合，再根據(jù)放療的部位選取相應(yīng)的歸經(jīng)藥物[3]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)已經(jīng)有一些針對(duì)清熱解毒類中藥對(duì)放射增敏的研究，但對(duì)理論基礎(chǔ)及作用機(jī)制的深入研究并不多見[4]。本組研究結(jié)果顯示，采用放療與中藥“君-佐”相伍的理論配合使用對(duì)HepG2干預(yù)后，可顯著降低HepG2細(xì)胞細(xì)胞克隆形成，并提高腫瘤細(xì)胞凋亡率。并可有效提高CA-9蛋白及mRNA水平基礎(chǔ)上降低HIF-1α及VEGF水平。

乏氧誘導(dǎo)因子HIF-1α(Hypoxia-inducible factor-1α)在惡性腫瘤中是關(guān)鍵調(diào)控因子，68%的惡性腫瘤及癌前病變HIF-1α蛋白的表達(dá)均有提高[5]它是腫瘤適應(yīng)缺氧、產(chǎn)生一系列適應(yīng)乏氧行為的中心環(huán)節(jié)。因此，阻斷HIF-1α表達(dá)已成為靶向殺傷乏氧腫瘤細(xì)胞的重要策略[5]。乏氧時(shí)的主要表現(xiàn)為其蛋白降解減少，而穩(wěn)定性增加，最終蛋白表達(dá)水平提高；而給氧后，蛋白降解增加，最終蛋白表達(dá)水平下降[6-7]。在一般情況下，CA-9在正常組織的表達(dá)極少，在缺氧腫瘤中CA-9表達(dá)上升。碳酸酐酶-9(CA-9)是碳酸酐酶的一種，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH值，在缺氧腫瘤中CA-9可大量的表達(dá)[8]。CA-9是乏氧相關(guān)的內(nèi)生蛋白，與腫瘤細(xì)胞乏氧以及微環(huán)境調(diào)整有關(guān)，CA-9高表達(dá)可表明腫瘤組織的乏氧及所屬區(qū)域[9]。這也提示針對(duì)CA-9靶向治療可以調(diào)整組織缺氧微環(huán)境、從而降低腫瘤侵襲性，這可能為腫瘤靶向治療的未來(lái)提供新思路及新方案。

有研究指出，VEGF是人體內(nèi)重要的內(nèi)皮細(xì)胞特異性分裂劑，其也是重要的誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生的新生血管因子[10]。一般情況下，癌基因、細(xì)胞因子、缺氧及抑癌基因產(chǎn)物等多種因素均可有效調(diào)控VEGF[11]。有研究結(jié)果表明，VEGF增強(qiáng)子內(nèi)含可與HIF-1α結(jié)合的HRE，一方面增強(qiáng)子結(jié)合后可增強(qiáng)蛋白水平表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)血管生成量，使血液達(dá)缺氧部位。此外，HIF-1可在缺氧情況下有效增強(qiáng)VEGF mRNA穩(wěn)定性[12-13]。且VEGF在促進(jìn)腫瘤血管生成因素中，起到最關(guān)鍵、最基礎(chǔ)作用。

綜上所述，采用放療與中藥“君-佐”相伍的理論對(duì)肝癌細(xì)胞處理后，可有效降低細(xì)胞干性，提高細(xì)胞凋亡率，并通過(guò)調(diào)控HIF-1α、VEGF、CA-9表達(dá)水平，提高肝癌細(xì)胞放療增敏效果。但其具體作用靶點(diǎn)及基因調(diào)控過(guò)程還有待于后續(xù)深入研究。

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RadiotherapyandtraditionalChinesemedicine“JunZuo”theorywereappliedtoenhancethesensitivityoflivercancercellstoradiotherapy

An Peng，Li Xingyao，Cai Zimo,et al.

Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University(Xi’an 710004)

Objective:Analyze the sensitization effect of radiotherapy and traditional Chinese medicine “Jun Zuo” theory on liver cancer cells, and to provide basis for clinical application.Methods:HepG2 cells were divided into five group were assayed by colony formation and clone formation rate, apoptosis rate was detected, and the analysis of protein and mRNA levels of HIF-1, CA-9, VEGF alpha or beta-actin.Results:The drug plus radiotherapy group HepG2 cell colony formation and clone formation rate was significantly lower than that of other groups (P<0.05); drug plus radiotherapy group the apoptosis rate of HepG2 cells was significantly higher than other groups, and the difference was statistical significance (P<0.05); drug plus radiotherapy group HepG2 cells HIF-1 alpha beta -actin and VEGF/ beta / -actin protein and mRNA levels were significantly lower than other groups, but the content of HepG2 cells plus radiotherapy group CA-9/ beta -actin protein and mRNA levels were significantly higher than that in other groups.Conclusions:The use of radiotherapy and Chinese medicine “Jun Zuo” theory for treating liver cells, can effectively reduce the dry cell, improve the rate of cell apoptosis, and the expression level through the regulation of HIF-1 alpha and VEGF and CA-9, to improve the radiation sensitizing effect of hepatocellular carcinoma cells.

*陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013KW-26-03) 陜西省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(JC38)

肝腫瘤/中醫(yī)藥療法 放射療法 @中藥“君-佐”相伍的理論 輻射增敏藥

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.11.058

KeywordsLiver neoplasms/ traditional Chinese medicine therapy Radiotherapy @Traditional Chinese medicine“ Jun Zuo” Radiation-sensitizing agents

(收稿：2017-06-22)